人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用的製作方法

2023-04-30 03:33:36 3

人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用，所述的皮膚損傷包括雷射灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學性損傷。本發明首次將臍帶幹細胞複合生長因子用於人皮膚雷射損傷治療當中，在一定保存條件下，人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子可以保存最大活性，並發揮最大的損傷修復治療作用。
【專利說明】人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用，屬於醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]人臍帶間充質幹細胞是一種來自與人體臍帶組織的間充質細胞，具有高度增殖、自我更新和多向分化能力。間充質幹細胞來源廣泛，可來源於骨髓、脂肪、臍血、胎盤、羊水、臍帶等等組織。體外培養應用不同的誘導培養基可分化為軟骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、神經、皮膚等等細胞。另外，間充質幹細胞具有貼壁生長的特點，方便了條件培養基的收集。
[0003]與其他來源的間充質幹細胞相比，臍帶間充質幹細胞更方便提取，並且更易獲得。在再生醫學的應用中，臍帶間充質幹細胞具有更強的抑制內皮細胞及組織凋亡，調節免疫的作用，而這些作用與其所分泌的複合細胞因子有非常密切的作用。在臍帶間充質幹細胞培養過程中會分泌肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF),粒細胞巨卩遼細胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF),血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),腦源性營養因子(brain derivedneurotrophic factor),神經生長因子(nerve growth factor, NGF),以及其他還沒有被分離的分子物質。所以這種複合細胞因子具有這促進皮膚組織生長，調節損傷後免疫的功能可以用於雷射灼傷等理化因素造成的皮膚損傷。
[0004]隨著美容整形市 場的擴大，越來越多的人群選擇應用雷射祛斑、光子嫩膚等方法進行面部美容。皮膚雷射美容術是通過光熱作用進行皮膚治療，通過產生高能量，準確聚焦，在人皮膚組織局部產生高能量，通過去除和破壞組織達到美容的目的。但是因為治療選擇不當、操作不當等原因造成術後併發症的人群在逐年增多。因操作不當會造成過多的組織損傷，嚴重的炎症反應，以及毛細血管怒張等等相反的效果。主要的副作用包括水腫、水皰、色素沉著、色素減退、毛細血管擴張、皮膚敏感性增高等等。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用，所述的皮膚損傷包括雷射灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學性損傷，所述的複合細胞因子為人臍帶間充質幹細胞所分泌的細胞因子，所述的人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子通過以下步驟製備而得:
1)從人臍帶組織中提取臍帶間充質幹細胞；
2)將臍帶間充質幹細胞在體外進行擴增培養；
3)臍帶間充質幹細胞換用無血清的條件培養基進行培養，並且將培養基進行收集；
4)將條件培養基進行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質；
5)將離心後培養基(含>3.5kDa分子)進行透析濃縮，得到濃縮液；6)將濃縮液進行凍幹處理，得到人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子凍乾粉。
[0006]更加優選地，
所述的人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子通過以下步驟製備而得:
I)臍帶間充質幹細胞的提取:通過抽脂手術以及其他手術中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化後離心提取臍帶間充質幹細胞，將臍帶間充質幹細胞接種於培養皿中在飽和溼度5% 二氧化碳濃度，37 ° C恆溫下培養。
[0007]2)人臍帶間充質幹細胞的擴增培養:人臍帶間充質幹細胞為長梭形貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進行傳代培養。
[0008]3)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的收集:培養細胞至第三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清培養基進行細胞正常培養後，將經過培養的無血清培養基進行收集。
[0009]4)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的離心過濾，濃縮及凍幹:將所收集的間充質幹細胞條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜。將離心後的條件培養基通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2-20倍。將最終的濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，製備成凍乾粉。注意全程無菌化處理。 [0010]一種含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的修復材料，所述的修復材料包括人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子和透明質酸，每1ml修復材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子。製備方法包括以下步驟:將人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子濃縮液或凍乾粉按照一定比例加入透明質酸中，配置成每1ml修復材料中含有
