用於從體液分離細胞的系統和方法

2023-05-07 14:31:31

專利名稱：用於從體液分離細胞的系統和方法
用於從體液分離細胞的系統和方法
背景技術：
總的來講，本發明涉及用於將複雜的生物材料加工成亞成分的系統、方法和試劑
品.ο在分析或治療性應用量不太大的細胞(例如白細胞或幹細胞)前，通常需要從全血中分離出紅細胞(RBC)。許多常規血細胞分離方法需要初步除去紅細胞並減少樣品體積。 對於長期細胞存庫和再生醫學應用，通常需要加工步驟，其中由於貯存限制和/或直接移植所需體積要求小，因此需要以減小的體積，稀有細胞的產量最高。目前，用於加工含血細胞樣品(例如臍帶血、骨髓、外周血)最常見的技術包括在使用或不使用密度梯度介質的情況下用離心法提高分離的密度梯度沉降法。最近，為了滿足對高通量樣品加工的不斷增加的需要，開發出了用於封閉系統加工臍帶血和骨髓樣品的自動離心系統。雖然與手工技術相比通量大大提高，但是由於離心機桶的重量和固定的外形尺寸，限制了基於離心的裝置的靈活性和輕便性。在許多血細胞分離應用中還採用過濾技術。例如，有時採用深層過濾以從全血中除去白細胞(例如輸血應用)。然而，這些過濾器被設計成排除最多的白細胞(通過將細胞截留在過濾器內)，並沒有設計成在過濾步驟後有高的細胞回收率。另外，基於膜的血漿除去法是從全血除去和加工血漿的常見技術。然而，這些技術不包括在過濾前預先清除全血紅細胞(RBC)，並且在血細胞存庫應用中無法實現需要的體積減少的類型。本領域已知通過重力或離心分離血液不同組分的沉降方法。一種促進RBC從全血沉降的方法是使用聚合物大分子，例如作為已知的RBC聚集劑的葡聚糖、羥乙基澱粉或明膠。根據血液中聚集劑的組成成分和化學計量比，RBC沉降方法的速度和效率可大幅變化。 一些沉降增強劑是已知的，例如草酸鉀和丙二酸鉀。這些沉降增強劑的效率很大程度上取決於沉降增強劑相對於血液樣品的濃度。雖然以前曾證實草酸鉀和丙二酸鉀是有效的RBC 沉降增強劑，但是這些沉降增強劑的臨床用途受到與鉀鹽相關的潛在心血管毒性的限制。發明概述本發明適於滿足對加工生物材料(例如全血)的功能性封閉系統高通量系統和方法的需要，同時獲得高回收率和成活率的目標細胞(例如幹細胞)用於下遊細胞治療應用。 過濾是血液加工應用(包括血液透析和血漿除去法)的常用技術，但是以前未曾用於血細胞存庫應用，其中需要加工生物材料(例如全血)，以便除去紅細胞和過量血漿，得到濃縮的白細胞(WBC)樣品。這起因於與將大量的紅細胞與較少的白細胞和類似大小甚至更少的幹細胞相分離有關的挑戰。所述系統和方法的一個實施方案包括兩步方法，涉及用於除去大量紅細胞的初始RBC聚集和重力沉降步驟，然後是濃縮細胞並除去過量血漿的過濾步馬聚ο用於加工生物材料的封閉系統的一個實施方案包括裝有生物材料並能夠將生物材料分成兩種或更多種不同的子材料(submaterial)的容器；提取裝置，該提取裝置用於從容器中去除至少一種子材料；過濾裝置；在容器與過濾裝置之間轉運一種或多種子材料的管道；以及在容器與過濾裝置之間通過管道至少轉運一種或多種子材料的控制裝置。該系統可包括用於至少暫時貯存一種或多種濾液的一個或多個貯器，其中至少一個貯器為廢濾液貯器，至少一個貯器為目標保留物貯器。該系統還可包括沿著管道的閥，用於將目標保留物選擇性引入目標保留物貯器；以及沿著管道用於使廢濾液至少部分通過管道進行選擇性再循環的閥。還可將與管道保持液體連通的泵加入該系統，以促進容器與過濾裝置之間一種或多種子材料的轉運。所述系統的容器可適宜至少部分根據兩種或更多種子材料的相對重量將材料分離成子材料。可將子材料分離成沉降層，其中提取裝置適於抽出或者提取一個或多個沉降層。在一個實施方案中，提取裝置適於抽出容器中的最低層，而在另一個實施方案中，提取裝置可或者或另外抽出容器中的最上層，或者最低層與最上層之間的一層或多層。所述系統還可包括與試劑貯器流體連通的閥，以選擇性地從試劑貯器取出確定量的試劑並引入容器中的確定量的試劑。該實例中的提取裝置還另可適於將容器中的確定量的材料抽到之前已引入提取裝置中的試劑中，然後將抽取的材料輸送回容器中，以利於將材料與試劑混合。所述系統還可包括用於測定容器中至少一種子材料的位置或水平的傳感
