用於調節腫瘤特異性表達的組合物和方法

2023-04-30 03:30:41

專利名稱：：用於調節腫瘤特異性表達的組合物和方法1.引言本發明涉及控制一種腎細胞癌相關蛋白MN-CA9表達的啟動子、增強子和其它調節元件。具體地說，本發明涉及包含來自控制MN-CA9表達的5』調節區的核苷酸序列及其轉錄活性片段的組合物。特別提供其中MN-CA9啟動子能夠控制一種異源基因的表達、能夠過量表達一種內源基因或一種病理過程的抑制劑、或者能夠使一種在癌症發生和/或發展中被認為是重要的特定基因的表達失效的表達載體、宿主細胞和轉基因動物。本發明也涉及使用所述載體、細胞和動物來篩選作為癌症發生和/或發展之激動劑和拮抗劑的候選分子的方法。本發明也涉及用於調節與癌症發生和/或發展有關的化合物之表達的組合物和方法。另外，本發明涉及篩選在癌症發生和/或發展期間調節表達的化合物。也提供應用通過篩選測定而鑑定的分子與化合物進行治療性治療的方法。本發明另外涉及包含MN-CA9啟動子及其轉錄活性片段的組合物與方法，所述啟動子及其活性片段能夠以組織特異性方式選擇性地啟動異源基因的表達。更詳細地講，所述啟動子能夠選擇性地在各種各樣的腫瘤內增強異源基因的表達。因此，由於本發明啟動子的組織特異性，故可以使治療基因的傳遞靶向癌細胞，而用不著向正常的非腫瘤細胞傳遞治療基因。此外，組織特異性表達提供附加的、便於給予治療基因的有利條件，所述給予治療基因即不僅通過直接應用例如通過注射給予治療基因，而且通過靜脈內給予、口服給予或諸如此類地系統性給予治療基因；因為基因的表達將被限制和定位於特定的細胞類型。2.發明背景2.1基因治療體細胞基因治療是一種用於治療目的的策略，在這種策略中一般以DNA形式給予核酸從而改變靶細胞的所有遺傳組成部分。雖然在實驗性基因治療方面的研究是一個相對的年輕領域，但是在最近十年期間，已取得了重要的進展(Arai，Y.等，1997，OrthopaedicResearchSociety，22-341)。體細胞基因治療治療人類疾病的潛力已激發了許多科學家的想像，主要是因為兩種新技術進步。首先，有許多能在實驗動物中於體內有效轉移及表達基因的病毒和非病毒基因治療載體。其次，加強對人類基因組計劃的支持，將在不久的將來，為構成人類基因組的推算的80,000個基因的標識與測序創造條件。最初設想基因治療為一種用於矯正遺傳缺陷以傳遞功能活性的治療基因到靶細胞中的特定基因替代療法。對體細胞基因治療的最初嘗試依靠將基因引入到組織中的間接手段，稱為離體基因治療；例如，從機體中取出靶細胞，用攜帶重組基因的載體轉染或感染，並重新植入到所述機體中去(「自體細胞轉移」)。各種各樣的轉染技術通常是可用的，且使用各種各樣的轉染技術在體外將DNA轉移到細胞中去；所述技術包括磷酸鈣-DNA沉澱、DEAE-葡聚糖轉染、電穿孔、脂質體介導的DNA轉移或用重組病毒載體的轉導。已提出了將DNA轉移到各種各樣不同細胞類型中去的這樣的離體處理方案，所述各種各樣不同細胞包括上皮細胞(美國專利4,868,116；Morgan和MulliganWO87/00201；Morgan等，1987，Science2371476-1479；Morgan和Mulligan，第4,980,286號美國專利)、內皮細胞(WO89/05345)、肝細胞(WO89/07136；Wolff等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843344-3348；Ledley等，1987Proc.Natl.Acad.Sci.845335-5339；Wilson和Mulligan，WO89/07136；Wilson等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.878437-8441)、成纖維細胞(Palmer等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA841055-1059；Anson等，1987，Mol.Biol.Med.411-20；Rosenberg等，1988，Science2421575-1578；Naughton和Naughton，第4,963,489號美國專利)、淋巴細胞(Anderson等，第5,399,346號美國專利；Blaese，R.M.等，1995，Science270475-480)以及造血幹細胞(Lim，B.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868892-8896；Anderson等，第5,399,346號美國專利)。近來，已嘗試了用包封在脂質體中的DNA製劑(Ledley等，1987，J.Pediatrics1101)、用包封在含有病毒被膜受體蛋白中的DNA製劑(Nicolau等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A801068)和偶聯到聚賴氨酸-糖蛋白載體複合物上的DNA進行體內直接基因轉移。另外，已運用了「基因槍」將基因傳遞到細胞中(第9068389號澳大利亞專利)。甚至有人推測可以裸露的DNA或與脂質體結合的DNA配製到液體載體溶液中，供注射到胞間隙中，以轉移DNA到細胞中去(Felgner，WO90/11092)。對於像囊性纖維化和癌症這樣的不同疾病，利用基因治療技術的許多臨床試驗正在進行中。雖然可以在於臨床背景下成功應用這項技術之前仍有許多必須越過的障礙；但是這種治療方法在顯著改善醫學實踐方面的前景得到了廣泛的支持。或許，不管是離體還是體內，與當前設計的基因治療有關的最大的問題之一，是不能控制靶基因的表達以及不能將靶基因的表達限制於達到有益治療效果所需的一種或多種細胞類型。已充分地認識到傳遞有毒的治療基因到腫瘤細胞中且在腫瘤細胞中通過使用組織特異性啟動子而表達有毒的治療基因的理念。當載體(病毒、脂質體等等)基因的傳遞導致既感染正常細胞、又感染癌細胞時，這種方法則減少治療基因對鄰近正常細胞的毒性作用。實例包括應用甲胎蛋白啟動子以靶向肝癌細胞(Koryama等，1991，CellStruct.Punct.，16503-510)、對於胃癌應用癌胚抗原(CEA)啟動子(Tanaka等，1996，CancerResearch，461341-1345)、應用酪氨酸酶啟動子殺傷黑素瘤細胞(Vile等，1994，CancerResearch，546228-6234)、對於腦應用骨形態發生蛋白啟動子以靶向神經膠質瘤細胞(Shimizu，K.1994，NipsonRinsbo，523053-3058)、以及應用骨鈣蛋白啟動子以殺傷骨癌和前列腺癌(Ko，S.等，1996，CancerResearch，564614-4619；Gardener等，1998，GeneTherapyandMolecularBiology，241-58)。現在越來越頻繁地使用分子治療策略，例如通過使用組織限制性啟動子和腫瘤限制性啟動子的基因治療。基因治療方法的關鍵部分包括i)選擇合適的組織特異性啟動子或腫瘤限制性啟動子，在某些情況下，所述啟動子可以可由一種激素、維生素、一種抗生素、藥物或重金屬誘導；ii)選擇治療(或毒性)基因；iii)合適的載體，例如反轉錄病毒、腺病毒、脂質體等等。靶向合適的腫瘤組織而不損害正常宿主組織的關鍵是可以僅將治療基因導向那些使用所挑選啟動子的啟動子。2.2MN-CA9蛋白的表達有人認為稱為MN-CA9的蛋白產物是具有胚胎起源性質的，且可以解釋具有這種表型表達的腫瘤的某些強轉移行為。實質上，該基因產物的表現類似於胎兒癌基因，潛在地給予細胞局部發展、侵染以及轉移到周圍及遠端器官的能力。免疫螢光和免疫電鏡術的研究揭示了，MN-CA9具有54kd和58kd的分子量，並且該蛋白既存在於質膜上、又存在於細胞核中。免疫組織化學研究進一步揭示了，例如由宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌產生MN-CA9蛋白。此外，在正常的宮頸組織、卵巢組織或腎組織中不表達該蛋白。僅在今年，預期在美國的腎細胞癌、胃癌和結腸癌以及宮頸癌的新病例分別大約是30,000例、21,900例、12,800例。此外，預計這些癌症導致美國國內11,900人、13,500人及4,800人死亡。這種高死亡百分率與常常伴隨這些特殊癌症發生的轉移性疾病的發展有關。另外，如果考慮世界範圍的由於這些癌症引起的死亡率，則這些數目急劇地增加。所有這些癌症都有最終的高死亡率及顯著的發病率。例如，對於腎細胞癌，大約50％診斷有癌症的患者發生轉移性疾病且通常是不可救藥的。因此，由於當前在治療包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌、胃癌和結腸癌的各種各樣癌症方面的不足；因而對這些癌症，急需新的治療方法。本發明滿足這些需要且提供一種用於調節、診斷和/或治療這樣的癌症的有用模型。3.發明概述在這裡公開的本發明提供一種用於腫瘤特異性基因轉錄的模型。本發明部分基於本文描述的一種新的MN-CA9啟動子的功能特性描述，所述啟動子是一種僅在各種各樣癌中發現有活性的啟動子；所述的各種各樣癌包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。本發明提供用於篩選調節癌症發生和/或發展期間化合物表達的化合物的組合物和方法。具體地說，本發明提供包含控制癌相關蛋白MN-CA9表達、來自MN-CA9的5』調節區的核苷酸及其轉錄活性片段、以及在高度嚴格條件下和中等嚴格條件下與這樣的核苷酸雜交的核酸的組合物。特別提供包含可操作地與一個異源報導基因連接的MN-CA95』調節區及其轉錄活性片段的表達載體，以及提供含有這樣載體的宿主細胞和轉基因動物。本發明也提供使用這樣的載體、細胞和動物來篩選作為各種各樣癌之激動劑和拮抗劑的候選分子的方法。同樣，提供應用所述篩選測定而鑑定的分子與化合物進行治療處理的方法。例如(但不是作為限制)，將包含一個報導基因的組合物可操作地連接到本文稱為MN-CA9調節區的一種腫瘤特異性調節序列上。該MN-CA9驅動的報導基因在動物中作為轉基因表達。可以使用所述轉基因動物以及來源於所述轉基因動物體內的癌細胞的細胞，來篩選作為可用於調節各種各樣癌的候選物的化合物。雖然不希望受任何特定理論所約束，但這樣的分子可能既幹擾反式作用因子例如轉錄因子的功能，又幹擾順式作用元件例如與各種各樣癌有關的啟動子和增強子的功能。照這樣，它們可能是用於治療這樣癌症的強有力的候選物；所述癌症包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌、胃癌和結腸癌、以及任何其它產生MN的腫瘤。在一個實施方案中，本發明提供高通量地篩選調節腫瘤細胞內基因特異性表達的化合物的方法。在本發明的這一方面，從轉基因動物體中取出來自癌組織的細胞，並在體外培養所述的細胞。利用報導基因的表達來監測腫瘤特異性基因的活性。在一個特定的實施方案中，綠色螢光蛋白(GFP)為報導基因。在另一個實施方案中，螢火蟲螢光素酶是所述的報導基因。可以進一步測試用這種方法鑑定的化合物對正常動物中的非癌細胞的作用。在另一個實施方案中，可以用本發明的轉基因動物模型來進行體內篩選，以研究候選藥物對癌細胞上作用的作用機制。具體地說，可以分析所述藥物對包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌的各種各樣癌的作用。在另一個實施方案中，提供一種用於治療癌症發生和/或發展的基因治療方法。使用MN-CA9調節序列來驅動藥物或毒素的腫瘤特異性表達；且將MN-CA9調節序列引入到各種各樣的癌細胞中。該方法包括將可操作地與一種藥物或毒素基因連接的MN-CA9調節序列引入到癌細胞中。本發明另外提供用於篩選調節MN-CA9調節序列的新的轉錄因子的方法。可以把用這種方法鑑定的這樣的新轉錄因子用作治療各種各樣癌症的靶。4.附圖簡述圖1從1到540鹼基對的MN啟動子序列。在該圖內也指出了所述啟動子序列內的限制性酶切位點。圖2A-2CMN-CD(圖2A)、MNSP-CD(圖2B)及MN-Ela(圖2C)重組腺病毒穿梭載體的構建。已使用這些載體來構建複製缺陷型(Ad-MN-CD和Ad-MNSP-CD)重組腺病毒載體及複製限制型(Ad-MN-Ela)重組腺病毒載體。圖3MN啟動子構成物在不同細胞系中的相對的螢光素酶活性。該圖表明了單獨的MN啟動子構成物以及和SV-40啟動子的SV40增強子區聯合的MN啟動子構成物在以下細胞系中的相對螢光素酶活性MN表達的腎細胞癌細胞系(SK-RCC31，SK-RCC-38)和MN非表達的腎細胞癌細胞系(SK-RCC-29，SK-RCC-42)、MN表達的宮頸癌細胞系(Hela)以及MN非表達的前列腺癌細胞系(LNCaP)。相對於具有MN啟動子的pGL3質粒，每種MN非表達子顯示了極小的螢光素酶活性；且將SV-40啟動子的增強子區段添加到MN啟動子上，螢光素酶活性僅有略微的增強。