胺基酸分析用多功能前處理設備及前處理方法

2023-05-07 14:33:56

專利名稱：胺基酸分析用多功能前處理設備及前處理方法
技術領域：
本發明涉及一種胺基酸分析用前處理設備，以及利用這種設備對待測樣品進行氨 基酸分析的前處理方法。
背景技術：
胺基酸是構成蛋白質的基本單位，是生物、醫藥、衛生、農牧業、食品、飲料及飼料 等行業生產和科研中必須的分析測試項目。
目前，胺基酸分析方法主要有化學分析法、電化學方法、分光光度法、高效液相色 譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法等，其中高效液相色譜法(HPLC)是使用最為普遍的方法之 一。高效液相色譜法包括離子交換和反相兩種模式。離子交換使用儀器為胺基酸分析儀， 成本高、專屬性強、普及率低。反相模式使用通用型高效液相色譜梯度系統，成本低、普適性 強、一機多用。
採用反相液相色譜分析胺基酸，一般需要將樣品中蛋白質水解成為胺基酸，傳統 的水解方式為酸水解法，也是目前使用最廣泛的方法。
胺基酸在HPLC分析前，需要大量的前處理工作。前處理過程的重複性和準確性， 是最終胺基酸分析結果準確性的首要決定因素。胺基酸分析前處理過程使用的前處理設備 包括烘箱、氮吹議、恆溫水浴裝置等。前處理設備過多會使操作過程繁瑣，影響方法穩定性 和準確性，同時造成成本的提高。目前只有Waters公司推出PICO. TAGTM水解裝置，可用於 苯異硫氰酸酯(PITC)衍生胺基酸分析方法的酸水解和衍生過程。雖然該裝置具有操作方 便，安全可靠等優點，但成本非常高。
同時由於大部分胺基酸沒有紫外吸收或螢光響應，無法直接進行高效液相色譜分 析，因此需要進行衍生，引入有紫外吸收或螢光響應的基團。PITC是目前最具吸引力的氨 基酸衍生試劑之一，它可以同時與一級和二級氨反應，且衍生產物穩定，方法靈敏度高。但 過量的衍生試劑會影響色譜柱壽命，因此進樣前需儘量去除過量的衍生試劑。目前最常 用的方法是正己烷萃取法，該方法操作簡便，但PITC與胺基酸的衍生反應在鹼性條件下 (pH=9. O)進行，衍生後樣品呈鹼性，直接進樣分析會影響色譜峰型，因此還需要將樣品稀釋2-4倍，而樣品的稀釋過程會導致方法敏度降低。《黃酒中胺基酸測定方法》行業標準徵求 意見稿中採用加入一定體積的10%乙酸水溶液調節樣品pH值，但該方法不穩定，當乙酸放 置時間過長，濃度發生微小變化時，樣品pH值相應改變，會嚴重影響色譜峰型，出現峰分叉 現象。
綜上所述，現階段胺基酸分析的前處理步驟較為繁瑣，操作複雜，需要應用較多的 設備進行操作，並且其穩定性和準確性都有待提高。因此現在需要一種能夠解決上述問題 的新處理方法以及相應的處理設備。
本發明裝置集多種前處理功能於一體，具備胺基酸分析全部前處理功能，且安全 可靠、成本低，操作方便，適合推廣，同時能夠提供更佳的方法穩定性、準確性以及靈敏度。發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種集多種前處理功能於一體，具備胺基酸分析全部前處理功能的設備，同時還提出一種胺基酸前處理的方法，該方法安全可靠、成本低，操作方便，適合推廣，同時這種方法還具備較高的穩定性、準確性和靈敏度。
本發明的技術解決方案是一種胺基酸分析用多功能前處理設備，其特徵在於 所述的處理設備包括透明的箱體1，箱體I的上部設置有可開啟的上蓋2，上蓋2與箱體I 之間設置有密封墊3，在箱體I內設置有樣品架4，在箱體I內還設置有加熱管5和測溫管 6，加熱管5通過設置在箱體I外部的溫控表7進行控制，在上蓋2上設置有帶有流速調節閥9的氮吹管8，氮吹管8可以相對於上蓋2縱向移動並固定，在上蓋2上還設置有抽真空管10。
所述的氮吹管8為多個，並且均勻分布在上蓋2上，所有的氮吹管8的入口都與設置在上蓋2上的多通11連接，多通11的通道數量與氮吹管8的數量相配。
一種利用如權利要求1所述的胺基酸分析用多功能前處理設備對胺基酸進行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和乾燥四個步驟，其特徵在於所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，並向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配製成樣品溶液，安瓿瓶高溫拉絲封口後，放入樣品架4上，開啟加熱管5，對樣品溶液在110±3°〇的條件下水解2411，所述的除酸步驟為安瓿瓶自然冷卻至室溫後，將其封口開啟，利用上蓋2上的抽真空管10對箱體I內腔抽真空，同時通過氮吹管8向樣品架4上安瓿瓶中的樣品溶液進行氮吹， 