直O整個系統或者例如在容器與過濾裝置之間運送一種或多種子材料的一部分系統可以是自動化的。用於加工生物材料的方法的實例一般包括向容器中提供生物材料；將聚集劑加入容器內的材料中，並使材料分成兩種或更多種不同的子材料；從容器中提取一種或多種子材料；將餘留在容器中的一種或多種子材料通過管道自動轉運到過濾裝置中；並將所得到的目標保留物引入目標保留物貯器中。所述方法的一個實例包括加工血液樣品，用於隨後的冷凍保存和/或直接的治療應用，例如減少樣品體積，實現高的有核細胞回收率和成活率，並除去存在於起始樣品中的大多數紅細胞。所述方法的一個實例使得能夠分離白細胞(WBC)流分，該流分包括得自全臍帶血、骨髓或外周血(包括GCSF刺激的外周血)的多能幹細胞。本發明方法的至少一個實例能夠實現高的白細胞回收率(> 80% )、> 95% CD34回收率和高的白細胞成活率(> 95% )，同時根據過濾時間和所用過濾筒的調整，在處理寬範圍的起始體積和樣品類型中提供靈活性。與現有方法不同，本發明的方法和系統能夠自動加工複雜的生物液體而無需用戶購買和使用單獨的離心機。本發明的方法和系統還容易的適於處理一定範圍的起始體積以將樣品濃縮成用戶指定的最終體積，並可用於多路復用方法(例如增加/降低加工/運行的樣品數)。總的來講，本發明的方法和試劑盒提供具有生物相容性並顯著提高血液分離方法的效率的沉降增強劑和系統，從而提高總有核細胞(TNC)回收率。認為在規定的濃度範圍內，體內使用這些沉降增強劑是無毒和安全的。含有血細胞的樣品的細胞沉澱方法的一個或多個實例包括加入聚集劑和終濃度為約IOmM-約IOOmM的無毒增強劑。所提供的含有血細胞的樣品的細胞沉澱方法的一些實例包括加入聚集劑和包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合的無毒增強劑。
在細胞沉澱試劑盒的一些實施方案中，試劑盒包括聚集劑和無毒增強劑，其中無毒增強劑包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。在細胞沉澱試劑盒的一些實施方案中，試劑盒包括聚集劑和無毒增強劑，其中所述聚集劑選自葡聚糖、羥乙基澱粉或明膠，其中所述無毒增強劑包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。細胞沉澱方法的一些實施方案提高含紅細胞樣品中提高百分比的總有核細胞的所得回收率，其中所述方法包括以下步驟加入聚集劑、無毒增強劑，溫育樣品以聚集大量 RBC，並回收總有核細胞。附圖參照附圖閱讀下面的詳細說明書時，可以更好地理解本發明的這些和其它特徵、 方面和優勢，附圖中類似字符表示整個附圖中的類似部件，其中

圖1是本發明系統的一個實施方案的示意圖，顯示分別在混合容器和試劑貯器中的生物樣品和RBC聚集劑(含或不含增強劑)。圖2是圖1所示實施方案的示意圖，顯示吸入提取裝置的聚集劑(含或不含增強劑)。圖3是圖2所示實施方案的示意圖，顯示聚集劑(含或不含增強劑)混合進入容器內的生物樣品中。圖4是圖3所示實施方案的示意圖，顯示吸入提取裝置的部分試劑/樣品混合物。圖5是圖4所示實施方案的示意圖，顯示將吸入部分輸送回到容器中。圖6是圖5所示實施方案的示意圖，顯示混合物呈沉澱狀態。圖7是圖6所示實施方案的示意圖，顯示將沉澱混合物的最低層吸入提取裝置。圖8是圖7所示實施方案的示意圖，顯示提取裝置與容器之間處於關閉位置的注射器閥。圖9是圖8所示實施方案的示意圖，顯示容器與泵之間處於打開位置的泵閥，且混合物流經系統從容器通過管道直到過濾裝置。圖10是圖9所示實施方案的示意圖，顯示廢濾液貯器中收集的過濾廢液和通過系統再循環的樣品。圖11是圖10所示實施方案的示意圖，顯示相對於容器處於關閉位置且相對於廢濾液貯器處於打開位置的泵輸入閥，以及通過管道和過濾裝置再循環的廢濾液。圖12是圖11所示實施方案的示意圖，顯示廢濾液通過系統泵送直到置換截留在液體通路中的目標保留物。圖13是圖12所示實施方案的示意圖，顯示相對於廢濾液貯器處於關閉位置且相對於容器處於打開位置的泵輸入閥，以及在泵與目標保留物貯器之間處於打開位置的泵輸出閥。圖14是圖13所示實施方案的示意圖，顯示正在目標保留物貯器中收集的目標保留物。圖15是圖14所示實施方案的示意圖，顯示容器底部的目標保留物剩餘量正轉運到目標保留物貯器中。圖16是圖15所示實施方案的示意圖，顯示在容器與目標保留物貯器之間的管道中目標保留物的殘留量。