另外，MN表達細胞系在MN啟動子的調節下，表達顯著的基礎螢光素酶活性；添加SV-40啟動子的增強子區則顯著增強(8至12倍)所述螢光素酶活性。圖4腎細胞癌和宮頸癌細胞系中的MN啟動子缺失分析。使用和圖3中的相同細胞系，證實了MN啟動子區對於MN表達細胞系的特異性。任何啟動子片段的缺失與全長MN啟動子在MN表達細胞系中所示特異性和活性的丟失有關。圖5MN-螢光素酶構成物的示意圖。最前面的線代表MN5』序列。數字為按bp計的距MN轉錄起始位點的距離。5.發明詳述本發明提供指導在腫瘤內表達的啟動子、增強子和其它調節元件，所述啟動子、增強子和其它調節元件包括來自控制MN-CA9蛋白表達的5』調節區的核苷酸序列及其轉錄活性片段。特別提供其中MN-CA9調節區能夠控制異源基因的表達、能夠過量表達一種內源腫瘤基因或一種病理過程的抑制劑、或者能夠使一種在癌症發生和/或發展中被認為是重要的特定基因的表達失效的表達載體、宿主細胞和轉基因動物。這樣的癌症的實例包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。本發明也提供使用所述載體、細胞和動物來篩選作為癌症發生和/或發展之激動劑和拮抗劑的候選分子的方法。在一個替代的實施方案中，本發明提供調節與癌症發生和/或發展有關的化合物表達的組合物和方法，且提供篩選在癌症發生和/或發展期間調節表達的化合物的組合物和方法。也提供應用通過所述篩選測定而鑑定的分子與化合物進行治療處理的方法。本發明另外提供治療和/或改善癌症和其它疾病及紊亂的方法，所述癌症包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。本發明部分基於下述發現使用可以供核苷酸序列的組織特異性表達之用的啟動子，可以以細胞和組織特異性的方式，給予包含於載體(即病毒載體)內的編碼毒劑和/或治療劑編碼序列的核苷酸序列。此外，因為本發明的載體利用這些啟動子來控制毒性和/或治療性編碼序列的表達，所以本發明的載體不僅當通過直接應用給予時，而且當系統給予機體時，都是有效的治療劑；因為僅僅將在被特異性靶向的細胞中即在表達MN-CA9的細胞內，表達所述毒劑和/或治療劑編碼序列。利用這種特性，來設計本發明的方法，從而有效地轉移一種或更多種編碼治療劑的DNA分子到必需治療劑的部位。所述方法涉及給予一種包含編碼翻譯產物(即治療蛋白)或轉錄產物(即反義RNA或核酶)的DNA載體到哺乳動物宿主體內必需所述翻譯產物的部位上。只要該載體感染必需治療劑的細胞，所關注的編碼序列即表達胸苷激酶便得以表達；因此放大了毒劑和/或治療劑、蛋白或RNA的量。本發明也涉及包含載體的藥用組合物，所述載體包含供治療和/或改善癌症和其它疾病及紊亂之用的DNA；所述癌症包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。本發明的組合物通常由包含載體的生物適合性材料組成，該載體包含編碼所關注治療蛋白即胸苷激酶、生長因子等等的DNA。生物適合性組合物是一種當給予哺乳動物宿主時不引起變態反應、有害反應或其它不適宜反應之形式的組合物。本發明克服了特別與當前治療和/或癌症和其它疾病及紊亂的重組蛋白療法有關的缺點，所述癌症包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。首先，直接基因轉移是一種有合理的策略；所述策略允許轉染細胞(a)製造生理學量的、以組織和範圍特異性方式修飾的治療蛋白，以及(b)在適當的環境中，傳遞這種蛋白到合適的細胞表面信號受體上。預期這樣分子的外源傳遞與有效給藥和傳遞難題有關。其次，當可能時，用本發明的方法不需要反覆給藥；因為可以用各種各樣的啟動子，包括誘導型啟動子，來控制所關注治療蛋白的表達水平。另外，轉染DNA的整合可涉及重組蛋白的長期表達。在下面5.1和5.2節中詳細描述了所述MN-CA9調節區的核苷酸序列、以及其中由MN-CA9調節區控制異源基因的表達的表達載體、宿主細胞和轉基因動物。在5.3節中，描述了使用這樣的多核苷酸(即MN-CA9基因的調節區)和融合蛋白產物篩選與MN-CA9基因之調節區相互作用的化合物的方法。這節描述篩選與所述MN-CA9調節區結合或調節所述MN-CA9調節區之活性的小分子、化合物、重組蛋白、肽、核酸、抗體等等的體內和體外測定。5.4節描述了供將所鑑定的激動劑和拮抗劑用於藥物傳遞或基因治療的方法。最後，在5.5節中，描述了運用這樣的激動劑和拮抗劑來調節與癌細胞相關的疾病的藥用組合物。提供用於治療各種各樣癌症的方法和組合物，所述癌症包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。5.1本發明的多核苷酸和核酸本發明包括包含MN-CA9基因的5』調節區及其轉錄活性片段的多核苷酸序列。尤其是，本發明涉及包含圖1所示序列的、緊接地位於MN-CA9基因的轉錄起始位點之5』的多核苷酸。在不同的實施方案中，所述多核苷酸可以是5000、4000、3000、2000、1000bp的長度，優選大約500bp的長度，且更優選大約250bp的長度。本發明進一步提供MN-CA9調節區的探針、引物和片段。在一個實施方案中，提供由MN-CA9基因序列的至少8個核苷酸組成的純化的核酸(即一個可雜交部分)；在其它的實施方案中，所述核酸由MN-CA9序列的至少20個(鄰接的)核苷酸、25個核苷酸、50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、500、1000、2000、3000、4000或5000個核苷酸組成。可以用對於本領域技術人員眾所周知的方法來構建這些序列，它們或者呈分離的狀態，或者被包含於表達載體中。這些方法包括例如，體外DNA重組技術、合成技術以及體內遺傳重組。參見例如Sambrook等於1989年描述的技術(參見上文)、以及Ausabel等於1989年描述的技術(參見上文)，也參見在「OligonucleotideSynthesis」(《寡核苷酸合成》)(1984，GaitM.J.編輯，IRLPressOxford)中描述的技術；通過引用將其全部結合到本文中。在另一個實施方案中，所述核酸在長度方面小於20、25、35、200或500個核苷酸。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。本發明也包括與上述序列可雜交或互補的核酸。在特定的方面，提供包含與MN-CA9基因調節區的至少10、20、25、50、100、200、500個核苷酸或全部序列互補的序列的核酸。研究團體可以為了各種各樣的目的使用由本發明提供的MN-CA9調節區的探針、引物及片段。可以將它們用作DNA印跡凝膠上的分子量標誌；用作鑑定染色體或作相關基因位置之圖譜的染色體標誌或標記(當被標記時)；與患者體內的內源DNA序列比較以鑑定潛在的遺傳病；用作雜交探針且因此發現新的、相關的DNA序列；用作衍生出用於基因指紋分析的PCR引物的信息源；以及在發現其它新的多核苷酸的方法中，用作「扣除」已知序列的探針。對於本領域技術人員，進行上面列舉的應用的方法是眾所周知的。公開這樣的方法的參考文獻包括而不限制於「MolecularCloningALaboratoryManual」，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis編輯，1989；以及「MethodsinEnzymologyGuidetoMolecularCloningTechniques」，AcademicPress，Berger，S.L.和A.R.Kimmel編輯，1987。本發明的核苷酸序列也包括與圖1所示核苷酸序列及/或其轉錄活性片段有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高核苷酸序列同一性、能夠特異性地在包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌的癌內驅動表達的核苷酸序列。為了測定兩種胺基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分率，則為了最佳比較的目的而將所述序列進行比對(例如，為了和第二種胺基酸序列或核酸序列進行最佳比對，可以在第一種胺基酸序列或核酸序列中引入空位)。然後比較在相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。如果在第一種序列中的一個位置被第二種序列中相應位置的、同樣的胺基酸殘基或核苷酸佔據，那麼，所述分子在該位置是相同的。在兩種序列之間的同一性百分率是由所述序列所享有的相同位置數的函數(即％同一性＝相同重疊位置數/位置總數x100)。在一個實施方案中，所述兩種序列有同樣的長度。也可以用一種數學算法來完成兩種序列之間的同一性百分率的確定。一種優選的、非限制的、用來比較兩種序列之數學算法的例子是Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268)；在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中改進了該算法。將這樣一種算法結合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中((1990)J.Mol.Biol.215403-410)。用所述NBLAST程序、分值＝100、字長＝12，可進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的一種核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、分值＝50、字長＝3，進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的一種蛋白分子同源的胺基酸序列。至於為了比較目的而得到引入空位的序列比對，可以如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402中描述，利用GappedBLAST。另一方面，可以用PSI-Blast來進行一種測定分子之間距離關係的迭代搜索(出處同上)。當使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可以用各自程序(例如NBLAST和NBLAST)的預設參數(參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。另一種優選的、非限制性的、用來比較序列之數學算法的例子是Myers和Miller的算法((1988)CABIOS411-17)。將這樣一種算法結合到ALIGN程序(2.0版本)中，所述ALIGN程序為GCG序列比對軟體包的一部分。當使用ALIGN程序來比較胺基酸序列時，可以用一張PAM120加權殘基表(PAM120weightresiduetable)、空位長度罰分(gaplengthpenalty)為12以及空位罰分(gappenalty)為4。在另外一個實施方案中，使用NA_MULTIPLE_ALIGNMENT1.0程序，用為5的GapWeight和為1的GapLengthWeight，可達到序列比對。使用類似於上面描述的那些技術的技術，允許或不允許有空位，可確定兩種序列之間的同一性百分率。在計算同一性百分率方面，一般僅計算準確的匹配。本發明也包括(a)包含上述MN-CA9調節序列和/或其互補物(即反義物)中的任一種的DNA載體；(b)包含與一種異源基因例如一種報導基因可操作地連接的上述MN-CA9調節元件序列之任一種的DNA表達載體；以及(c)遺傳工程化的宿主細胞；所述細胞包含與一種異源基因可操作地連接的上述MN-CA9調節元件序列之任一種，致使所述MN-CA9調節元件指導該異源基因在所述宿主細胞中表達。在本發明的範圍內，同樣包括這調節區的各種各樣轉錄活性片段。按照本發明的、圖1所示序列的「轉錄活性」或「轉錄功能」片段，是指包含作為在重組宿主細胞中重組多肽或重組多核苷酸表達的調節區有功能的所述多核苷酸片段的多核苷酸。對本發明來說，如果所述的調節多核苷酸含有包含轉錄信息的核苷酸序列，且這樣的序列與編碼所需多肽或所需多核苷酸的核苷酸序列可操作地連接；則該核酸或多核苷酸作為重組多肽或重組多核苷酸表達之調節區是「轉錄活性的」。尤其是，本發明MN-CA9調節區的轉錄活性片段包括那些當可操作地連接在MN-CA9調節序列上且轉染到一種MN-CA9-表達細胞系中時具有足夠長度而啟動報導基因之轉錄的片段。一般將該調節區緊接地置於編碼序列的5』，且與該編碼序列可操作地連接。當用於本文時，術語「可操作地連接」指的是緊接報導基因的5』(上遊)放置調節序列，以致轉錄起始所需反式作用因子例如轉錄因子、聚合酶亞基以及輔助蛋白能夠在這個區域裝配，從而使得能夠起始該報導基因依賴於RNA聚合酶的轉錄。