直至吹乾，然後將安瓿瓶取出，用水充分洗滌安瓿瓶，合併洗滌液，在容量瓶中定容，定容體積至多為25mL,所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對容量瓶中的樣品溶液進行過濾，將過濾後的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，且樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架4，開啟加熱管5，對樣品混合溶液在30土 1°C的條件下衍生 Ih,所述的乾燥步驟為利用上蓋2上的抽真空管10對箱體I內腔抽真空，同時通過氮吹管8向樣品架4上離心管中的樣品溶液進行氮吹至幹，向離心管中加入100-400 μ L、O.05mol/L的乙酸鈉水溶液，渦旋混勻。
本發明同現有技術相比，具 有如下優點本發明所提出的胺基酸前處理設備，其結構簡單，設計巧妙，集多種前處理功能於一體，基本上具備了胺基酸分析的全部前處理功能，操作起來方便快捷，並且這種設備的製作工藝簡單，製造成本低廉，可以說具備了多種優點，特別適合於在本領域中推廣應用，其市場前景十分廣闊。而本發明所提出的胺基酸前處理方法，與傳統的方法相比，具備較為優異的重複性，其穩定性和準確性都較高，同時還有較好的靈敏度。


圖1為本發明多功能前處理設備的結構示意圖。
具體實施方式
下面將說明本發明的具體實施方式
。
如圖1所示，一種胺基酸分析用多功能前處理設備，它包括一個透明的箱體1，箱體I最好採用耐高溫玻璃製作；在箱體I的上部設置有可開啟和關閉的上蓋2，為了保證箱體I關閉狀態下的密閉性，在上蓋2與箱體I之間還設置有密封墊3 ;在箱體I內部設置有樣品架4，根據所需放置的樣品瓶的規格不同，樣品架4可以為與樣品瓶相配的結構或樣式；在箱體I內還設置有加熱管5和測溫管6，而加熱管5通過設置在箱體I外部的溫控表 7進行控制；在上蓋2上設置有帶有流速調節閥9的氮吹管8，氮吹管8可以相對於上蓋2 縱向移動並固定，為了方便氮吹步驟，氮吹管8可以為多個，並且均勻地分布在上蓋2上，所有的氮吹管8的入口都與設置在上蓋2上部的多通11相連，而這個多通11的通道數量則與氮吹管8的數量相配；在上蓋2上還設置有抽真空管10。
本發明所用的儀器設備與試劑。
UV1201紫外-可見檢測器，P1201高壓恆流泵，AS1201自動進樣器，EliteAAP色譜柱，EC2006色譜工作站(以上均為大連依利特分析儀器有限公司產品)，漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器製造有限公司，QL-861)等。
胺基酸標準品(SIGMA ALDRICH)，異硫氰酸苯酯(PITC，純度> 98%，百靈威科技有限公司)，無水乙酸鈉，冰醋酸，三乙胺，鹽酸、乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，去離子水等(除特別標註外，其它均為分析純)。
主要試劑及配製方法O.2mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液移取O. 24 mL異硫氰酸苯酯至IOmL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
l.Omol/L三乙胺乙腈溶液移取1.45 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
標準儲備液AminoAcid Standard, SIGMA ALDRICH, AAS-18-10 X ImL, 2. 5 μ mol/ mL。
標準工作液準確量取標準儲備液ImL至10 mL容量瓶中，加水稀釋並定容。
一種胺基酸進行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和乾燥四個步驟，其特徵在於所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，(如需分析樣品為固態，需要先用粉碎設備將其粉碎)，並向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配製成樣品溶液，將裝有樣品溶液的安瓿瓶高溫拉絲封口後，放入樣品架4上，開啟加熱管5，而測溫管6檢測箱體I內油的溫度，並將溫度值反饋給溫控表7，溫控表7根據箱體I內的油溫對加熱管5進行控制，保持油溫在110±3°C，讓樣品溶液在該溫度條件下水解24h ；所述的除酸步驟為水解工作完成後，讓安瓿瓶和其內的樣品溶液自然冷卻至室溫，並將安瓿瓶的封口開啟，關閉上蓋2，利用上蓋2上的抽真空管10對箱體I內腔抽真空，調節氮吹管8的高度，使其與安瓿瓶中的液面高度相適應，並向多通11內填充氮氣，氮氣通過多通11和氮 吹管8後進入箱體1，對安瓿瓶中的樣品溶液進行氮吹，直至吹乾，然後將安瓿瓶取出，用水充分洗滌安瓿瓶，合併洗滌液，在容量瓶中定容，定容體積不超過25mL ；所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對容量瓶中的樣品溶液進行過濾，濾除混合溶液中的固態物質，將過濾後的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，保證樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架4，開啟加熱管5，對樣品混合溶液在30 ± I °C的條件下衍生Ih ；所述的乾燥步驟為利用上蓋2上的抽真空管10對箱體I內腔抽真空，同時仍然通過多通11和氮吹管8向樣品架4上離心管中的樣品溶液進行氮吹至幹，向離心管中加入一定量的O. 05mol/L乙酸鈉水溶液(體積為100-400 μ L)，渦旋混勻。可根據實際樣品胺基酸含量減小定容體積，最小可減至ΙΟΟμ 。然後取10 μ L的待測樣品溶液進行高效液相色譜 (HPLC)分析。
HPLC分析色譜條件流動相A :0. 05 mol/L乙酸鈉(冰醋酸調節pH=6. 5±0. 05)流動相B :乙腈:甲醇水=60:20:20 色譜柱Elite AAP, 5 μ m, 4. 6 X 150mm 檢測波長254nm 流速1. OmL/min 柱溫42 °C 梯度條件
權利要求
1.一種胺基酸分析用多功能前處理設備，其特徵在於所述的處理設備包括透明的箱體(1)，箱體(I)的上部設置有可開啟的上蓋(2)，上蓋(2)與箱體(I)之間設置有密封墊(3)，在箱體(I)內設置有樣品架(4)，在箱體(I)內還設置有加熱管(5)和測溫管(6)，加熱管(5 )通過設置在箱體(I)外部的溫控表(7 )進行控制，在上蓋(2 )上設置有帶有流速調節閥(9)的氮吹管(8)，氮吹管(8)可以相對於上蓋(2)縱向移動並固定，在上蓋(2)上還設置有抽真空管(10)。
2.根據權利要求1所述的胺基酸分析用多功能前處理設備，其特徵在於所述的氮吹管(8)為多個，並且均勻分布在上蓋(2)上，所有的氮吹管(8)的入口都與設置在上蓋(2) 上的多通(11)連接，多通(11)的通道數量與氮吹管(8)的數量相配。
3.一種利用如權利要求1所述的胺基酸分析用多功能前處理設備對胺基酸進行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和乾燥四個步驟，其特徵在於所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，並向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配製成樣品溶液，安瓿瓶高溫拉絲封口後，放入樣品架(4)上，開啟加熱管(5)，對樣品溶液在110±3°C的條件下水解24h，所述的除酸步驟為安瓿瓶自然冷卻至室溫後，將其封口開啟，利用上蓋(2)上的抽真空管(10)對箱體(I)內腔抽真空，同時通過氮吹管(8)向樣品架(4)上安瓿瓶中的樣品溶液進行氮吹，直至吹乾，然後將安瓶瓶取出，用水充分洗漆安瓶瓶，合併洗漆液，在容量瓶中定容，定容體積至多為25mL,所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對容量瓶中的樣品溶液進行過濾，將過濾後的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，且樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架(4)，開啟加熱管(5)，對樣品混合溶液在30± 1°C的條件下衍生Ih,所述的乾燥步驟為利用上蓋(2)上的抽真空管(10)對箱體(I)內腔抽真空，同時通過氮吹管(8)向樣品架(4)上離心管中的樣品溶液進行氮吹至幹，向離心管中加入 100-400 μ L、0· 05mol/L的乙酸鈉水溶液，渦旋混勻。
全文摘要
本發明公開一種胺基酸分析用多功能前處理設備，以及應用這種前處理設備的一種前處理方法。這種胺基酸前處理設備，其結構簡單，設計巧妙，集多種前處理功能於一體，基本上具備了胺基酸分析的全部前處理功能，操作起來方便快捷，並且這種設備的製作工藝簡單，製造成本低廉，可以說具備了多種優點，特別適合於在本領域中推廣應用，其市場前景十分廣闊。而本發明所提出的胺基酸前處理方法，與傳統的方法相比，具備較為優異的重複性，其穩定性和準確性都較高，同時還有較好的靈敏度。
文檔編號G01N30/06GK103063785SQ20121057740
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者於淑新, 唐濤, 董禮孚, 張彥彬, 孫元社, 李彤 申請人:大連依利特分析儀器有限公司