圖17是圖16所示實施方案的示意圖，顯示相對於廢濾液貯器處於打開位置的泵輸入閥。圖18是圖17所示實施方案的示意圖，顯示廢濾液正通過管道轉運直到廢濾液將管道中的殘留目標保留物推進目標保留物貯器中。圖19是圖18所示實施方案的示意圖，顯示相對於目標保留物貯器處於關閉位置的泵輸出閥，廢濾液正轉運到容器中。圖20是圖19所示實施方案的示意圖，顯示系統中的廢濾液和任何餘留的目標保留物正被收集在輔助濾液貯器中。圖21為柱狀圖和表格，顯示僅葡聚糖、與檸檬酸鈉組合的葡聚糖和與琥珀酸鈉組合的葡聚糖的回收TNC的體積的實例。圖22圖示檸檬酸鈉沉降效率的實例。發明詳述為了更清楚且明確地描述和指出本發明要求保護的主題，下面提供特定術語的定義，其用於下面的說明書和隨附權利要求書中。在整個說明書中，特定術語的示例應視為非限制性實例。本文使用的術語「容器」是指任何物體，該物體具有至少一個口，能夠在其範圍內裝放液體為期至少短暫的一段時間。本文使用的術語「生物材料」是指任何材料，該材料具有可聚集成兩種或更多種子材料的生物性質。生物材料的非限制性實例為全血、臍帶血和骨髓，這些材料可通過聚集和沉降/除去RBC分離，同時將有核細胞保留在血漿溶液中。有核細胞包括WBC和稀有幹細胞。有核細胞的加工方法的一個實施方案通常包括從細胞樣品(包括但不限於血液和骨髓)分離和富集有核細胞，例如但不限於稀有幹細胞。基於過濾的實施方案包括兩個通用步驟。第一步包括使細胞樣品與沉澱溶液接觸，沉澱溶液例如加入或不加入增強劑 (例如檸檬酸鈉、琥珀酸鈉)的紅細胞聚集劑(例如葡聚糖)。在該示例性實施方案中，加入增強劑以提高RBC沉降速率和/或減少沉降後最終的RBC壓實體積。隨後，通過引流、抽出或其它合適的轉移方法，從含有血漿和有核細胞的上層部分除去聚集的RBC。第二步包括通過過濾排除RBC的樣品來減小體積並濃縮有核細胞。過濾的一個實例採用中空纖維濾筒 (General Electric Healthcare，Piscataway，NJ)。該實施方案提供高的細胞回收率(例如最少細胞截留)、最小細胞損壞和快速的加工時間。所述方法的這個實例適用於自動封閉系統。所述方法和系統可適於無菌加工複雜的生物材料，例如但不限於臍帶血和其它細胞樣品材料。鍾聯合分離之後過濾，而不僅僅單是過濾、離心或磁性分離的兩步驟自動實例方法， 提供(1)總有核細胞(TNC)回收率提高，(2)RBC去除增加，和(3)因為離心機樣品支架的固定外形尺寸，所以與離心相比，在處理一定範圍的樣品體積(例如50-300mL血液)時具有更大的靈活性。與具有固定尺寸的離心機不同，可根據樣品體積調節用於該系統和方法的過濾器。
確定起始材料的體積(例如通過重量、目測)。根據合乎要求的化學計量比(通常血液比葡聚糖為1 1或1 2)，計算出所需要的RBC聚集試劑的量。將細胞樣品起始材料轉移到加工容器中。也將RBC聚集試劑轉移到加工容器中。 然後將樣品和試劑混合，使之溫育約20分鐘用於RBC聚集和重力沉降。然後，從容器中從上部白細胞(WBC)/血漿部分中提取聚集物RBC部分(例如通過泵送、吸取或引流)。然後將剩餘的WBC/血漿部分轉移(例如通過泵送、正壓或負壓)到具有合適孔徑大小(例如孔隙約0. 65um)的過濾裝置(例如中空纖維筒)中。使過量血漿通過過濾裝置，在廢濾液貯器中收集，同時保留WBC。使流分樣品通過過濾裝置再循環直到將樣品體積濃縮到所需要要的最終體積 (例如5-20ml)。將樣品轉移到目標保留物貯器中，通常用於長期冷凍貯存。然後，衝洗(通常使用血漿和/或空氣)過濾器和管道以回收存在於該「死體積」中的細胞。然後將該材料加入濃縮樣品中。實現了高的總有核細胞回收率(> 85% )和成活率(> 95% )。圖1是所述系統的一個實施方案的示意圖，顯示分別在混合容器和試劑貯器中的生物樣品和增強劑。在圖1中顯示且統稱為系統10的系統的實施方案包括容器12，該容器12裝有生物材料並能夠將生物材料分離成兩種或更多種不同的子材料；用於從容器中提取至少一種子材料的提取裝置16 ；過濾裝置20 ；在容器與過濾裝置之間轉運一種或多種子材料的管道18 ；以及控制通過管道在容器與過濾裝置之間至少轉運一種或多種子材料的控制裝置30。該實施方案只是所述系統的示例性配置。對於給定設置，組件的數目和類型可按需變化，通過系統的材料的順序和流量也可按需變化。例如，可以採用不同的配置和組件提取、貯存、清洗和混合材料。