在一個實施方案中，所選擇的多核苷酸序列可以另外包含其它的核苷酸序列；所述其它的核苷酸序列或者來自MN-CA9基因，或者來自一種異源基因。在另一個實施方案中，可以將一種啟動子或其片段的多個拷貝相互連接。例如，可以以頭-尾、頭-頭或尾-尾的取向，將啟動子序列或其片段連接到該啟動子的另一個拷貝上、或其另一個片段上。在另一個實施方案中，可以將腫瘤特異性增強子可操作地連接到MN-CA9調節序列或其片段上，並將其用來增強含有所述MN-CA9調節序列的構成物的轉錄。在本發明的範圍內，也包括大體上不影響核苷酸序列之轉錄活性的這種核苷酸序列的修飾。這樣的修飾包括插入、缺失和取代。另外，本發明包括在嚴格條件下與圖1所示序列之互補物選擇性地雜交、且能夠激活編碼序列表達的任何核苷酸序列。示範性的中等嚴格的雜交條件如下於65℃，在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA以及500μg/ml變性鮭精DNA組成的緩衝液中，進行載有DNA之濾膜的預雜交達8小時至過夜。在65℃，於含有100μg/ml變性鮭精DNA以及5-20X106cpm之32P標記的探針的預雜交混合物中，使濾膜雜交達48小時。在37℃，於含有2XSSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll以及0.01％BSA的溶液中，進行濾膜的洗滌達1小時。此後於50℃在0.1XSSC中洗滌達45分鐘，然後進行放射自顯影。另一方面，示範性的高度嚴格的條件如下例如，於65℃，在0.5MNaHPO4、7％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中，與結合濾膜的DNA雜交；且在68℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌(AusubelF.M.等編輯，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.I，GreenPublishingAssociates，Inc.，以及JohnWileysons，Inc.，NewYork，第2.10.3頁)。可以使用的其它的高度嚴格條件是本
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眾所周知的。通常，對於長度在14與70個核苷酸之間的探針，用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[單價陽離子(摩爾濃度(molar))])+0.41(％G+C)-(500/N)，來計算解鏈溫度(Tm)；在公式中，N為該探針的長度。如果在含有甲醯胺的溶液中進行雜交，則用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[單價陽離子(摩爾濃度)])+0.41(％G+C)-(0.61％甲醯胺)-(500/N)，來計算解鏈溫度(Tm)；在公式中，N為該探針的長度。通常在Tm以下大約20-25℃(對於DNA-DNA雜合體)或在Tm以下大約10-15℃(對於RNA-DNA雜合體)，進行雜交。所述MN-CA9調節區或其轉錄功能片段最好是來源於一種哺乳動物有機體。依靠核酸雜交的篩選步驟使得從其它生物中分離任何基因序列成為可能。可以標記本文公開的分離的多核苷酸序列或其片段，並可以將其用來篩選由得自所關注有機體的合適細胞或組織(例如癌組織)的mRNA構建成的cDNA文庫)。如果該cDNA文庫來源於一種與所述標記序列所來源之有機體類型不同的有機體，則所用的雜交條件應該具有較低的嚴格性。本領域技術人員熟知低嚴格條件，且低嚴格條件將根據該文庫和標記序列所來源的特定生物而變化。至於有關這樣條件的指導，參見例如，Sambrook等，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，N.Y.，；以及Ausabel等，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.，通過引用，將它們中的每一篇全部結合到本文中。另外，通過運用兩種根據本文公開的MN-CA9調節區核苷酸序列而設計的引物庫，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；可以從例如牛核酸或其它非人類核酸中分離出其它哺乳動物的MN-CA9調節區的同源物。用於所述反應的模板可以是通過mRNA反轉錄而得到的cDNA，所述mRNA即由例如牛或其它非人類的細胞系、或者已知表達MN-CA9基因的組織製備的mRNA。至於有關這樣條件的指導，參見例如，Innis等(編輯)，1995，PCRStrategies，AcademicPressInc.，SanDiego；以及Erlich(編輯)，1992，PCRTechnology，OxfordUniversityPress，NewYork；通過引用，將它們中的每一篇全部結合到本文中。通過使用常規技術例如外切核酸酶III消化或合適的限制性內切酶消化，構建5』和/或3』的嵌套缺失物；可以進一步地確定在MN-CA9基因的5』非編碼區內的啟動子序列。可以將所產生的缺失片段插入到所述啟動子報導基因載體中，以確定是否該缺失已降低了或消除了啟動子的活性；例如如Coles等所述(Hum.Mol.Genet.，7791-800，1998)。這樣，可以確定啟動子的邊界。如果希望，可以運用定點誘變或接頭分區誘變來單獨或組合地消除啟動子內潛在的轉錄因子結合位點，從而鑑定該啟動子內的潛在的各個調節位點。通過將突變體插入到啟動子報導基因載體中的克隆位點上，可確定這些突變在轉錄水平上的效應。這些測定的類型是本領域技術人員眾所周知的(WO97/17359，US5,374,544，EP582796，US5,698,389，US5,643,746，US5,502,176以及US5,266,488)。運用本
技術領域：
眾所周知的操作法，靠重組DNA技術，可產生所述MN-CA9調節區及其轉錄功能片段以及用來鑑定MN-CA9調節區及其片段的、本文描述的片段和探針。可以用本領域技術人員眾所周知的方法，或者以分離的形式，或者以包含於表達載體中的形式，來構建這些序列。這些方法包括例如，體外重組DNA技術、合成技術以及體內遺傳重組。參見例如Sambrook等於1989年描述的技術(參見上文)、以及Ausabel等於1989年描述的技術(參見上文)，也參見在「OligonucleotideSynthesis」(1984，GaitM.J.編輯，IRLPressOxford)中描述的技術；通過引用將其全部結合到本文中。用各種各樣的、本領域技術人員眾所周知的化學方法和酶法，可導致該調節序列的改變。例如，可以缺失掉由限制性位點定限定的序列區域。可以用寡核苷酸指導的誘變，以一種限定方式來改變序列，和/或在該序列內的特定區域中引入限制性位點。另外，運用DNA核酸酶例如Bal31、ExoIII或S1核酸酶，可產生缺失突變體。通過將所述DNA與核酸酶保溫達增長的時間，可導致調節序列中的逐漸更大的缺失(參見例如Ausubel等，1989，參見上文)。在合適的宿主細胞中，評價改變了的序列指導異源編碼序列進行表達的能力。保持其指導結合到重組表達載體中的編碼序列表達能力以供進一步使用的任何經改變的調節序列，都在本發明範圍內。5.2腫瘤特異性啟動子活性的分析所述MN-CA9基因調節區顯示了選擇性的組織和細胞類型特異性，即它誘導基因在宮頸癌細胞、腎細胞癌細胞以及胃癌細胞和結腸癌細胞中表達。因此，可以使用本發明該調節區及其轉錄活性片段來誘導腫瘤細胞中異源基因的表達。本發明涉及使用MN-CA9基因調節區以達到靶基因的組織特異性表達。通過監測不同類型細胞和組織中與所述MN-CA9啟動子可操作地連接的可檢測多核苷酸的表達水平，可進一步地評價所述MN-CA9調節區的活性及特異性。正如在下文中所討論的，所述可檢測多核苷酸或者可以是一種與預先確定的寡核苷酸探針特異性雜交的多核苷酸，或者可以是一種編碼可檢測蛋白的多核苷酸。5.2.1MN-CA9啟動子驅動的報導基因構成物按照本發明的調節多核苷酸可以便利地成為一種可用來在所需宿主細胞或宿主有機體中表達一種編碼序列或報導基因的重組表達載體的一部分。可以用本發明的MN-CA9調節區及其轉錄活性片段來指導異源編碼序列的表達。根據本發明，所述MN-CA9調節區的轉錄活性片段包括那些具有足夠長度從而啟動與所述片段可操作地連接的報導分子編碼序列轉錄的所述調節區的片段。可以利用本領域技術人員眾所周知的各種各樣的報導基因序列，所述報導基因序列包括但不限於編碼螢光蛋白例如綠色螢光蛋白(GFP)、酶(例如CAT、β-半乳糖苷酶、螢光素酶)或抗原標記的基因。為了方便起見，對於本發明的篩選測定，優選通過比色測定或螢光測定而分析的酶報導分子和發光報導分子。在一個實施方案中，例如可以使用一種生物發光蛋白、化學發光蛋白或螢光蛋白作為本發明發光報導分子。不需要底物或輔因子的發光報導分子的類型包括但不限於維多利亞水母(Victoriaaequoria)的野生型綠色螢光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994，Science263802-805)，以及修飾的各種綠色螢光蛋白(Heim等，1995，Nature373663-4；PCT公開說明書WO96/23810)。這種類型報導基因的轉錄與翻譯導致試驗細胞中螢光蛋白的積累，例如，根據本
技術領域：
眾所周知的方法，用一臺螢光計或流式細胞儀，可以測量所述螢光蛋白的積累(參見例如，Lackowicz，1983，PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，PlenumPress，NewYork)。可以使用的另一類型的報導基因是需要輔因子而發光的酶，所述酶包括但不限於Renilla螢光素酶。螢光素酶的其它來源也是本
技術領域：
眾所周知的，包括但不限於哈氏弧菌(Vibrioharveyi)的細菌螢光素酶(luxAB基因的產物)(Karp，1989，Biochim.Biophys.Acta100784-90；Stewart等，1992，J.Gen.Microbiol，1381289-1300)、以及來自螢火蟲Photinuspyralis的螢光素酶(DeWet等，1987，Mol.Cell.Biol.7725-737)；可以根據光的產生而測定它們(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253；Loessner等，1996，Environ.Microbiol.621133-1140；以及SchultzYarus，1990，J.Bacteriol.172595-602)。可以用比色分析法進行分析的報導基因包括但不限於β-半乳糖苷酶(Nolan等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852603-07)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)、螢光素酶(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253)或β-內醯胺酶。在一個實施方案中，所述報導基因序列包含一段編碼LacZ基因產物-β-半乳糖苷酶的核苷酸序列。該酶非常穩定且具有寬廣的特異性，以致於允許使用不同的組織化學底物、生色底物或螢光底物；例如，但不限於5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)、乳糖2，3，5-三苯基-2H-四唑鎓(乳糖-四唑鎓)以及螢光素吡喃型半乳糖苷酶(參見Nolan等，1988，參見上文)。在另一個實施方案中，可使用大腸桿菌(E.coli)β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)的產物(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)作為報導基因。可以用不同的組織化學底物和螢光底物例如X-葡糖苷酸(Xgluc)和4-甲基傘形基葡糖苷酸，來測定GUS的活性。除了例如上面描述的、提供方便比色反應的那些報導基因序列外，可以常規地使用其它報導基因序列，例如可選擇報導基因序列。例如，可利用氯黴素乙醯轉移酶(CAT)的編碼序列，從而導致氯黴素抗性細胞生長物的依賴MN-CA9調節區的表達。對於本領域技術人員，CAT的用途和可選擇報導基因的優點是眾所周知的(Eikmanns等，1991，Gene10293-98)。同樣可利用其它的可選擇報導基因序列，且它們包括但不限於編碼賦予zeocin抗性(Hegedus等，1998，Gene207241-249)或卡那黴素抗性(Friedrich和Soriano，1991，Genes.Dev.51513-1523)之多肽的基因序列。