一種提高菸葉含油量的方法

2023-05-07 07:41:31 2

專利名稱：一種提高菸葉含油量的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高菸葉含油量的方法。
背景技術：
菸草是重要的葉用經濟作物，目前只發現一例通過基因技術提高菸葉含油量的方法美國Thomas Jefferson大學的Andrianov等人在菸草中分別用rbcS和Alc啟動子表達擬南芥的 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)和 LEC2 (LEAFY COTYLEDON 2)基因，將菸葉單位乾重含油量提高到5. 8-6. 8%，比改造前材料的含油量提高了約5個百分點 (Andrianov V et al. , Plant Biotechnology Journal, 2010,8 :277-287)。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提高菸葉含油量的方法，該方法能提高菸葉的含油量。為了實現上述目的，本發明所採取的技術方案是一種提高菸葉含油量的方法，其特徵在於它包括如下步驟1)、菸草rbcS啟動子的克隆及序列分析以菸草基因組DNA為模板進行PCR擴增，經1 % (質量)的瓊脂糖凝膠電泳顯示， 從菸草基因組DNA擴增出IOOObp的單帶；將此特異條帶回收，連接到克隆載體PMD-18T vector,導入宿主菌E. coli菌株DH5 α後，挑單菌落搖菌，經篩選的重組子pMD-18T_rbcS 的PCR擴增及酶切結果顯示，均出現目的條帶，說明擴增片段已成功連接於pMD-18T中；測序結果顯示擴增片段長度為979bp，序列分析表明，該序列為rbcS啟動子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其點突變①SLCl基因編碼區的克隆從武漢大學菌種保藏中心取得酵母菌種，該酵母菌種的編號AY92007 = AS2. 159，來源中科院微生物所，用YM培養基在培養過夜，回收培養物，抽提其基因組 DNA作為PCR擴增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120為SLCl的5， 編碼引物5』 -TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 為 SLCl 的 3，編碼引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3，，進行 PCR 擴增，擴增條件為94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培養基成分
酵母抽提物3g，
麥芽糖3g，
Peptone5g,
瓊脂20g,
雙蒸水1000ml; 25 μ 1 PCR 擴增產物中加入 2U Taq 酶和 1 μ 1 2. 5mM dATP 於 72°C加 A 20min,克隆插入pMDIS-T載體，轉化DH5 α塗於Amp平板；用通用引物Ml3+和Ml3-進行篩選，程序均為 94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 40cycles ；72°C延伸 5min ；為了驗證插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121進行驗證，隨機挑取正向和反向插入的兩個克隆進行單向測序，結果發現1個克隆其序列與SLCl基因序列僅有1個核苷酸的差異，很可能本身就是一個基因組變異；所以必須突變1個位點，才能得到與突變型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因點突變後獲得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA 聚合酶和引物 120/126,121/127 和 120/121 分別在 25 μ 1 體系中PCR擴增上述SLCl基因的5』片段、3，片段和全長序列，PCR程序為94°C 2min ； 94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 為 SLCl 的 5，突變引物:5，-CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 為 SLCl 的 3，突變引物5， -TTGGCCTTGACGTCAAGGTCGTTGGCG-3』 ；將SLCl基因的5，片段、3，片段和全長序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50μ1 體系中進行 PCR 擴增，PCR 程序為 94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ；PCR體系組成如下
IOXbuffer5ul,
dNTP4ul,
Pyrobest0.25ul,
雙蒸水25.75ul，
5，PCR 產物5ul,
3，PCR 產物5ul，
100 X稀釋全長PCR產物 5ul;電泳分離Pyrobest擴增體系中的全長PCR產物，切膠回收並測序；測序表明其中一個克隆(SLC-3-31)成功完成了 1個目標胺基酸位點的突變；用BamHI和McI從 SLC-3-31切下目的片段並插入PBI121載體，即獲得了點突變後的SLCl-I基因；3)、目的表達載體rbcS =SLCl-I的構建用HindIII和Xba I限制性內切酶雙酶切質粒!35S :pBI121、;35S :SLC1_1和 pMD-18T-rbcS，完畢後分別回收酶切載體大片段和啟動子序列片段產物，將酶切載體大片段和啟動子序列片段產物按照4 1的質量比例混合，在T4DNA Iigase作用下於16°C溫育 12h以上，將連接產物導入宿主菌Ε. coli DH5 α，通過PCR鑑定和酶切鑑定顯示，得到植物表達載體 rbcS :pBI121 和 rbcS =SLCl-I ；4)、菸草轉基因體系的建立及陽性苗的PCR檢測將目的表達載體rbcS =SLCl-I轉化農桿菌LBA4404，得到含有目的表達載體rbcS SLCl-I的農桿菌；取菸草幼嫩的無菌葉片，用打孔器製取葉盤，並用含有目的表達載體 rbcS =SLCl-I農桿菌進行侵染；將葉盤直接放置菸草葉盤預、共培養基MSl上，在弱光下預培養和共培養3-4天後；共培養3-4天後將葉盤轉移到篩選培養基MS2上進行篩選培養，每隔2-3周進行一次繼代培養；待出現Icm小芽時將小芽切下放置菸草生根培養基MS3上進行生根培養，待苗子生長稍大一點可提取DNA進行PCR檢測；