在圖1所示實施方案中，容器12在頂部有開口，在整個過程的不同時間內通過該開口引入試劑，以及從容器12抽取材料和子材料，提取裝置在本實例中為與閥34處於流體連通的注射器。系統10還包括至少暫時貯存一種或多種濾液的貯器。該實施方案中的一個貯器為廢濾液貯器22和目標保留物貯器24。系統10還包括沿著管道將目標保留物選擇性引入目標保留物貯器的閥30 ；沿著管道使廢濾液至少部分通過該管道進行選擇性再循環的閥觀；以及選擇性將一種或多種試劑引入容器12、從容器12中提取材料使試劑與樣品混合以及在子材料聚集後從容器12中提取一種或多種子材料的閥34。系統10還可包括一個或多個傳感器，例如傳感器32。傳感器32可用於檢測容器 12中材料的一個或多個參數，包括但不限於容器內給定位置中子材料的存在；容器內的環境條件，例如但不限於溫度、PH、溼度和壓力；以及生物材料或子材料的質量或性質。傳感器可以是但不限於光學傳感器、超聲傳感器、壓電傳感器、運動傳感器、RFID傳感器、電磁傳感器和載荷傳感器。系統10還包括控制子系統30 (本文亦稱控制器)，控制子系統30使泵沈、提取裝置16和閥觀、34和30自動化並協調工作。還可對控制子系統30進行配置以接收系統用戶的輸入，並根據引入容器12待應用該系統加工的材料的量和類型，自動確定待加入容器 12中的試劑的量和/或類型。根據給定系統的配置，通過控制子系統可使該系統全自動化或部分自動化。根據待加工的材料和子材料的類型或量，可將試劑裝入按需插入系統口的可移動貯盒內。
系統10還包括與管道處於流體連通的泵沈以促進一種或多種子材料在系統不同組件之間的轉運。該實施方案的泵26為蠕動泵，但是可包括任何適於該系統配置的任何類型的泵。可至少部分根據兩種或更多種子材料的相對重量，使系統的容器12適於將材料分離成為聚集的子材料。將子材料分離成沉降層，且在該實施方案中，使提取裝置適於抽出或者抽取一個或多個沉降層。在圖1所示實施方案中，提取裝置16包括遠端朝向容器12 底部放置的收集線(pick up line)，一旦將子材料分成其相應的沉降層，便抽出容器中的最低層。或者或另外，提取裝置可抽出容器內的最上層或者最低層與最上層之間的一層或多層，這取決於提取裝置相對於容器的配置。如圖2和圖3所示，注射器16連同與試劑貯器14處於流體連通的閥34 —起，從試劑貯器中選擇性取出確定量的試劑，並將確定量的試劑引入容器12中。如圖4和圖5所示，還可以使該實例中的提取裝置進一步適於從容器中將確定量的材料抽入試劑之前已引入其中的提取裝置中，然後將抽取的材料輸送回到容器中，以促進材料與試劑的混合。為了進行混合步驟，相對於貯器14關閉且相對於容器12打開的閥34開啟注射器16與容器12 之間的流體連通。一旦聚集劑與容器12中的材料(例如全血)混合，混合物通常需要時間沉澱成為其不同的沉降層。對於與例如葡聚糖和檸檬酸鈉混合的全血或臍帶血，沉澱應發生在20分鐘內，如圖6所示。可以使用檢測裝置(例如傳感器32)，通過測定容器中至少一種子材料的位置或水平，來測定子材料何時聚集並分離成其相應層。用於本實例(其中將加工全血)的可能試劑的非限制性實例為葡聚糖(一種聚集劑)及均可促進聚集的檸檬酸鈉和琥珀酸鈉。這3種試劑的實例通過起聚集劑和/或聚集增強劑的作用來啟動並加快生物樣品中不同類型的子材料(例如WBC和RBC)的聚集和沉降，從而促進所述方法和系統。圖7是圖6所示實施方案的示意圖，顯示吸入注射器16的沉澱混合物的最低層。 可將系統配置成提取一層或多層，例如圖7所示RBC，直到一層或多層達到預定的設定點。 可以使用傳感器32測定何時達到設定點。一旦將RBC抽入注射器16，就關閉注射器16與容器12之間的閥34來防止RBC漏回容器中。圖8是圖7所示實施方案的示意圖，顯示提取裝置與容器之間的閥34處於關閉位置。圖9是圖8所示實施方案的示意圖，顯示容器與泵沈之間的泵閥觀處於打開位置，混合物流經系統從容器12經由管道18流到過濾裝置20中。當混合物通過過濾裝置20 過濾時，在廢濾液貯器22中收集過濾廢液(在本實例中為血漿)，如圖10所示。可對系統進行配置以使通過過濾裝置20的樣品繼續再循環，直到通過容器12再循環的樣品體積達到預定水平。例如，可以使用傳感器對容器12中總有核細胞(TNC)的濃度水平進行光學監測。