也可以用其它基因，例如毒性基因產物、潛在毒性基因產物、以及抗增殖或抑制細胞之基因的產物。這樣的基因產物的實例包括靶向肝癌細胞的甲胎蛋白(Kuriyama，S.等，CellStructFunct，16503，1991)、用於胃癌的癌胚抗原(CEA)啟動子(Tanaka，T.等，CancerRes，561341，1996)、用於殺傷黑素瘤細胞的酪氨酸酶啟動子(Vile，R.G.等，CancerRes，546228，1994)、用於腦以靶向神經膠質細胞的骨形態發生蛋白(Shimizu，K.NipponRinsho，523053，1994，)、以及用於殺傷骨肉瘤和前列腺癌的骨鈣蛋白啟動子(Ko，S.C.等，CancerRes，564614，1996；Gardner，T.A.等，GeneTherapyandMolecularBiology，241，1998)。在另一個實施方案中，可檢測報導基因多核苷酸或者可以是一種與預先確定的寡核苷酸探針特異性雜交的多核苷酸，或者可以是一種編碼可檢測蛋白的多核苷酸；所述可檢測蛋白包括MN-CA9多肽或其片段或其變異體。對於本領域技術人員，這類測定是眾所周知的(US5,502,176以及US5,266,488)。按照標準的重組DNA技術，可構建MN-CA9驅動的報導基因構成物(參見例如，MethodsinEnzymology，1987，154卷，AcademicPress；Sambrook等，1989，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，NewYork；以及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NewYork，通過引用，將它們中的每一篇全部結合到本文中)。對於本領域技術人員，分析啟動子活性的方法是眾所周知的(參見例如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1989)。可以使用的一種常用方法的實例涉及一種攜帶報導基因和來自MN-CA9基因組序列之基因組序列的重組載體。簡單地說，如果將報導基因置於一種生物活性多核苷酸片段的控制下，則檢測到該報導基因(例如綠色螢光蛋白、螢光素酶、β-半乳糖苷酶或氯黴素乙醯轉移酶)的表達。可以將位於該基因第一個外顯子上遊的基因組序列克隆到任何合適的啟動子報導基因載體中。例如，為了在哺乳動物宿主細胞中表達，可將市場上可以買到的許多載體工程化，以插入本發明的MN-CA9調節區。這樣的載體的非限制性實例為pSEAPBasic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、或pEGFP-1啟動子報導基因載體(pEGFP-1PromoterReportervectors)(Clontech，PaloAlto，CA)、或者pGL2-或pGL3-基本(basic)無啟動子螢光素酶報導基因載體(Promega，Madison，WI)。這些啟動子報導基因載體中的每一種，包含位於報導基因上遊的多克隆位點；所述報導基因即編碼一種可快速分析之蛋白例如分泌型鹼性磷酸酶、綠色螢光蛋白、螢光素酶或β-半乳糖苷酶的報導基因。以兩種取向將MN-CA9基因的調節序列插入到報導基因上遊的克隆位點，並將其引人到合適的宿主細胞中。分析報導基因之蛋白的水平，並將其與用在該克隆位點沒有插入片段的載體獲得的水平相比較。與對照載體相比，含有該插入片段之載體而出現升高的表達水平，則表明在該插入片段中存在啟動子。包含MN-CA9基因調節區的表達載體可另外含有一種編碼可選擇標記的基因。可使用多種選擇系統，所述選擇系統包括但不限於單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(Wigler等，1977，Cell11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)以及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(Lowy等，1980，Cell22817)；可以分別在tk-細胞、hgprt-細胞或aprt-細胞中使用它們。同樣，可以將抗代謝物抗性用作選擇dhfr基因、gpt基因、neo基因以及hygro基因的基礎；dhfr基因賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA773567；O』Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)，gpt基因賦予對黴酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)，neo基因賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)，hygro基因賦予對潮黴素的抗性(Santerre等，1984，Gene30147)。另外的可選擇基因包括trpB、hisD、ODC；trpB允許細胞利用吲哚代替色氨酸，hisD允許細胞利用組氨醇(histinol)代替組氨酸(Hartman和Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)，ODC(鳥氨酸脫羧酶)賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑-2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸即DFMO(McConlogueL.，1987，在CurrentCommunicationsinMolecularBiology中，ColdSpringHarborLaboratory編輯)和穀氨醯胺合成酶(Bebbington等，1992，Biotech10169)抗性。5.2.2.轉錄活性調節片段的特徵鑑定可分析包含MN-CA9基因調節區或其片段的融合構成物的轉錄活性。作為啟動子分析中的第一步，必須按照標準方法(Sambrook等，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，ColdSpringHarborPress)，運用引物延伸分析和/或RNA酶保護分析，來確定在研究之中的腫瘤特異性基因的轉錄起始點(+1位)。通常認為+1位上遊的DNA序列是負責基因調節的啟動子區。但是下遊序列，包括內含子中的序列，也可以參與基因調節。開始測試啟動子活性，可以將-3kb至+3kb的區域(這裡+1為轉錄起始點)克隆到報導基因編碼區的上遊。也可以製備兩種或更多種另外的報導基因構成物，所述構成物包含該調節區的5』和/或3』之截短形式，以幫助鑑定對腫瘤特異性表達負責的區域。基於用途來進行報導基因類型的選擇。在一個優選的實施方案中，使用一種GFP報導基因構成物。在腫瘤特異性基因啟動子的研究中，作為報導分子的綠色螢光蛋白(GFP)的應用是特別有用的。運用GFP作為報導分子的一個主要優點在於這樣的事實，即在剛分離的腫瘤中不需要底物能檢測出GFP。在本發明的另一個實施方案中，使用一種螢光素酶報導基因構成物。至於在轉基因小鼠方面的啟動子分析，已經過優化以供在哺乳動物細胞中表達的GFP是優選的。無啟動子克隆載體pEGFP1(Clontech，PaloAlto，CA)編碼一種經過優化以便在哺乳動物細胞中有更亮的螢光和更高表達的野生型GFP的紅移變異體(Cormack等，1996，Gene17333；Haas等，1996，Curr.Biol.6315)。此外，由於這種增強的GFP(EGFP)的最大激發峰在488nm，因而可運用通常使用的濾光裝置，例如以450-500nm照明的異硫氰酸螢光素(FITC)光學器件，來觀察GFP螢光。對於用轉基因小鼠的啟動子分析，pEGFP1證明作為報導基因載體是有用的(Okabe等，1997，FEBSLett.407313)。在一個替代實施方案中，使用包含其中在螢光素酶報導基因上遊具有一個MN-CA9調節區的轉基因的轉基因小鼠。可以使用本
技術領域：
已知方法製備推定的啟動子片段(通常來自含有8-10kb含所述啟動子區的基因組DNA的親代噬菌體克隆)以供克隆用。在一個實施方案中，例如，將啟動子片段克隆到一種螢光素酶報導基因載體的多克隆位點中。在一個實施方案中，用限制性內切核酸酶切取所述調節區片段，以便插入到該報導基因載體中。然而，這種方法的可行性依賴於該調節片段中合適限制性內切核酸酶位點的可用性。在一個優選的實施方案中，運用具有合適的限制性內切核酸酶切割位點的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR；Saiki等，1988，Science239487)擴增所需要的啟動子片段。在鄰接待擴增調節片段的正向引物和反向引物的5』末端，包括限制性切割所必需的序列。在PCR擴增後，通過限制性消化該PCR產物而產生合適的末端。然後，按照標準的克隆步驟(Sambrook等，1989，參見上文)，將由任一種方法產生的啟動子片段連接到所述報導基因載體的多克隆位點。有人建議在產生轉基因動物之前，應該驗證構成物中PCR產生的啟動子片段的DNA序列。所產生的報導基因構成物將包含位於該報導基因可讀框上遊的推定的啟動子片段，所述報導基因例如GFP或螢光素酶的cDNA。在一個優選的實施方案中，使用下面的方案。用合適的限制性內切核酸酶消化50-100pg的所述報導基因構成物，以釋放出轉基因片段。用一塊含有0.5μg/ml溴化乙錠的1％(w/v)的瓊脂糖凝膠及TAE緩衝液(1x0.04MTris-乙酸鹽，0.001MEDTA，pH8.0)，以5-6V/cm來電泳分離該限制性內切核酸酶切割的產物。用一臺紫外線透射儀，根據大小來確定該轉基因帶；最好用長波紫外燈，以減少在DNA上形成缺口；且仔細地切下含有所需帶的凝膠切片。將該凝膠切片和1ml0.5xTAE緩衝液加到一個已於pH8.0的1mMEDTA中煮沸達10分鐘(Sambrook等，1989，參見上文)的透析袋中，並夾緊透析袋的末端。將包含該凝膠切片的透析袋浸入一個裝有0.5xTAE緩衝液的水平凝膠電泳盒中，並以5-6V/cm將其電泳達45分鐘。在停止該電泳之前，使所述電泳盒中的電流反轉達1分鐘，以釋放可能附著於該透析管之管壁上的DNA。用一個新的微量離心管收集含有從該透析袋電洗脫出的DNA的TAE緩衝液。可以在所述紫外線透射儀上觀測該凝膠切片，以確定該DNA的電洗脫是完全的。靠通過ElutipD柱來進一步純化經電洗脫的DNA樣品。用1-2ml高鹽緩衝液(1.0MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)來預洗滌該柱的填充物質，繼之以用5ml低鹽緩衝液(0.2MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)洗滌一次。用一支5ml注射器，將溶液加到該ElutipD柱上，避免反流。緩慢加載含有經電洗脫的DNA的溶液。用2-3ml的低鹽緩衝液洗滌該柱，並用0.4ml高鹽緩衝液洗脫所述的DNA。添加2倍體積的95％的冷乙醇，以沉澱DNA。用一臺微量離心機，以14,000xg離心10分鐘，來收集該DNA。小心地除去乙醇、不要擾動DNA沉澱。用70％(v/v)的乙醇洗滌該沉澱至少兩次，並將其乾燥。所述的洗滌步驟與乾燥步驟是重要的，因為殘餘的鹽和乙醇對發育中的胚胎是致命的。將該DNA重新懸浮於注射緩衝液(用Milli-Q優質水製備的10mMTM，0.1mMEDTA，pH7.5)中。通過用一臺分光光度計測量在A260(對50μg/ml的DNA，A260＝1)下的光密度，來確定純化的轉基因DNA片段的濃度。用這種方法製備的DNA適合於顯微注射到小鼠的受精卵中。5.2.3用轉基因小鼠的腫瘤特異性啟動子的分析尤其可使用MN-CA9調節區來指導報導分子編碼序列、同源基因或異源基因在轉基因動物中的表達。可以用任何物種的動物來產生轉基因動物，所述動物包括但不限於小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pigs)、山羊、綿羊、以及非人類的靈長目動物例如狒狒、猴和黑猩猩。在用於本文時，術語「轉基因的」是指表達來自不同物種的MN-CA9基因序列的動物(例如表達MN-CA9序列的小鼠)以及已基因工程化從而過量表達內源(即同一物種)MN-CA9序列的動物或已基因工程化而敲除特定序列的動物。在一個實施方案中，本發明提供在所有細胞中攜帶一種在所述MN-CA9調節區或其轉錄活性片段控制下的轉基因的轉基因動物，所述轉基因例如一種報導基因、治療劑和/或毒劑編碼序列；而且提供在某些細胞中而不是所有細胞中攜帶該轉基因的動物，即鑲嵌動物。所述的轉基因可以以單個轉基因的形式，或者可以以多聯體的形式例如頭-頭串聯體或頭尾串聯體整合。例如按照Lasko等所述方法(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236)，也可以選擇性地將所述轉基因引入到一種特定的細胞類型中，並在該特定細胞類型中使其活化。如果希望該轉基因被整合到相應內源基因的染色體位點中，則優選基因尋靶。簡單地說，如果準備使用一種這樣的技術，則設計包含與所述內源基因同源的某些核苷酸序列的載體，以便通過和染色體序列的同源重組而整合到所述內源基因的核苷酸序列中，且破壞該內源基因之核苷酸序列的功能。可以用本領域中已知的任何技術，將在MN-CA9調節區控制下的轉基因引入到動物中，從而產生轉基因動物的建立者系。這樣的技術包括但不限於前核顯微注射(Hoppe和Wagner，1989，第4,873,191號美國專利)；將來自被誘導至靜息的培養的胚胎細胞、胎兒細胞或成體細胞之核，核轉移到去核卵母細胞中(Campbell等，1996，Nature38064-66；Wilmut等，Nature385810-813)；將反轉錄病毒基因轉移到種系中(VanderPutten等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152)；胚胎幹細胞中的基因尋靶(Thompson等，1989，Cell65313-321)；胚胎的電穿孔(Lo，1983，Mol.Cell.Biol.311803-1814)；以及精子介導的基因轉移(Lavitrano等，1989，Cell57717-723；參見Gordon，1989，TransgenicAnimals，Intl.Rev.Cytol.115171-229)。例如，為了顯微注射受精卵，則從所述報導基因構成物中切割出一段包含該調節區、報導基因以及聚腺苷酸化信號的線性DNA片段(轉基因)。用本