0.1ng-1OOmg複合細胞因子的修復材料。
[0011]所述的修復材料為膠狀修復材料、面膜修復材料或膏狀修復材料。
[0012]本發明具有如下技術效果:
I)雷射灼傷主要病理變化包括局部皮膚黏膜細胞的變性壞死以及免疫功能異常等等。按照嚴重程度可按照燒(灼)傷的標準三度四分法進行判定，如I度燒傷僅傷及表皮，局部紅腫；二度傷及真皮，局部出現水泡；三度傷及皮膚全層，深達皮膚、肌肉、骨骼等等。但是雷射灼傷也具有自身的特點，如皮膚點狀損傷，後期癒合後毛細血管怒張等等。複合細胞因子具有多種細胞因子有效成分，能夠對損傷組織進行修復，促進損傷組織的生長癒合，調節免疫反應等等。
[0013]2)透明質酸材料為一種酸性粘多糖，溶解後比例為0.1_10%，理想濃度為1%，是人體的一種成分，富含水分，具有特殊的保水作用，對雷射創面以及其他理化損傷創面保持溼潤環境。
[0014]3)臍帶間充質幹細胞的複合細胞因子為肝細胞生長因子(hepatocyte growthfactor, HGF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor, TNF),血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),腦源性營養因子(brain derived neurotrophic factor),神經生長因子(nervegrowth factor, NGF),以及其他還沒有被分離的分子物質等多種有效成分的混合物,具有明顯的治療作用。本發明首次將臍帶幹細胞複合生長因子用於人皮膚雷射損傷治療當中，在一定保存條件下，複合細胞因子可以保存最大活性，並發揮最大的損傷修復治療作用。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖l(al)為臍帶間充質幹細胞的形態圖；
圖l(a2)為臍帶間充質幹細胞培養至第三代形態圖；
圖l(a3)為第三代臍帶間充質幹細胞的流式細胞分析結果；
圖2為使用上述皮膚修復材料的人皮膚二氧化碳雷射點陣掃描後修復圖。其中=FxCR8mJ照射後應用複合細胞因子(Tl)，FxCR 8mJ照射後應用對照空白培養基(Cl)，FxCR 16mJ照射後應用複合細胞因子(T2)，FxCR 16mJ照射後應用對照空白培養基(C2)。
[0016]圖3a為二氧化碳雷射後不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應用紅斑指數(Erythema index)測量恢復情況對照曲線。
[0017]圖3b為二氧化碳雷射後不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應用黑色素指數(Melanin index)測量恢復情況對照曲線。
【具體實施方式】
[0018]實施例1製備含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子
含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的製備方法，包括如下步驟:
I)臍帶間充質幹細胞的提取
通過抽脂手術以及其他手術中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化後離心提取臍帶間充質幹細胞，將臍帶間充質幹細胞接種於培養皿中在飽和溼度5% 二氧化碳濃度，37° C恆溫下培養。
[0019]2)人臍帶間充質幹細胞的擴增培養
人臍帶間充質幹細胞為長梭形貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進 行傳代培養。
[0020]臍帶間充質幹細胞的形態(al)和培養至第三代形態(a2)如圖1 (al)和圖1(a2)所示，流式細胞分析如圖1 (a3)所示，表明抗原，CD29(99.96%，bl)，CD90 (47.1%, b4),CD34 (0.87%, b2)，CD71 (0.94%, b3)，陰性對照 PE (0.56%, b5)，FITC (1.09%, b6)。
[0021]3)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的收集
培養細胞至第三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清培 養基進行細胞正常培養後，將經過培養的無血清培養基進行收集。
[0022]4)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的離心過濾，濃縮及凍幹
將所收集的間充質幹細胞條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜。將離心後的條件培養基通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2_20倍。將最終的濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，製備成凍乾粉。注意全程無菌化處理。
[0023]實施例2
選擇19名過去12個月未做過二氧化碳雷射的志願者參加實驗，年齡24-33歲，Fitzpatrick皮膚分級為3-4級。在每個志願者雙手臂內側共四處應用二氧化碳雷射照射，相對稱區域用8mJ及16mJ的輻射計量。圖2為典型照射後圖片，T為實驗組，C為對照組，I為8mJ福射，2為16mJ福射，分別為術後1、7、14天圖片。[0024]分別統計紅斑指數和黑色素指數，T為實驗組，C為對照組，I為SmJ輻射，2為16mJ輻射，分別為術後0、1、4、7、14、21天。
[0025]對二氧化碳雷射後不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應用紅斑指數(Erythemaindex)測量恢復情況。T1、C1為8mJ雷射，T2、C2為16mJ雷射。如圖3a所示，第一天實驗組與對照組之間有明顯差異(T檢驗，P〈0.05)。