為了使過濾裝置16清潔，關閉相對於容器的泵輸入閥觀且打開相對於廢濾液貯器22的泵輸入閥觀，使廢濾液(本實例中為血漿)通過管道18和過濾裝置20再循環(圖 11)。圖12是圖11所示系統10的示意圖，顯示廢濾液通過系統泵送直到置換截留在液體通路中的目標保留物(例如TNC)。目標保留物包括欲從生物材料中分離並收集於目標保留物貯器M的一種或多種子材料。在本實例中，目標保留物包括TNC。目標保留物貯器可以是適於給定目的的任何貯器，例如用於各種血液組分的收集袋。根據待加工的材料，可能有多個廢棄物貯器和目標保留物貯器。或者，或除多個貯器以外，廢棄物貯器和目標保留物貯器可能在一次加工與另一次加工中彼此互換，甚至在有不只一種子材料需要收集的單一加工時段內彼此互換。所述系統還可包括一系列的過濾裝置及廢棄物貯器和目標保留物貯器，以捕獲和分撿給定起始材料中不同類型的子材料。圖13 顯示在圖12所示步驟後的系統10，顯示相對於廢濾液貯器處於關閉位置且相對於容器處於打開位置的泵輸入閥28，以及在泵與目標保留物貯器之間處於打開位置的泵輸出閥30，以便將目標保留物收集於目標保留物貯器中，如圖14所示。如圖15所示，即使容器底部餘留的少量目標保留物也可被轉運到目標保留物貯器中。然而，殘留量的目標保留物可能保留在容器與目標保留物貯器之間的管道中，如圖 16所示。為了衝洗並收集管道中殘留的目標保留物，打開相對於廢濾液貯器的泵輸入閥 28(圖17)，使廢濾液通過管道18泵送直到廢濾液將管道中的殘留目標保留物推到目標保留物貯器中(圖18)。作為最終的系統衝洗，可使廢濾液(例如血漿)通過系統衝洗。如圖19所示，關閉相對於目標保留物貯器的泵輸出閥，並且使廢濾液通過系統泵送以衝洗出整個系統並將任何餘留的子材料收集到容器中。然後，可將容器中收集的子材料收集到可與目標保留物貯器24交替使用或目標保留物貯器24以外的輔助濾液貯器中(圖20)。圖1所示系統的過濾裝置能夠將細胞部分與例如外周血、臍帶血和/或骨髓的複雜生物液體分離。下面提供系統10的過濾裝置製備方法的實例。系統10可包括其它輔助組件，例如存儲裝置，用於存儲可通過該系統加工的有關各種材料、子材料和試劑的信息和數據以及可適於該系統的有關機械和環境變量的信息。 可對系統進行編程以便在響應由系統傳感器採集的信息和數據時，直觀地調整指定處理的機構和條件。存儲裝置可包括任何合適的與處理器有關的硬碟內存，例如CPU(中央處理器)的R0M(只讀存儲器)、RAM(隨機存儲器)或DRAM(動態隨機存儲器)，或者任何合適的磁碟驅動存儲裝置，例如DVD或CD，或者zip驅動器或存儲卡或存儲條。可將存儲裝置放於遠離系統但仍可通過任何合適的連接裝置或通訊網絡存取的位置，包括但不限於區域網、有限網絡、衛星網絡和網際網路，無論是否是硬連接還是無線連接。處理器或CPU可包括微處理器、微控制器和數位訊號處理器(DSP)。所述系統還可包括錄入裝置和顯示裝置，使用戶能夠將信息輸入系統，並存取和顯示有關指定處理運行或多次運行的信息和數據，以編譯信息和數據和/或產生報告。顯示裝置可包括能夠顯示數字圖像的任何合適的裝置，例如但不限於結合LCD或CRT的裝置。除非另有說明，否則冠詞「一」是指被該冠詞「一」修飾的詞的一個/種或一個/種以上。除非另有說明，否則在所有情況下，表示成分、性質(例如分子量、反應條件)等用於本說明書和權利要求書的量的所有數字都應理解為被術語「約」修飾。因此，除非有相反的說明，否則在下面的說明書和隨附權利要求書中給出的數值參數均為近似值，該近似值可隨試圖通過本發明獲得的所需性質而變化。至少應根據報告的有效數的數值，並應用普通捨入技術，來解釋每個數值參數，絲毫不限制且也不試圖限制權利要求範圍等同內容的教導的應用。
本文的「聚集劑」是指有助於促進血細胞聚集的分子。聚集劑的實例包括但不限於高分子量聚合物分子，例如某些蛋白質如血纖蛋白原或Y球蛋白；明膠和某些多糖如葡聚糖、羥乙基澱粉、噴他澱粉(pentastarch)和聚乙二醇(PEG)。本文的「試 劑盒」是指給定測定或試驗所必需的一種或多種反應物、使用試劑盒中的反應物的整套說明、維持反應條件所需的任何緩衝液和其它任選材料，例如離心柱或微