技術領域：
已知的方法，可通過凝膠而純化所述的轉基因；例如用電洗脫的方法。在凝膠片段的電洗脫之後，靠通過ElutipD柱(SchleicherSchuell，Dassel，德國)而進一步除去微量的任何雜質。在一個優選的實施方案中，按照標準方法(Hogan，1986，ManipulatingtheMouseEmbryo，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，將純化的轉基因片段顯微注射到得自B6CBA雌鼠的受精卵的雄性前核中。在幾個胚胎階段，短暫地分析小鼠；或者，通過建立允許更詳細分析整個發育過程中以及成年動物中轉基因表達的建立者系，來短暫地研究小鼠。按照Vemet等的方法(MethodsEnzymol.1993；225434-451)，用純化自胎盤(瞬時)或尾剪取部分(建立者)的基因組DNA，通過PCR，來分析轉基因的存在。最好在包含1X反應緩衝液中的1μg基因組DNA的100μl體積中，進行所述的PCR反應，所述1X反應緩衝液中還補充有0.2mMdNTPs、2mMMgCl2、各600μM的引物以及2.5單位的Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)。30次PCR循環中的每次包括在94℃變性1分鐘、在54℃退火1分鐘以及在72℃延伸1分鐘。然後，使建立者小鼠與C57B1配偶交配，從而產生小鼠的轉基因F1系。5.3篩選測定幹擾腫瘤發生和/或癌症發展的化合物，可在不同癌症中提供靶向缺陷的治療。可用這樣的化合物來幹擾各種各樣癌症的開始或發展。也可以用激發或抑制啟動子活性的化合物來改善癌症的症狀。可以將含有與報導基因可操作地連接的MN-CA9調節區或其片段的基因工程化的細胞、細胞系、癌細胞和/或轉基因動物，用作篩選調節MN-CA9轉錄活性之藥物的系統。另外，包含MN-CA9的轉基因小鼠可提供在體內和體外的實驗模型，以研究出通過使藥物定向而引起疾病發展的停滯、來治療包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌的各種各樣癌症的新方法。本發明包括設計用以鑑定調節所述MN-CA9調節區活性之化合物的篩選測定。本發明不僅包括體外和基於細胞的分析，而且包括轉基因動物中的體內分析。正如在下文描述的，待測試的化合物可包括但不限於寡核苷酸、肽、蛋白、小的有機化合物或無機化合物、抗體等等。化合物的實例可包括但不限於肽，例如可溶性肽，包括但不限於Ig尾融合蛋白和隨機肽文庫的成員；(參見例如，Lam等，1991，Nature35482-84；Houghten等，1991，Nature35484-86)；以及由D-構型和/或L-構型胺基酸構成的組合化學衍生分子文庫；磷酸肽(包括但不限於隨機或部分簡併的定向磷酸肽文庫的成員；參見例如Songyang等，1993，Cell72767-778)；抗體(包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體，以及FAb、F(ab』)2和FAb表達文庫的片段，以及其結合表位的片段)及小的有機分子或無機分子。這樣的化合物還可包括已知改善不同癌症症狀的化合物，尤其是藥物或者藥類或藥系列的成員。這樣的化合包括但不限於抗抑鬱藥系列，例如鋰鹽、卡馬西平、丙戊酸、麥角醯二乙胺(LSD)、對氯苯丙氨酸、例如FLA63的對丙基多巴乙醯胺二硫代氨基甲酸鹽(p-propyldopacetamidedithiocarbamate)衍生物；抗焦慮藥，例如地西泮；單胺氧化酶(MAO)的抑制劑，例如異丙煙肼、氯吉蘭、苯乙肼和異卡波肼；生物必需胺攝取阻滯劑，例如像地昔帕明、米帕明和阿米替林之類的三環抗抑鬱藥；5-羥色胺重攝取的抑制劑，例如氟西汀；抗精神病藥，例如酚噻嗪衍生物(例如氯丙嗪(鹽酸氯丙嗪)和三氟丙嗪)、丁醯苯(例如氟哌啶醇(Haldol))、噻噸衍生物(例如氯丙硫蒽)以及二苯並二氮類(例如氯氮平)；苯並二氮類；多巴胺能激動劑和拮抗劑，例如L-DOPA、古柯鹼、苯丙胺、α-甲基酪氨酸、利血平、丁苯喹嗪、benzotropine、帕吉林；去甲腎上腺素能激動劑和拮抗劑，例如可樂定、酚苄明、酚妥拉明、環庚三烯酚酮；硝基血管舒張藥(例如硝酸甘油、硝普鹽以及NO合酶)；以及生長因子(例如VEGF、FGF、血管形成素(angiopoetins)和endostatin)。在一個優選的實施方案中，可以用含有與異源基因可操作地連接的MN-CA9調節區的基因工程細胞、細胞系或生殖細胞和/或體細胞的原代培養物，來開發分析系統，以篩選能抑制序列特異性的DNA-蛋白相互作用的化合物。這樣的方法包括使一種化合物與表達在MN-CA9調節區或其活性轉錄片段控制下的基因的細胞接觸，測定該基因表達水平或基因產物活性水平，並將一水平與在沒有該化合物的情況下所述細胞產生的基因表達水平或基因產物活性水平相比較，因此如果在存在該化合物的情況下得到的所述水平不同於沒有該化合物的情況下獲得的水平，則鑑定出了能夠調節MN-CA9調節區的表達的化合物。基因表達水平的改變可按照本領域技術人員已知的許多方法來測定，例如通過測定報導基因的活性，分析細胞裂解物中的mRNA轉錄物，例如通過用RNA印跡分析或其它本
技術領域：
已知的方法，來分析由所述細胞表達的基因產物。在另一個實施方案中，可使用顯微解剖和透照。這些技術提供一種用於在包含MN-CA9調節區驅動的報導基因之轉基因動物中監測所推定藥物對腫瘤細胞的作用的一種快速測定。在這個實施方案中，用各種各樣方法中的任一種，將一種試驗藥物傳遞給轉基因動物。引入一種試驗藥物的方法可包括口服、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內給藥以及通過劃破(劃穿皮膚上層而，例如用一種叉狀針)或其它任一的標準給藥途徑。通過顯微解剖和透照所述的腫瘤細胞，可分析這樣的試驗化合物對腫瘤細胞的作用。如果在存在所述化合物的情況下，所觀測或測定的報導基因的表達水平不同於當該化合物不存在時所得到的水平，則鑑定出了能夠調節MN-CA9調節區之表達的化合物。在本發明不同的實施方案中，可以用於篩選腫瘤相關疾病之調節物的化合物包括可能具有結合MN-CA9調節區能力並因此可能是藥物的候選物的天然存在和/或合成的(例如小分子文庫或肽文庫)肽、小分子；細胞結合分子或者可溶分子、有機分子、非蛋白分子以及重組分子。另一方面，所述蛋白和化合物包括在體內與MN-CA9調節區序列相互作用的細胞內源組分。可以在細胞裂解物或組織勻漿中篩選與MN-CA9調節區或其片段結合的蛋白或其它化合物。這樣的內源組分可為藥物幹預和治療幹預提供新的靶。在一個實施方案中，可篩選文庫。可以用本
技術領域：
已知的許多文庫，例如肽文庫、化學合成文庫、重組體文庫(例如噬菌體展示文庫)、以及基於體外翻譯的文庫。在本發明的一個實施方案中，可以用肽文庫來篩選與MN-CA9連接的報導基因表達的激動劑或拮抗劑。可以用多樣性的文庫例如隨機或組合肽文庫或非肽文庫，來篩選特異性地調節MN-CA9調節區活性的分子。可使用連接到一種固相支持物上的、包括所有可能之胺基酸組合的隨機肽文庫，來鑑別能夠激活或抑制調節區之活性的肽(Lam，K.S.等，1991，Nature35482-84)。篩選肽文庫在發現通過與啟動子區相互作用而激發或抑制MN-CA9之表達的藥物方面，可能具有治療價值。在下述文獻中，描述了化學合成文庫的實例Fodor等，1991，Science251767-773；Houghten等，1991，Nature35484-86；Lam等，1991，Nature35482-84；Medynski，1994，BioTechnology12709-710；Gallop等，1994，J.MedicinalChemistry37(9)1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA911614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011708-11712；PCT公布號WO93/20242；以及Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383。在下述文獻中，描述了噬菌體展示文庫的實例Scott和Smith，1990，Science249386-390；Devlin等，1990，Science249404-406；Christian等，J.Mol.Biol.227711-718；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152149-157；Kay等，1993，Gene12859-65；以及於1994年8月18日公布的PCT公布號WO94/18318。作為非肽文庫的實例，一種苯並二氮雜文庫(參見例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712)適合於使用。也可以使用類肽(peptiod)文庫(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA899367-9371)。Ostresh等描述了另一個可使用的文庫的實例(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111138-11142)，在所述文庫中，全甲基化了肽中的醯胺官能團，從而產生一種化學轉變組合文庫(chemicallytransformedcombinatoriallibrary)。在下面，描述了一種這樣的體外篩選測定的具體實施方案。運用所述MN-CA9調節區-報導基因載體來產生轉基因小鼠，由所述轉基因小鼠建立MN-CA9調節區-報導基因載體生殖細胞的原代培養物。用適合於所述細胞系的培養基，在96孔板上，每孔接種總體積100μl中的大約10000個細胞。將MN-CA9基因表達的候選抑制劑添加到所述細胞上。通過測定由MN-CA9調節區驅動的報導基因的反應，可確定MN-CA9基因活化之抑制劑的效應。這種測定能夠容易地以高通量篩選方式建立，以供在96孔板中評價降低(或增加)報導基因活性、但無細胞毒性的化合物文庫。在溫育6小時後，向所述細胞添加100μl的DMEM培養基+2.5％胎牛血清(FBS)至1.25％的血清終濃度；將其溫育達總計24小時(另加18小時)。在24小時之時，用PBS洗滌所述板，且將其吸乾並於-80℃冷凍。第二天，融化所述板，並分析所述板上報導基因活性的存在。在一個體內篩選測定的優選實施例中，可以將來源於轉基因小鼠的腫瘤細胞移殖到具有正常表型或其它所需表型的小鼠中(Brinster等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111298-302；Ogawa等，1997，Int.J.Dev.Biol.41111-12)。然後，可將這樣的小鼠用來試驗所述化合物和其它各種因子對腫瘤相關疾病的效應。除了上面列舉的化合物和因子外，可以用這樣的小鼠來分析用其它方法可能難以研究的因素或條件；例如飲食效應、內部pH、溫度等等。