菸草轉基因採用農桿菌浸染法轉化，農桿菌介導的菸草葉盤轉化法參照 Agrobacterium protocols I ；用附加AS的基本培養基MS0重懸菌液，OD值達到0. 5-1. 0， 侵染經過預培養或未經預培養的菸草葉盤，侵染20-30分鐘，弱光下共培養3天，含IOOmg/ L卡那、400mg/L羧苄培養基篩選，每兩周更換一次新鮮培養基，直至抗性芽長至Icm時移入菸草生根培養基MS3，附加75mg/L卡那篩選；長勢健壯的植株採用NPTII進行PCR檢測；將小芽移植，生長至成熟，得到Ttl代菸草轉基因植株。所述基本培養基MStl 大量元素+微量元素+有機成分+鐵鹽成分+3%蔗糖+0. 7% 瓊脂；所述菸草葉盤預、共培養基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ；所述蹄選培養基MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ；所述菸草生根培養基MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
大量元素NH4NO31650mg/L,KNO31900mg/L,CaCl2 · 2H20440mg/L,MgS04 · 7H20370mg/L,KH2PO41700mg/L；微量元素KI0. 83mg/L,H3BO36.2mg/L,MnSO4 · 4H2022.3mg/L,ZnSO4 · 7H208.6mg/L，Na2MoO4 · 2H200.25mg/L，CuSO4 · 5H200.025mg/L,CoCl2 · 6H200. 025mg/L；鐵鹽成分FeSO4 · 7H2027.8mg/L,Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L；有機成分:肌醇100mg/L，煙酸0. 5mg/L,鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg/L,鹽酸硫胺素(VB1)0. 5mg/L,甘氨酸2mg/L。 本發明的有益效果是該方法能提高菸葉的含油量。挑選轉基因T2代轉基因植株中拷貝數較低且RT-PCR結果較好的樣品，取全株葉片研磨混勻編號，進行粗脂肪的測定， 樣品slc5的粗脂肪含量較ck的粗脂肪含量高了 5. 9個百分點。


圖1 rbcS啟動子PCR擴增產物電泳圖，1 DL2000marker ；2陰性對照；3PCR產物。圖2是pMD-18T-rbcS為模板的PCR產物電泳圖，1 DL2000Marker ；2陰性對照；3-5 為PCR產物。圖3是pMD-18T-rbcS酶切產物電泳圖，1 Hind III和Xba I酶切產物；2 DGL2000 markerο圖4是克隆到的rbcS啟動子片段序列圖(用於與已報導序列(GenBank :X02353) 比對結果)。圖 5 是質粒;35S :SLC1_1 酶切鑑定圖，IDL 2000marker ；2 BamH I 和 Sac I 雙酶切。圖6克隆到的SLCl-I片段序列圖[用於與已報導序列SLCl (GenBank :Z74100. 1)
比對結果]。圖 7rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 陽性克隆 PCR 檢測電泳圖，lDGL2000Marker ；2 陰性對照；3-21 PCR產物。圖 8rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 質粒酶切電泳圖，lDL2000Marker ；2 質粒 rbcS pBI121Hind III和 Xba I 酶切產物；3 質粒 rbcS =SLCl-I Hind III和 Xba I 酶切產物。圖 9 是 rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 載體圖譜，LB、RB 為左右邊界；NOSp,NOSt 為 NOS啟動子和終止子；nptll 為卡那抗性篩選基因；rbcS 為菸草葉部組織特異性啟動子 rbcS ；Hindi 11 ,XbaI, BamHI, SacI 為限制性內切酶酶切位點；⑶S為報告基因。圖10是菸草遺傳轉化過程圖，a切苗，b預培養，c共培養，d篩選，e生根，f移栽。圖11轉基因菸草的PCR檢測電泳圖，1 DL2000Marker ；2-21 PCR產物；22空白對照；23陰性對照；24陽性質粒。圖12轉基因菸草的PCR電泳圖，1 DL2000Marker ；2陰性對照；3陽性質粒； 4-13PCR 產物。圖13對照、轉rbcs :pBI121、轉35S :pBI121植株的不同部位⑶S活性的組織化學染色圖，圖中A1、A2、A3分別為未轉基因植株(陰性對照)的根、莖、葉進行GUS染色後體式解剖鏡觀察圖；B1、B2、B3分別為轉rbcS :pBI121的菸草根、莖、葉進行⑶S染色後經體式解剖顯微鏡觀察圖；C1、C2、C3分別為轉35S :pBI121的菸草根、莖、葉進行⑶S染色後體式解剖顯微鏡觀察圖。圖14利用RT-PCR技術分析菸草葉片SLCl-I基因的表達量圖。
具體實施例方式為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限於下面的實施例。一、英文縮略詞CaMV35S 椰菜花葉病毒啟動子⑶S β -葡糖醛酸酶NPTII 氨基糖苷-3'-磷酸轉移酶(卡那黴素抗性)rbcS 核酮糖-1，5- 二磷酸加氧酶/羧化酶小亞基SLC 基因編碼酵母 sn-2 Acyltransferase 的基因IPCR 反向 PCR