量離心管。沉澱血細胞的本發明的方法和試劑盒一般包括加入一種或多種無毒增強劑(例如檸檬酸鈉或琥珀酸鈉)以加快RBC沉降。因為檸檬酸鈉和琥珀酸鈉早已經胃腸外用於醫療實踐中，因此這些方法和試劑盒的無毒增強劑對於人類體內應用是安全的，且沉澱RBC 後回收的細胞可用於治療目的。提高紅細胞沉降的方法的一個或多個實例提高高度純化的細胞(例如具有高細胞成活率的TNC)的回收率，這對於各種治療應用是可取的。用於一種或多種方法中的無毒增強劑提高沉降速率。用於一種或多種方法中的無毒增強劑的非限制性實例為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉及其組合。在一些實例中，細胞沉澱方法包括提供通過加入聚集劑和不同濃度範圍的無毒增強劑進行處理的含有血細胞的樣品。合適濃度範圍的實例包括但不限於10mM-100mM、 12. 5mM-75mM、25mM-75mM 和 50mM-75mM。在一些實例中，樣品中細胞的沉澱方法包括提供通過加入終濃度範圍為約 12. 5mM-約IOOmM聚集劑和無毒增強劑進行處理的血細胞，其中無毒增強劑為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或其組合。在一些實施方案中，聚集劑包括葡聚糖，無毒增強劑包括檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或其組合。沉澱細胞的試劑盒的一個或多個實施方案包括聚集劑和無毒增強劑。用於聚集細胞的試劑盒的一個或多個實施方案包括聚集劑和無毒增強劑，其中無毒增強劑包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。用於聚集細胞的試劑盒的一個或多個實施方案包括聚集劑和無毒增強劑，其中聚集劑為葡聚糖。回收具有高純度和成活率的細胞的方法一般採用聚集劑與用於沉降的無毒增強劑的組合。例如在一個實例中，包括紅細胞在內的樣品通過加入聚集劑和無毒增強劑進行處理，接著溫育樣品，最終回收TNC。從含紅細胞的樣品中回收某一百分比的TNC的一種或多種方法包括按預定濃度加入聚集劑和無毒增強劑，接著溫育樣品，最終回收總有核細胞。在某些實施方案中，增強劑為檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
實施例根據下面的實施例可更全面地理解本發明的實施，本文提供的實施例僅用於舉例說明，不應解釋為以任何方式限制本發明。實施例1原料人外周血用於本實驗。本實施例使用的葡聚糖T500獲自Pharmacosmos A/s，Denmark ；檸檬酸鈉二水合物獲自J T Baker ；琥珀酸鈉獲自Sigma，St. Louise, Missouri。
在不同的生物相容 性增強劑存在下，體外測定紅細胞聚集的程度。將2. 4ml血液樣品與2. 4ml含有3%葡聚糖T500的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)混合，然後溫育，製備不含聚集增強劑的對照樣品(葡聚糖的終濃度為1. 5% )。也製備兩個試驗樣品。將2. 4ml血液樣品與2. 4ml含有3%葡聚糖T500和IOOmM檸檬酸鈉的PBS混合，然後溫育，製備第一試驗樣品(葡聚糖的終濃度為1. 5%，檸檬酸鈉的終濃度為50mM)。將2. 4ml血液樣品與2. 4ml 含有3%葡聚糖T500和IOOmM琥珀酸鈉的PBS混合，然後溫育，製備第二試驗樣品(葡聚糖的終濃度為1. 5%，琥珀酸鈉的終濃度為50mM)。對照和試驗樣品在室溫下的溫育時間約為 20分鐘。在紅細胞沉降後，回收上清液。然後測定回收上清液的體積。每個實驗重複3次 (η = 3)，計算每組的標準差。最終數據以圖21的柱狀圖給出。對照(僅葡聚糖)較高的標準差值很可能是由不太壓實和上清液的回收率降低所致。圖21描述了檸檬酸鈉和琥珀酸鈉對紅細胞聚集的作用的實施例。在葡聚糖存在下回收的上清液體積用作對照，將其與在檸檬酸鈉和葡聚糖存在下或在琥珀酸鈉和葡聚糖存在下回收的上清液體積進行了比較。聚集程度反映了回收的上清液體積。壓實提高導致更好的聚集，從而導致更好的上清液回收率。實驗在室溫下進行，聚集的溫育時間在本實施例中約為20分鐘。實施例2在不同濃度的無毒增強劑存在下體外測定了紅細胞聚集的效率。在不含增強劑 (用作對照)的情況下，將血液樣品與1.5%葡聚糖Τ500 —起溫育。將2. Oml血液樣品與 2. Oml含有3%葡聚糖Τ500的PBS混合，製備對照樣品。含有1. 