一旦鑑別出了抑制或增強MN-CA9調節區活性的化合物，就可以在一項基於動物的測定中測試，以確定該化合物是否顯示出作為改善包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌的各種各樣癌症症狀之藥物的能力。首先可根據小規模(即在試管中)測定來優化本發明的測定，然後將其按比例擴大到高通量測定。運用純化的組分或細胞裂解物，可以在體外即在試管中進行本發明的篩選測定。也可以用培養物中完整的細胞以及用動物模型進行本發明的篩選測定。按照本發明，將用培養的細胞以及動物模型來進一步體內分析在體外顯示出調節MN-CA9調節區活性的、如同本文所描述的試驗化合物，以確定是否該試驗化合物在體內具有類似的作用，且確定所述試驗化合物對各種各樣癌症的效應。5.4用於MN-CA9調節區核苷酸的治療應用的組合物和方法可以用MN-CA9多核苷酸或其轉錄活性片段，來治療可以通過以腫瘤特異性方式改變MN-CA9或與MN-CA9調節區連接之異源基因的水平或表達得以改善的疾病、病症或紊亂。本文描述了用於這種治療性治療的方法。在基因治療方案中，可使用所述MN-CA9調節區來達到組織特異性表達。在這樣的細胞是腫瘤細胞的情況下，可以以特異性靶向包含MN-CA9表達所需反式作用因子之腫瘤細胞的癌基因治療形式，應用MN-CA9調節區對細胞毒性產物的誘導。這樣，所述MN-CA9調節區可作為一種針對各種各樣表達MN-CA9蛋白之癌的基因治療方法的給藥途徑。這些癌症的實例包括但不限於腎細胞癌、胃癌、結腸癌以及宮頸癌。另外，運用目前描述的表達構成物，可以將反義核酸、反基因(antigene)適體(Aptameric)寡核苷酸傳遞到細胞中。也可以在細胞中表達核酶或單鏈RNA，從而抑制一種所關注靶基因的表達。這些反義核酸或核酶分子的靶基因應該是編碼細胞維持所必需的基因產物的那些基因。為了各種各樣的目的，例如，為了減量調節MN-CA9基因表達，或者，另一方面，為了實現異源基因的腫瘤特異性、階段特異性表達；可使用本發明的MN-CA9調節區及其轉錄活性片段。在一個實施方案中，例如，可以靶向內源MN-CA9調節區，以特異性減量調節MN-CA9基因的表達。例如，可以設計互補於所述調節區的寡核苷酸，並將其傳遞到細胞中。這樣的寡核苷酸可以退火到該調節序列上而阻止轉錄激活。另一方面，可以將該調節序列或其部分以飽和濃度傳遞到細胞中，從而競爭結合轉錄因子。關於基因治療方法的一般綜述，參見Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11155-215。在Ausubel等(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology1993，JohnWileySons，NY中以及在Kriegler，1990，GeneTransferandExpression(ALaboratoryManual，StocktonPress，NY中，描述了本領域通常已知的可使用的重組DNA技術的方法。在另一個實施方案中，提供一種用於改善各種各樣癌症的基因治療方法。使用MN-CA9調節區序列來驅動藥物或毒素的腫瘤特異性表達，並將所述序列引入到腫瘤中。該方法包括將與一種藥物或毒素基因可操作相連的MN-CA9調節區序列引入到腫瘤中。在再一個實施方案中，本發明提供一種用於治療癌症或其它增生性疾病的基因治療方法。用MN-CA9調節區來指導一種或更多種蛋白特異性地在患者腫瘤細胞中表達。這樣的蛋白例如可以是腫瘤抑制基因、胸苷激酶(與無環鳥苷聯用)、參與細胞殺傷的毒素或蛋白例如參與細胞程序死亡途徑的蛋白。在一個實施方案中，本發明提供一種可用於毒性基因治療的、包含MN-CA9啟動子的治療藥。這種方法包括一種真核傳遞載體和一種毒性基因。在一個優選實施方案中，該載體為腺病毒(Ad)，且該基因為胸苷激酶(TK)。因此，該治療物用式Ad-MN-CA9-TK表示，但實際上，在本文中包含的所述新概念是作為異源編碼序列的癌特異性表達的驅動力的MN-CA9啟動子。可以將編碼所關注的翻譯或轉錄產物的DNA，基因重組到確保大規模複製所述DNA以供製備本發明載體的各種各樣的載體系統中。可設計這些載體，使其包含對於指導由癌細胞吸收的DNA序列轉錄和/或翻譯必需的元件。可使用的載體包括但不限於衍生於重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA的那些載體。例如，可使用諸如pBR322、pUC19/18、pUC118、119以及M13mp系列載體之類的質粒載體。噬菌體載體可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R以及EMBL系列的噬菌體載體。可使用的粘粒載體包括但不限於pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16以及卡隆粒9系列的載體。也可以使用便於RNA體外轉錄的載體，例如SP6載體，以產生大量的、可被插入到病毒載體中的RNA。另一方面，可以將有複製能力或無複製能力的重組病毒載體工程化，所述病毒載體包括但不限於衍生於病毒例如皰疹病毒、反轉錄病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或牛乳頭瘤病毒的那些載體。雖然可使用整合型載體；但對於非疾病相關修復和再生而言，優選不遺傳所述基因產物到子細胞達許多代的非整合型系統。這樣，該基因產物在修復過程期間表達，而在後代中因為該基因被稀釋，因而表達的基因產物量減少。當病毒介導的基因傳遞導致正常細胞被感染時，驅動治療基因表達的組織特異性啟動子的應用會另外減弱治療基因對鄰近正常細胞的毒性作用。這會是特別重要的，在此或許能利用系統給藥而傳遞一種治療載體遍及全身、卻將轉基因的表達維持在有限及特定數目的細胞類型。此外，由於例如TGF-β的許多骨生長因子具有多效性作用，因而如果在所有細胞中表達該生長因子，則可能會顯示出許多有害的副作用。在某些情況下，所述啟動子元件可以是組成型啟動子或誘導型啟動子；且可以在合適的條件下使用它們，以指導所關注基因的高水平表達或可調型表達。組成型啟動子控制下的基因表達則不需要存在特定的底物來誘導基因表達，且基因表達將發生於細胞生長的所有條件下。比較起來，由誘導型啟動子控制的基因表達則對誘導劑的存在或不存在有反應。例如，如果用一種誘導型的治療性轉基因穩定地轉染細胞，則在該個體的生存期內有可能控制轉基因的表達。對於所插入的蛋白編碼序列的充分翻譯，同樣需要特定的起始信號。這些信號包括起始密碼子ATG以及鄰近的序列。在將包含起始密碼子及鄰近序列的整個編碼序列插入到合適的表達載體中的情況下，可以不需要另外的翻譯控制信號。但是，在僅插入編碼序列的一部分的情況下，則必須提供包括起始密碼子ATG的外源性翻譯控制信號。此外，該起始密碼子必須符合所述蛋白編碼序列的可讀框，從而確保整個插入片段的翻譯。這些外源性翻譯控制信號和起始密碼子可具有各種各樣的起源；所述起源既包括天然的起源，又包括合成的起源。通過包含轉錄衰減序列、增強子元件等等，可提高表達的效率及增強對表達的控制。在本發明的另一個實施方案中，提供一種用於治療癌症和其它增生性疾病的方法，所述方法包括傳遞一種治療劑到腫瘤中。所述治療劑包括一種含有MN-CA9啟動子驅動的毒性胸苷激酶(Tk)的重組腺病毒載體(Ad)。本發明另外的一個方面，提供一種藉助於添加合適的前體藥物來調節Tk表達的方法；所述前體藥物包括但不限於無環鳥苷(AcV)。在存在一種合適的前體藥物的情況下，可以將含所述MN-CA9啟動子驅動的毒性基因治療的治療劑給予癌；所述癌包括但不限於宮頸癌、腎細胞癌以及胃癌和結腸癌。在再一個實施方案中，所述MN-CA9調節區可編碼各種各樣的、具有免疫調節功能的基因和/或其它基因；所述具有免疫調節功能的基因例如編碼細胞因子如白細胞介素，包括白細胞介素1至15在內，尤其是例如IL2、IL12；γ-幹擾素；腫瘤壞死因子；GMCSF；所述其它基因例如為在WO88/00971(CSIRO，AustralianNationalUniversityRamshaw等)和WO94/16716(VirogeneticsCorp；Paoletti等)的說明書中所提到的那些基因。本發明的MN-CA9調節區也可編碼下面的基因幹擾素α、幹擾素β或幹擾素γ的基因；腫瘤壞死因子的基因；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的基因、巨噬細胞集落刺激因子(N-CSF)的基因，例如嗜中性白細胞激活蛋白NAP、巨噬細胞趨化及激活因子MCAF、RANTES、巨噬細胞炎性肽MIP-1a與MIP-1b的趨化因子的基因、補體組分及其受體的基因，例如87.1、87.2、ICAM-1.2或3的輔助分子的基因，或者細胞因子受體的基因。在插入編碼不止一種免疫調節蛋白的核苷酸序列的情況下，它們可包括不止一種細胞因子，或者可以是細胞因子與輔助分子的組合。5.4.1反義核酸調節法、核酶調節法以及三股螺旋調節法在另一個實施方案中，通過用眾所周知反義核酸法、基因「敲除」法、核酶法和/或三股螺旋法來降低MN-CA9調節區的表達水平，從而降低MN-CA9調節區活性的水平，可改善與腫瘤細胞有關的病症、紊亂或疾病的症狀。在可能顯示出調節MN-CA9調節區的活性、表達或合成之能力、包括改善不同癌症及相關疾病的症狀之能力的化合物中，有反義分子、核酶分子和三股螺旋分子。可以設計這樣的分子，來減少或抑制未受損的或變異的(如果合適)MN-CA9調節區的活性。對於本領域技術人員而言，生產和使用這樣分子的技術是眾所周知的。反義RNA和DNA分子通過雜交到靶mRNA上並且阻止蛋白質翻譯而直接阻斷mRNA翻譯。反義方法牽涉到設計與靶基因之mRNA互補的寡核苷酸。所述反義寡核苷酸將結合到互補的靶基因之mRNA轉錄物上，從而阻止翻譯。雖然優選完全的互補，但並不需要完全互補。正如在本文中提到的，一種「互補」於RNA一部分的序列意指具有足夠的互補性而能夠與該RNA雜交形成穩定雙鏈體的序列；因此，在雙鏈反義核酸的情況下，可測試雙鏈體DNA的一條鏈，或可以分析三鏈體形成。雜交的能力將既取決於互補的程度，又取決於反義核酸的長度。通常，雜交核酸越長，它可容納的與一種RNA的鹼基錯配則越多，且仍可形成穩定的雙鏈體(或三鏈體，視情況而定)。通過用標準方法確定雜交複合體的解鏈溫度，本領域技術人員能確定容許錯配的程度。在一個實施方案中，能夠在一種反義方法中運用互補於所關注基因之非編碼區的寡核苷酸，來抑制內源mRNA的翻譯。反義核酸應該至少長六個核苷酸，最好是長度範圍從6至約50個核苷酸的寡核苷酸。在具體的方面，所述寡核苷酸為至少10個核苷酸、至少17個核苷酸、至少25個核苷酸或至少50個核苷酸。無論選擇何種靶序列，優選首先進行體外研究，以定量測定反義寡核苷酸抑制靶基因表達的能力。優選這些研究使用鑑別寡核苷酸的基因反義抑制和非特異性生物學效應的對照。同樣優選的是，這些研究將靶RNA或蛋白的水平與內部對照RNA或蛋白的水平相比較。另外，設想將用反義寡核苷酸獲得的結果與用對照寡核苷酸獲得的結果相比較。優選的是對照寡核苷酸與所述試驗寡核苷酸具有大致相同的長度，且對照寡核苷酸的核苷酸序列與反義序列的差異僅僅是防止特異性地雜交到所述靶序列上所必需的差異。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或其衍生物或其修飾形式，可以是單鏈或者雙鏈。可以在鹼基部分、糖部分或磷酸主鏈上修飾所述的寡核苷酸，從而例如改善所述分子的穩定性、雜交等等。該寡核苷酸可包括其它的附加基團，例如肽(例如，用於在體內靶向宿主細胞受體)，或有助於穿過細胞膜(參見例如，Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A84648-652；1988年12月15日公開的WO88/09810號PCT公開說明書)或者穿越血腦屏障(參見例如1988年4月25日公開的WO89/10134號PCT公開說明書)轉運的因子，或雜交觸發切割因子(參見例如，Krol等，1988，BioTechniques6958-976)，或嵌入劑(參見例如，Zon等，1988，Pharm.Res.5539-549)。為此，可以將寡核苷酸綴合到另一種分子上，所述另一種分子例如肽、雜交觸發交聯劑、轉運因子、雜交觸發切割劑等等。所述反義寡核苷酸可包括至少一個經修飾的鹼基部分，所述鹼基部分選自5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5』-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2，6-二氨基嘌呤。所述反義寡核苷酸也可以包括至少一種選自以下的經修飾的糖部分包括但不限於阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在又一個實施方案中，所述反義寡核苷酸包括至少一種經修飾的、選自以下的磷酸主鏈硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、以及formacetal或其類似物。再又一個實施方案中，所述反義寡核苷酸為一種α-端基異構寡核苷酸。α-端基異構寡核苷酸與互補的RNA形成特殊的雙鏈雜合體，在所述雙鏈雜合體中，與通常的β-單位相反，鏈相互平行地伸展(Gautier等，1987，Nucl.AcidsRes.156625-6641)。該寡核苷酸是一種2』-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.AcidsRes.156131-6148)，或是一種嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215327-330)。可以用本