TaiL-PCR 熱不對稱交錯PCRCTAB 十六烷基三甲基溴化銨6-BA 6-苄氨基嘌呤NAA: α-萘乙酸Car 羧苄青黴素Rif 利福平Amp 氨苄青黴素DEPC 焦碳酸二乙脂X-gluc 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷。二、實驗材料1. 1載體及菌株E. coli 菌株 DH5a、農桿菌 LBA4404、植物表達載體!35S :pBI12U35S =SLCl-I 由中國農科院油料作物研究所提供。1. 2DNA純化回收試劑盒為i^ermentas產品，質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，PMD-18T vector、T4DNA 連接酶、Hind III Jba I、BamH I.Sac I、 Taq I和Mst I限制性內切酶購於Takara、Promega公司。1. 3培養基MS培養基配方
權利要求
1. 一種提高菸葉含油量的方法，其特徵在於它包括如下步驟1)、菸草rbcS啟動子的克隆及序列分析以菸草基因組DNA為模板進行PCR擴增，經1 % (質量)的瓊脂糖凝膠電泳顯示，從菸草基因組DNA擴增出IOOObp的單帶；將此特異條帶回收，連接到克隆載體pMD-18T vector, 導入宿主菌Ε. coli菌株DH5a後，挑單菌落搖菌，經篩選的重組子pMD-18T_rbcS的PCR擴增及酶切結果顯示，均出現目的條帶，說明擴增片段已成功連接於PMD-18T中；測序結果顯示擴增片段長度為979bp，序列分析表明，該序列為rbcS啟動子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其點突變①SLCl基因編碼區的克隆從武漢大學菌種保藏中心取得酵母菌種，該酵母菌種的編號AY92007 = AS2. 159，來源中科院微生物所，用YM培養基在培養過夜，回收培養物，抽提其基因組DNA作為 PCR擴增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120為SLCl的5，編碼引物5，-TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 為 SLCl 的 3，編碼引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3』，進行 PCR 擴增，擴增條件為 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培養基成分 酵母抽提物 3g麥芽糖 3g Peptone5g 瓊脂 20g雙蒸水 1000ml 、25 μ 1 PCR擴增產物中加入2U Taq酶和1 μ 1 2. 5mM dATP於72°C加A 20min,克隆插入pMD18-T載體，轉化DH5 α塗於Amp平板；用通用引物Μ13+和Μ13-進行篩選，程序均為 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin,40cycles ；72°C延伸 5min ；為了驗證插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121進行驗證，隨機挑取正向和反向插入的兩個克隆進行單向測序，結果發現1個克隆其序列與SLCl基因序列僅有1個核苷酸的差異， 很可能本身就是一個基因組變異；所以必須突變1個位點，才能得到與突變型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因點突變後獲得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA聚合酶和引物120/126、121/127和120/121分別在25 μ 1體系中 PCR擴增上述SLCl基因的5』片段、3』片段和全長序列，PCR程序為94°C 2min ；94°C 30sec, 50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 為 SLCl 的 5，突變引物:5，_ CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 為 SLCl 的 3，突變引物5，-TTGGCCTTGA CGTCAAGGTCGTTGGCG-3『；將SLCl基因的5，片段、3，片段和全長序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50 μ 1體系中進行 PCR擴增，PCR程序為 94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ； PCR體系組成如下
2.根據權利要求1所述的一種提高菸葉含油量的方法，其特徵在於所述基本培養基 MS0 大量元素+微量元素+有機成分+鐵鹽成分+3%蔗糖+0. 7%瓊脂； 所述菸草葉盤預、共培養基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ； 所述篩選培養基 MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ； 所述菸草生根培養基 MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
全文摘要
本發明涉及一種提高菸葉含油量的方法。一種提高菸葉含油量的方法，其特徵在於它包括如下步驟1)菸草rbcS啟動子的克隆及序列分析；2)SLC1-1基因的克隆及其點突變，獲得了點突變後的SLC1-1基因；3)目的表達載體rbcSSLC1-1的構建，得到植物表達載體rbcSpBI121和rbcSSLC1-1；4)菸草轉基因體系的建立及陽性苗的PCR檢測將葉盤直接放置菸草葉盤預、共培養基MS1上，共培養3-4天後將葉盤轉移到篩選培養基MS2上進行篩選培養，每隔2-3周進行一次繼代培養；待出現1cm小芽時將小芽切下放置菸草生根培養基MS3上進行生根培養，待苗子生長稍大一點可提取DNA進行PCR檢測；將小芽移植，生長至成熟，得到T0代菸草轉基因植株。該方法能提高菸葉的含油量。
文檔編號C12N15/84GK102229948SQ20111011786
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月9日 優先權日2011年5月9日
發明者江木蘭, 閆曉紅, 魏文輝 申請人:中國農業科學院油料作物研究所