5%葡聚糖Τ500及12. 5mM、 25mM、50mM、75mM和IOOmM檸檬酸鈉作為增強劑的血液樣品用作試驗樣品。將2. Oml血液樣品與2. Oml分別含有3. 0%葡聚糖T500及25mM、50mM、IOOmM和150mM檸檬酸鈉的PBS混合，製備試驗樣品，使得每個試驗樣品的葡聚糖達到1. 5%的終濃度，相應試驗樣品的檸檬酸鈉終濃度達12. 5mM、25mM、50mM和75mM。將對照和試驗組的樣品在室溫下溫育20分鐘。在紅細胞沉降後，回收液體。然後測定回收上清液的體積。每個實驗重複3次(η =3)，計算每組的標準差。最終數據以圖22的柱狀圖給出。雖然本文僅舉例說明和描述了本發明的某些特徵，但是本領域技術人員會想到許多修改和變動。因此，應理解，隨附權利要求將包括落在本發明真實精神範圍內的所有這類修改和變動。
權利要求
1.一種用於加工生物材料的系統，所述系統包括容器，該容器用於裝生物材料並能夠將生物材料分成兩種或更多種不同的子材料；提取裝置，該提取裝置用於從所述容器中取出至少一種子材料；過濾裝置；管道，通過該管道一種或多種子材料在容器與過濾裝置之間轉運；和控制裝置，該控制裝置通過管道在容器與過濾裝置之間至少轉運一種或多種子材料。
2.權利要求1的系統，所述系統還包括至少暫時貯存一種或多種濾液的一個或多個貯器。
3.權利要求2或3的系統，其中所述貯器之一是廢濾液貯器。
4.任何前述權利要求的系統，其中所述貯器之一是目標保留物貯器。
5.權利要求1的系統，所述系統還包括與管道保持液體連通的泵，以促進容器與過濾裝置之間一種或多種子材料的轉運。
6.任何前述權利要求的系統，所述系統還包括沿著管道將目標保留物選擇性引入目標保留物貯器的閥。
7.任何前述權利要求的系統，所述系統還包括沿著管道使廢濾液至少部分通過管道進行選擇性再循環的閥。
8.任何前述權利要求的系統，其中所述容器適於至少部分根據兩種或更多種子材料的相對重量將材料分離成子材料。
9.任何前述權利要求的系統，其中所述容器適於將子材料分離成沉降層。
10.權利要求9的系統，其中所述提取裝置適於抽出一個或多個沉降層。
11.權利要求9或10的系統，其中所述提取裝置適於抽出容器中的最低層。
12.權利要求9-11中任一項的系統，其中所述提取裝置適於抽出容器中的最上層。
13.任何前述權利要求的系統，所述系統還包括與試劑貯器處於流體連通的閥，以便從試劑貯器中選擇性取出確定量的試劑，並將確定量的試劑引入所述容器。
14.任何前述權利要求的系統，其中所述提取裝置還適於從容器中將確定量的材料抽入試劑之前已引入的提取裝置中，然後將所抽出的材料輸送回所述容器中，以促進材料與試劑的混合。
15.任何前述權利要求的系統，所述系統還包括用於測定所述容器中至少一種子材料的位置或水平的檢測裝置。
16.任何前述權利要求的系統，其中所述一種或多種子材料在容器與過濾裝置之間的轉運是自動的。
17.任何前述權利要求的系統，所述系統還包括測定所述容器中一種或多種子材料的存在的傳感器。
18.一種用於加工生物材料的方法，所述方法包括向容器中提供生物材料；將聚集劑加入容器內的材料中，並將材料分成兩種或更多種不同的子材料；從容器中提取一種或多種子材料；將餘留在容器中的一種或多種子材料自動轉運到過濾裝置中；和將所得的目標保留物收集到目標保留物貯器中。
19.權利要求18的方法，其中將所述容器中餘留的子材料通過管道轉運到過濾裝置。
20.權利要求18或19中任一項的方法，所述方法還包括檢測所述容器中一種或多種子材料的存在。
21.權利要求18-20中任一項的方法，其中提取一種或多種子材料直到達到設定點。
22.權利要求18-21中任一項的方法，所述方法還包括將所得廢濾液引入廢濾液貯器中。
23.權利要求22的方法，所述方法還包括在所述目標保留物貯器中收集目標保留物後，用廢濾液衝洗過濾裝置。
24.權利要求18-23中任一項的方法，其中所述生物材料包括全血、臍帶血或骨髓。
25.權利要求18-24中任一項的方法，其中所述目標保留物包括有核細胞。
26.權利要求25的方法，其中所述有核細胞包括幹細胞。
27.權利要求18-25中任一項的方法，所述方法還包括將聚集增強劑加入所述容器內的材料中。
28.權利要求27的方法，其中所述增強劑包括檸檬酸、琥珀酸、其鹽或其組合。