技術領域：
已知的標準方法，例如通過用一臺DNA自動合成儀(例如市售的，來自Biosearch、AppliedBiosystems)，來合成本發明的寡核苷酸。作為實例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.AcidsRes.163209)，來合成硫代磷酸寡核苷酸；通過用可控孔隙的玻璃聚合體支持物，可製備甲基膦酸寡核苷酸(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A857448-7451)；等等。雖然能夠用互補於靶基因編碼區序列的反義核苷酸，但最優選互補於轉錄的非翻譯區的那些反義核苷酸。應該將反義分子傳遞到體內表達所述靶基因的細胞之中。已發展了許多用於傳遞反義DNA或RNA至細胞的方法，例如，可以將反義分子直接注射到組織部位裡，或者，可系統地給予設計用於靶向所需細胞的經修飾的反義分子(例如，與特異性結合靶細胞表面上表達的受體或抗原之肽或抗體相連接的反義分子)。一種達到足以抑制內源mRNA翻譯的反義分子胞內濃度的優選方法利用一種重組DNA構成物；在所述構成物中，反義寡核苷酸被置於強啟動子polIII或polII的控制之下。用這樣的構成物來轉染患者體內的靶細胞，將導致足夠量的、將與內源靶基因轉錄物形成互補鹼基對因此阻止靶基因之mRNA翻譯的單鏈RNA的轉錄。例如，可引入一種載體，以致於例如該載體被細胞吸收，並且指導反義RNA的轉錄。只要這樣的載體能被轉錄而產生所需的反義RNA，則它可以以附加體保持，或成為染色體整合的。用本領域標準的重組DNA技術方法，可構建這樣的載體。載體可以是用於在哺乳動物細胞中複製與表達的質粒、病毒載體或本
技術領域：
已知的其它載體。用本
技術領域：
已知在哺乳動物細胞中且最好在人細胞中起作用的任何啟動子，可以進行編碼反義RNA序列的表達。這樣的啟動子可以是誘導型或組成型的。這樣的啟動子包括但不限於SV40早期啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-310)、勞斯肉瘤病毒的包含於3』長末端重複序列中的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)等等。可以用任何類型的質粒、粘粒、YAC或病毒載體，來製備能被直接引入到所述組織部位中的重組DNA構成物。另一方面，可以用選擇性感染所需組織的病毒載體，在這種情況下，可以由別的途徑來完成給予(例如經靜脈內給予、口服給予或諸如此類的系統給予)。也可以用設計用以催化切割靶基因之mRNA轉錄物的核酶分子，來阻止靶基因之mRNA的翻譯，且因此阻止靶基因產物的表達(參見例如，1990年10月4日公開的PCT國際公布說明書WO90/11364；Sarver等，1990，Science2471222-1225)。核酶是能夠催化特異性切割RNA的酶性RNA分子。(有關綜述，參見Rossi，1994，CurrentBiology4469-471)。核酶作用的機制涉及核酶分子與互補靶RNA的序列特異性雜交和隨後的內切核酸切割事件。核酶分子的組成必須包括一段或更多段互補於靶基因之mRNA的序列，且必須包括眾所周知的負責切割mRNA的催化序列。對於這一序列，參見例如5,093,246號美國專利；通過引用，將其全部結合到本文中。雖然可以用在特異性識別位點切割mRNA序列的核酶，來破壞靶基因的mRNA；但優選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在與靶mRNA形成互補鹼基對的側翼區所限定的位置上切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下面的兩個鹼基的序列5』-UG-3』。錘頭狀核酶的結構及產生是本
技術領域：
眾所周知的，且在下述文獻中有更全面的描述Myers，1995，MolecularBiologyandBiotechnologyAComprehensiveDeskReference，VCHPublishers，NewYork，(尤其參見第833頁的圖4)，以及Haseloff和Gerlash，1998，Nature，334585-591；通過引用，將所述文獻全部結合到本文中。最好將核酶工程化，以便使切割識別位點位於靶基因之mRNA的5』末端附近；即提高效率且將細胞內無功能mRNA轉錄物的積累減至最小量。本發明的核酶也包括RNA內切核酸酶(在下文稱為「Cech型核酶」)，例如天然存在於嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中的且已被ThomasCech及合作者多方面描述的一種RNA(稱為IVS或L-19IVSRNA)內切核酸酶(Zaug等，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug等，1986，Nature，324429-433；已公布的UniversityPatentsInc.的WO88/04300號國際專利申請；Been和Cech，1986，Cell，47207-216)。Cech型核酶具有一個八個鹼基對的活性位點，所述活性位點與靶RNA序列雜交，在所述雜交後發生靶RNA的切割。本發明包括那些靶向存在於靶基因中的八個鹼基對活性位點之序列的Cech型核酶。與在反義方法中一樣，所述核酶可由經修飾的寡核苷酸組成(例如為了改善穩定性、尋靶等等)，且應該將其傳遞到體內表達靶基因的細胞之中。一種優選的傳遞方法涉及使用一種在組成型強啟動子polIII或polII控制下「編碼」核酶的DNA構成物，以致轉染的細胞將產生足夠量的核酶來破壞內源靶基因信息而抑制翻譯。因為核酶不同於反義分子，是催化性的，所以由於其效率而需要較低的細胞內濃度。也可以通過用定向同源重組，來使靶基因或其啟動子失活、或「剔除」靶基因或其啟動子，從而減少內源靶基因的表達(例如參見Smithies等，1985，Nature317230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell51503-512；Thompson等，1989，Cell5313-321；通過引用，將它們中的每篇全部結合到本文中)。例如，可以用一種帶有或沒有一種選擇標記和/或一種負選擇標記的、鄰接與內源靶基因(或者靶基因的編碼區、或者靶基因的調節區)同源的DNA的變異型無功能靶基因(或一種完全不相關的DNA序列)，來轉染在體內表達靶基因的細胞。通過定向同源重組插入DNA構成物，導致所述靶基因失活。這樣的方法特別適合於農業領域；在所述農業領域中，修飾ES(胚胎幹)細胞可以被用來產生具有無活性靶基因的動物後代(例如參見Thomas和Capecchi，1987以及Thompson，1989，參見上文)。但是，如果用合適的病毒載體，來直接給予所述重組DNA構成物，或使重組的DNA構成物靶向體內所要求的位點；則可以使這種方法適合於人類使用。另一方面，可通過把互補於靶基因調節區的脫氧核糖核酸序列(即靶基因的啟動子和/或增強子)作為靶，來形成在體內靶細胞中阻止靶基因轉錄的三鏈螺旋結構，而減少內源靶基因的表達。(通常參見Helene，1991，AnticancerDrugDes.，6(6)569-584；Helene等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66027-36；以及Maher，1992，Bioassays14(12)807-815)。待用於形成三鏈螺旋以抑制轉錄的核酸分子應該是單鏈的且應該由脫氧核糖核酸組成。必須設計這些寡核苷酸的鹼基組成，以促進藉助於鹼基配對法則的三鏈螺旋的形成；這通常需要存在於雙鏈體之一條鏈上的相當大的嘌呤或嘧啶序列段。核苷酸序列可以是基於嘧啶的序列，這將產生橫過所得到的三鏈螺旋之三條相聯鏈的TAT和CGC+三聯體。富含嘧啶的分子提供與雙鏈體中平行於該嘧啶鏈的一條單鏈上之富含嘌呤區的鹼基互補性。另外，可以選擇富含嘌呤例如含有一段G殘基的核酸分子。這些分子將和富含GC對的DNA雙鏈體形成三鏈螺旋，在該三鏈螺旋中，大部分嘌呤殘基位於靶雙鏈體的一條鏈上，產生橫過三鏈螺旋中的三條鏈的GGC三聯體。另一方面，通過產生一種所謂的「之字形(switchback)」核酸分子，可增加可以作為靶以供三鏈螺旋形成的潛在序列。以一種交替的5』-3』、3』-5』的方式，來合成之字形分子；這樣以使它們首先與雙鏈體的一條鏈進行鹼基配對，然後與另一條鏈進行鹼基配對；從而省去了對雙鏈體之一條鏈上存在相當大的嘌呤或嘧啶序列段的需要。在利用本文描述的反義分子、核酶分子和/或三鏈螺旋分子來抑制變異基因表達的情況下，可能是所述技術可如此有效地減少或抑制由正常靶基因之等位基因產生的mRNA的轉錄(三鏈螺旋)和或翻譯(反義分子、核酶)，以致存在的正常靶基因產物的濃度可能低於正常表型所必需濃度的可能性可能上升。因此，在這樣的情況下，為了確保維持靶基因活性的大體上正常的水平，可通過基因治療的方法，將編碼和表達顯示正常靶基因活性之靶基因多肽的核酸分子引入到細胞中；所述基因治療的方法例如在下面5.4.2節中描述的不包含對正在使用反義分子、核酶或三鏈螺旋處理的任何一種敏感之序列的那些方法。另一方面，在靶基因編碼一種胞外蛋白的情況下，為了維持必要的靶基因活性水平，共給予正常的靶基因蛋白也許是優選的。用正如上面討論的、本
技術領域：
已知的、用於DNA和RNA分子合成的任何方法，可製備本發明的反義RNA和反義DNA、核酶以及三鏈螺旋分子。這些方法包括本領域眾所周知的化學合成寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技術，諸如例如固相亞磷醯胺化學合成法之類的技術。另一方面，通過在體外和體內轉錄編碼反義RNA分子的DNA序列，可產生RNA分子。可以將這樣的DNA序列插入到各種各樣的、含有合適RNA聚合酶啟動子例如T7或SP6聚合酶啟動子的載體中。另一方面，可以將組成型或誘導型地合成反義RNA的反義cDNA構成物穩定引入到細胞系中；所述的組成型或誘導型取決於所用的啟動子。5.4.2基因替代治療可使用在上面5.1節中描述的本發明的核酸序列來轉移重組核酸序列到細胞之中，且在受體細胞中表達所述的序列。可以使用這樣的技術，例如將其用於標記細胞、或用來治療各種各樣的癌症和相關疾病。這種治療可以是以基因替代治療的形式。具體地講，可以用載體將指導顯示正常基因功能之基因產物生產的正常基因或所述基因一部分的一個或更多個拷貝引入到患者體內的合適細胞中；所述載體除了例如脂質體的將DNA引入到細胞中的其它粒子之外，包括但不限於腺病毒載體、腺伴隨病毒載體以及反轉錄病毒載體。將基因引入到哺乳動物細胞中以供表達的方法是本領域眾所周知的。通常，對於這樣的基因治療方法，則直接將核酸體內給予到一種表達MN-CA9調節區的靶細胞或轉基因小鼠中；其中所述MN-CA9調節區可操作地連接於一種異源編碼序列。用本
技術領域：