[0026]對二氧化碳雷射後不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應用黑色素指數(Melaninindex)測量恢復情況。如圖3b所示，在術後第1、7、14、21天細胞因子組明顯降低了黑色素含量(T檢驗，P〈0.05)。
[0027]結論:應用含有細胞因子的修復材料可以明顯改善傷口的恢復情況，降低傷口的紅斑指數和黑色素指數。
[0028]實施例3含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的功能性修復材料
功能性修復材料:可應用於雷射灼傷、急性創傷、挫傷等等皮膚創面的修復，含有高劑量細胞因子，對新鮮或陳舊未閉合創面的修復有非常強效的作用。1ml修復材料含:HA
0.1g,超純水約1ml,人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子10mg,鹼性細胞生長因子10ng,表皮生長因子10 μ g。製備劑型為膠狀塗抹修復材料，可直接塗抹於皮膚創口，並在表面貼服透氣材料防止修復材料損失。
[0029]實施例4含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的日常護理面膜 日常護理面膜:主要用於日常的皮膚護理，將細胞因子加入面膜液中混勻製備為面膜，長期面部應用可以起到皮膚美白、修復、抗衰老的作用。具體成分如下:
聚乙烯醇 12%
甘油10%
咪唑烷基脲 1%
乙醇5%
月桂醇聚氧乙烯醚7%
細胞因子液 0.1%
香精、防腐劑適量 純化水補充至100%
其中細胞因子液中細胞因子濃度約為0.5 μ g/100ml。
[0030]所製備面膜中每片約含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子0.1ngo
[0031]實施例5含有人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的即時修復材料
即時修復材料:主要用於皮膚損傷後的即時修復，主要針對的損傷為表皮破損或傷及真皮組織的損傷，包括雷射損傷、皮膚擦傷等等，一般在創面形成後4小時內應用。在非清潔創面，需先對創面進行清創處理，清潔創面則可直接將修復材料塗抹於創面組織後進行低溫護理。即時修復材料成分包括:透明質酸1%，純化水99%，人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子1mg均勻溶解於透明質酸1%膠狀液中。
【權利要求】
1.人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子在製備修復皮膚損傷的生物製劑中的應用，所述的皮膚損傷包括雷射灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學性損傷，其特徵在於，所述的複合細胞因子為人臍帶間充質幹細胞所分泌的細胞因子，所述的人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子通過以下步驟製備而得: 1)從人臍帶組織中提取臍帶間充質幹細胞； 2)將臍帶間充質幹細胞在體外進行擴增培養； 3)臍帶間充質幹細胞換用無血清的條件培養基進行培養，並且將培養基進行收集； 4)將條件培養基進行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質； 5)將離心後培養基(含>3.5kDa分子)進行透析濃縮，得到濃縮液； 6)將濃縮液進行凍幹處理，得到人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子凍乾粉。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子通過以下步驟製備 而得: 1)臍帶間充質幹細胞的提取:通過抽脂手術以及其他手術中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化後離心提取臍帶間充質幹細胞，將臍帶間充質幹細胞接種於培養皿中在飽和溼度5% 二氧化碳濃度，37 ° C恆溫下培養； 2)人臍帶間充質幹細胞的擴增培養:人臍帶間充質幹細胞為長梭形貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進行傳代培養； 3)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的收集:培養細胞至第三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清培養基進行細胞正常培養後，將經過培養的無血清培養基進行收集； 4)人臍帶間充質幹細胞條件培養基的離心過濾，濃縮及凍幹:將所收集的間充質幹細胞條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜；將離心後的條件培養基通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2_20倍；將最終的濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，製備成凍乾粉；注意全程無菌化處理。
3.含有如權利要求1或2所述的人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子的修復材料，其特徵在於，所述的修復材料包括人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子和透明質酸，每1ml修復材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子。
4.根據權利要求3所述的修復材料，其特徵在於，所述的修復材料為膠狀修復材料、面膜修復材料或膏狀修復材料。
【文檔編號】A61K38/19GK104027794SQ201410273905
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】徐妍, 郭世磊, 周炳榮 申請人:徐妍