29.—種在包含血細胞的樣品中沉澱細胞的方法，所述方法包括以下步驟 加入聚集劑；和加入終濃度範圍為約IOmM-約IOOmM的無毒增強劑。
30.權利要求四的方法，其中所述無毒增強劑是檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
31.權利要求四或30的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約12.5mM-約75mM。
32.權利要求四或30的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約25mM-約75mM。
33.權利要求四或30的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約50mM-約75mM。
34.權利要求四-33中任一項的方法，其中所述聚集劑選自葡聚糖、羥乙基澱粉或明膠，且所述無毒增強劑包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
35.一種在包含血細胞的樣品中沉澱細胞的方法，所述方法包括以下步驟 加入聚集劑，和加入檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
36.權利要求35的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約IOmM-約100mM。
37.權利要求35的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約12.5mM-約75mM。
38.權利要求35的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約25mM-約75mM。
39.權利要求35的方法，其中所述無毒增強劑的濃度範圍為約50mM-約75mM。
40.權利要求35-39中任一項的方法，其中所述聚集劑選自葡聚糖、羥乙基澱粉或明膠，且所述無毒增強劑包括檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
41.一種在包含血細胞的樣品中沉澱細胞的試劑盒，所述試劑盒包括 聚集劑；和無毒增強劑。
42.權利要求41的試劑盒，其中所述無毒增強劑是檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
43.權利要求41或42的試劑盒，其中所述聚集劑是葡聚糖。
44.一種在包含血細胞的樣品中沉澱細胞的試劑盒，所述試劑盒包括 聚集劑；和無毒增強劑，其中所述無毒增強劑是檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
45.一種在包含血細胞的樣品中沉澱細胞的試劑盒，所述試劑盒包括 聚集劑，其中所述聚集劑選自葡聚糖、羥乙基澱粉或明膠，和無毒增強劑。
46.一種從含有紅細胞的樣品中回收一定百分比的總有核細胞的方法，所述方法包括以下步驟加入聚集劑和無毒增強劑， 溫育樣品使大量紅細胞聚集，和回收總有核細胞。
47.權利要求46的方法，其中所述無毒增強劑是檸檬酸鈉或琥珀酸鈉或其組合。
48.權利要求46或47的方法，其中所述無毒增強劑的終濃度範圍為約IOmM-約100mM。
49.權利要求46或47的方法，其中所述無毒增強劑的終濃度範圍為約12.5mM-約 75mM。
50.權利要求46或47的方法，其中所述無毒增強劑的終濃度範圍為約25mM-約75mM。
51.權利要求46或47的方法，其中所述無毒增強劑的終濃度範圍為約50mM-約75mM。
全文摘要
本發明提供用於加工生物材料的方法和系統，其包括將生物材料裝入容器中；將聚集劑加入容器內的材料中，使材料分離成兩種或更多種不同的子材料；從所述容器提取一種或多種子材料；將容器中餘留的一種或多種子材料自動轉運到過濾裝置中；將所得目標保留物收集到目標保留物貯器中。
文檔編號B01D36/04GK102264410SQ200980149086
公開日2011年11月30日 申請日期2009年11月24日 優先權日2008年12月1日
發明者A·蘇德, B·D·波利佐蒂, H·周, L·餘, N·L·伍德, P·米勒, R·D·史密斯 申請人:通用電氣公司