已知的任一方法，可完成這一步；例如，通過將其構建為合適的核酸表達載體之一部分，且將其給予，以致它成為細胞內的；例如通過用一種缺陷型或減毒型反轉錄病毒載體或其它病毒載體感染(參見4,980,286號美國專利)；通過直接注射裸露的DNA；通過用微粒轟擊(例如，一種基因槍；Biolistic，Dupont)；通過用脂質、細胞表面受體或轉染劑包被；通過包封於脂質體、微粒或微囊中；通過以連接到一種已知進入細胞核的肽上的方式給予所述核酸；或者通過以連接到一種易受受體介導的胞吞作用之配體上的方式，給予所述的核酸(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，這可被用來靶向特異性表達所述受體的細胞類型。在另一個實施方案中，可形成核酸-配體複合體，在所述複合體中，所述配體包含一種病毒基因融合肽以破壞內體，從而允許該核酸避免溶酶體的降解。在再一個實施方案中，通過靶向特異性受體，可使所述核酸在體內定向，供細胞特異性吸收及表達(參見例如，1992年4月16日公布的PCT公開說明書WO92/06180，1992年12月23日公布的PCT公開說明書WO92/22635，1992年11月26日公布的PCT公開說明書WO92/20316，1993年7月22日公布的PCT公開說明書WO93/14188，1993年10月14日公布的PCT公開說明書WO93/20221)。另一方面，可以將所述核酸引入細胞內，並通過同源重組使其在宿主細胞DNA內插入，而用於表達(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342435-438)。因為可以在腦中表達本發明的核酸，所以這樣的基因替代治療技術理應能夠傳遞基因序列到患者體內的這些細胞類型。因此，在一個實施方案中，可以用本領域技術人員眾所周知的技術(參見例如1988年4月25日公開的WO89/10134號PCT公開說明書)，使基因序列能夠容易地穿過血腦屏障且傳遞所述序列至腦中的細胞。關於能夠穿過血腦屏障的傳遞，病毒載體是優選的，所述病毒載體例如諸如上面描述的那些病毒載體之類的。在另一個實施方案中，用於傳遞的技術涉及直接給予，例如，通過立體定向(stereotactic)傳遞這樣的基因序列到所述細胞中將表達所述基因序列的位點。可以用來增加基因表達和/或基因產物活性總體水平的另外方法包括運用上面描述的定向同源重組法，通過插入一種異源DNA調節元件，以使所插入的調節元件可操作地與所討論的內源基因相連接，從而來改變細胞或微生物中內源基因的表達特性。因此，可用定向同源重組來激活「轉錄沉默的」(即不正常表達的或以非常低的水平正常表達的)內源基因的轉錄、或增強正常表達的內源基因的表達；所述「轉錄沉默的」。此外，通過按足以改善各種各樣癌症及相關疾病之症狀的位置和數量引入合適的表達靶基因的細胞(優選自身細胞)到患者體內，可增加靶基因表達和/或基因產物活性的總水平。這樣的細胞或者可以是重組的，或者可以是非重組的。如果待給予的細胞是非自體細胞，則可以用眾所周知的防止宿主針對所引入細胞之免疫應答產生的技術，將其給予。例如，可以以包封形式引入所述細胞，所述封裝的形式雖然與緊靠的細胞內環境交換組分，但不允許所引入的細胞被宿主的免疫系統識別。另外，用本領域技術人員眾所周知的標準技術，可給予能夠調節MN-CA9調節區之活性的化合物，例如藉助於諸如上面描述的那些技術之類的技術鑑別的那些化合物。在待給予的化合物將涉及與腦細胞的相互作用的情況下，所述給予技術應該包括眾所周知的便於穿過血腦屏障的技術。5.5藥用製劑和給藥方法可以以治療有效劑量，將所確定的改變MN-CA9調節區活性或基因產物活性的化合物給予患者，以治療或改善各種各樣癌症及相關疾病的症狀。治療有效劑量是指足以導致改善這樣一種疾病的症狀的所述化合物之量。5.5.1有效劑量可以按標準的藥學方法，用細胞培養物或實驗動物來測定這樣的化合物的毒性和療效；例如，測定LD50(致死達群體的50％的劑量)和ED50(在群體的50％中有治療效應的劑量)。毒性作用和治療作用之間的劑量比率為治療指數，且可以將其以比率LD50/ED50來表示。優選顯示出大治療指數的化合物。雖然可使用呈現毒副作用的化合物，但為了將對非感染細胞的潛在損害減至最小，且因此減少副作用，則應該小心設計把這樣的化合物靶向受影響組織之位點的傳遞系統。在制訂出人用的劑量範圍方面，可以使用得自細胞培養物測定及動物研究的數據。這樣的化合物的劑量最好保持在包括幾乎沒毒性或無毒性的ED50的循環濃度範圍內。該劑量可以隨所用的劑量形式和所利用的給藥途徑而在這範圍內變化。對用於本發明方法的任何化合物，可根據細胞培養物測定而初步估計治療有效劑量。可以用動物模型制訂出一種劑量，以達到包括用細胞培養物確定的IC50(即達到症狀之半最大抑制的試驗化合物的濃度)的循環血漿濃度範圍。可使用這樣的信息，更準確地確定人用的有用劑量。例如用高效液相層析，可測量血漿中的水平。5.5.2製劑與使用可以用一種或更多種生理上可接受的載體或賦形劑，以常規方式配製按照本發明使用的藥用組合物。因此，可配製所述化合物及其生理上可接受的鹽及溶劑化物，用於通過吸入或吹入法(或者通過口、或者通過鼻)或口服、口腔含化、非腸道、或直腸給藥來給予。對於口服給予，所述藥用組合物可採取例如按常規方法用藥學可接受的賦形劑製備的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑例如粘合劑(例如，預膠凝玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或矽石)、崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)、或溼潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可以按本
技術領域：
眾所周知的方法來包衣。用於口服給予的液體製劑可採取例如溶液、糖漿或混懸劑的形式，或者可以將它們作為一種使用前用水或其它合適溶媒來配製的幹製品提供。可以按常規方法用藥學上可接受的添加劑來製備這樣的液體製劑，所述添加劑例如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)、非水溶媒(例如杏仁油、油狀酯、乙醇或分級植物油)、以及防腐劑(例如，甲基或丙基-對-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。當合適時，所述的製劑也可以包含緩衝鹽、調味劑、著色劑以及甜味劑。可以適當地配製用於口服給予的製劑，從而產生所述活性化合物的控釋。至於口腔含化給予，組合物可採取按常規方式配製的片劑或錠劑的形式。至於通過吸入給予，通過使用一種合適的拋射劑，以來自加壓包裝或霧化器的氣霧劑噴霧呈現形式，方便地傳遞按照本發明而使用的化合物；所述拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供一種閥來送遞計量的量，從而確定劑量單位。可以配製供吸入器或吹入器用的、例如明膠的膠囊和藥筒，所述膠囊和藥筒包含所述化合物與例如乳糖或澱粉的一種合適粉末基質的粉劑混合物。可以配製通過注射而非腸道給予的化合物，所述通過注射例如通過大劑量注射或連續輸注。可以以單位劑量的形式，例如在安瓿中或在多劑的容器中，添加一種防腐劑，提供用於注射的製劑。所述組合物可採用像油狀溶媒或含水溶媒中的混懸劑、溶液或乳劑這樣的形式，且所述組合物可包含例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑的配製劑(formulatoryagents)。另一方面，該活性成分可以呈粉劑狀態，供使用前與一種例如無熱原無菌水的合適溶媒配製。也可以將所述的化合物配製成直腸組合物，例如如包含常規栓劑基質例如可可脂或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑。在某些實施方案中，將本發明的藥用組合物局部給予需要治療的區域可能是所希望的。這可以通過例如(但不限於)以下的方法來實現通過在外科手術期間的局部輸注、例如在外科手術後連同傷口敷料一起的局部應用，通過注射，藉助於導管，用栓劑，或者藉助於移植物，所述移植物為多孔材料、非多孔材料或凝膠材料，包括例如sialastic膜的膜或纖維材料。在一個實施方案中，給予可以是通過在惡性腫瘤或腫瘤組織或腫瘤發生前組織之位點的直接注射。對於局部應用，可以將所述化合物與一種載體混合，以便基於所需活性而傳遞有效的劑量。除了先前描述的製劑外，也可以將所述化合物配製成一種緩釋型製劑。可通過移植(例如皮下或肌內移植)或通過肌內注射而給予這種長效製劑。因此，例如，可以用合適的聚合材料或疏水材料(例如作為在一種可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂，來配製所述化合物；或者可配製作為微溶衍生物例如作為一種微溶鹽的所述化合物。如果需要，則可以在可包含一份或更多份含有活性成分之單位劑量形式的包裝或分配裝置中提供所述組合物。該包裝可例如包括金屬箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包裝或分配裝置可附有給藥說明。6.引用的參考文獻在這裡描述和要求保護的本發明不應該被限制於本文公開的具體實施方案的範圍內，因為這些實施方案用來作為本發明幾個方面的說明。任何等同的實施方案都將落在本發明的範圍內。實際上，對於本領域技術熟練人員而言，根據先前的描述，除了本文顯示與描述的以下的本發明各種各樣的修改將成為顯而易見的。這樣的修改屬於所附權利要求書的範圍。通過引用，將本說明書中提到所有出版物、專利及專利申請結合到本文中，從而達到與具體而單獨地表明通過引用結合每個單獨的出版物、專利或專利申請相同的程度。權利要求1.一種分離的多核苷酸或其轉錄活性片段，該寡核苷酸包括圖1所示的核苷酸序列。2.一種分離的多核苷酸或其互補物，所述多核苷酸在高度嚴格條件下與權利要求1的任何一種分離的多核苷酸雜交。3.一種重組載體，所述載體包含權利要求2的分離的多核苷酸。4.一種表達載體，所述載體包含權利要求2的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸與一種控制在宿主細胞內所述核酸表達的調節核酸可操作相連。5.一種基因工程細胞，所述細胞包含權利要求2的分離的多核苷酸。6.一種非人類的轉基因動物，所述動物已被基因工程化，從而包含一種包括權利要求2之分離的多核苷酸的轉基因。7.一種治療劑，所述治療劑包含一種MN-CA9啟動子、一種傳遞載體以及一種毒性、治療和/或異源編碼序列。8.權利要求7的治療劑，所述治療劑還包括一種前體藥物。9.權利要求8的治療劑，其中所述的前體藥物選自無環鳥苷(「ACV」)和更昔洛韋(「GCV」)。10.權利要求7的治療劑，其中所述的傳遞載體包括一種病毒載體。11.權利要求10的治療劑，其中所述的病毒載體是腺病毒。12.權利要求7的治療劑，其中所述的傳遞載體包括一種脂質體。13.權利要求7的治療劑，其中所述的毒性編碼序列選自胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶。14.權利要求7的治療劑，其中所述的治療編碼序列選自生長因子、細胞因子、治療蛋白、激素和激素的肽片段、細胞因子的抑制劑、肽生長與分化因子、白細胞介素、趨化因子、幹擾素、集落刺激因子以及血管生成因子。15.權利要求7的治療劑，其中所述的異源編碼序列是一種報導基因。16.權利要求15的治療劑，其中所述的報導基因是一種螢光素酶。17.一種鑑定能夠調節腫瘤特異性基因表達的試驗化合物的方法，所述方法包括(a)使化合物與在MN-CA9調節區或其轉錄活性片段控制下表達一種報導基因的細胞接觸；以及(b)測量該報導基因在存在和不存在所述試驗化合物情況下的表達水平，因此如果在存在所述試驗化合物的情況下所獲得的水平不同於當所述試驗化合物不存在時所獲得的水平，那麼則鑑定出調節腫瘤特異性基因表達的化合物。18.權利要求17的方法，其中所述報導基因的表達產生一種螢光信號。19.一種藥用組合物，所述組合物包括按權利要求17鑑定出的試驗化合物。20.一種用於藥物傳遞的方法，該方法包括將一種載體引入到受治療者的腫瘤中，所述載體包含一種可操作地連接異源基因的MN-CA9調節區序列或其轉錄活性片段。21.一種治療和/或改善癌症或其它增生性疾病的方法，所述方法包括向受治療者的所述癌症或其它增生性疾病的細胞中，引入一種包含MN-CA9調節區序列或其轉錄活性片段、一種傳遞載體以及基因產物能夠殺傷所述細胞的一種毒性、治療和/或異源編碼序列的載體。22.權利要求21的方法，其中所述的癌症或其它增生性疾病選自宮頸癌、腎細胞癌、結腸癌以及胃癌。23.權利要求21的方法，該方法還包括引入一種前體藥物。24.權利要求23的方法，其中所述的前體藥物選自ACV和GCV。25.權利要求21的方法，其中所述的引入包括經直接應用的給予、或者通過靜脈內給予、動脈內給予、腫瘤內給予、灌注以及口服給予的系統性應用。全文摘要本發明涉及指導在腫瘤細胞內表達的啟動子、增強子和其它調節元件，包括來自控制腎細胞癌相關蛋白MN－CA9表達的5』調節區的核苷酸序列及其轉錄活性片段。特別提供表達其中MN－CA9調節區能夠控制異源基因表達、能夠過量表達內源基因或病理過程的抑制劑、或者能夠使在癌症發生和/或發展中被認為是重要的特定基因的表達失效的載體、宿主細胞和轉基因動物。本發明也涉及使用所述載體、細胞和動物來篩選作為癌症發生和/或發展之激動劑和拮抗劑的候選分子的方法。本發明另外涉及調節腫瘤細胞內化合物表達的組合物和方法，且涉及篩選調節腫瘤細胞內表達之化合物的組合物與方法。也提供應用通過篩選測定而鑑定的分子與化合物進行治療性治療的方法。文檔編號A61P35/00GK1447920SQ01813165公開日2003年10月8日申請日期2001年5月24日優先權日2000年5月25日發明者T·A·加納,C·考,S·－C·柯,F·楊,L·W·K·鍾申請人:維吉尼亞大學專利基金會