聯合檢測基因pten、vegf相對表達量的寡核苷酸和方法

2023-04-29 23:28:46

聯合檢測基因pten、vegf相對表達量的寡核苷酸和方法
【專利摘要】本發明提供基於螢光定量PCR技術聯合檢測基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸和方法，主要涉及檢測基因PTEN的上遊引物PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe；檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe；檢測內參基因actin的上遊引物Actin-F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe，將所檢測的基因PTEN、VEGF相對表達量分別地與健康人基因PTEN、VEGF相對表達量基準值進行比較，可用於各類癌症的輔助診斷。
【專利說明】聯合檢測基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸和方法
【技術領域】
[0001]本發明屬生命科學和生物【技術領域】，涉及聯合檢測基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸和方法，採用探針實時螢光定量PCR技術，能夠對人類各類癌症組織中的PTEN、VEGF相對表達量進行檢測，可有效地節約檢測時間，提高檢測精度。
【背景技術】
[0002]位於10號染色體上的磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten, PTEN)基因，是1997年發現的新抑癌基因，也是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因(LI J, YEN C，LIAW DU, et al.PTEN, aputative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast andprostate cancer.Science, 1997，275 (5308): 1943-1947)。據吳元清報導 PTEN 基因位於染色體10q23，其表達產物PTEN蛋白具有誘導細胞凋亡、抑制細胞周期進展以及抑制細胞遷移、鋪展和局部黏附的生理功能(吳元清.PTEN在非小細胞肺癌研究中的進展.國外醫學:生理病理科學與臨床分冊，2003，23 (6): 577)。PTEN是近年來發現的腫瘤抑制基因，又稱MMAC1/TEP1，位於染色體10q23.3，可通過對細胞內外信號傳導的負調控發揮其抑癌作用。在結直腸癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等多種癌組織中都已報導該基因的缺失或突變。國內外有關研究表明PTEN蛋白在正常組織、良性病變和癌組織中的表達差異具有顯著性，並且PTEN蛋白的表達降低及缺失多發生在癌證中晚期，提示PTEN蛋白的表達與癌的發生發展有關。近年來的研究發現腫瘤對抗腫瘤藥物產生耐受性是腫瘤內科治療失敗的主要原因，其中PTEN mRNA表達量降低能介導腫瘤對表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑、單克隆抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)、單克隆抗體西妥昔單抗(cetuximab)、N0TCH1抑制劑耐藥、順鉬、阿黴素和紫杉醇等的耐受性，從而降低化療藥物的作用(吳新剛，閭四平.PTEN基因與腫瘤耐藥.中國新藥雜誌，2008，17 (15): 1291-1294)。因此，對癌症患者進行PTEN表達水平的檢測對於指導後期治療有著積極的作用。
[0003]腫瘤血管生成在腫瘤的生長、侵襲、轉移過程中起著重要作用，血管內皮生長因子(VEGF)能刺激血管內皮細胞生長和增殖，是多種腫瘤血管生長因子的重要組分(LI J, YENC，LIAW DUjet al.PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated inhuman brain, breast and prostate cancer.Science，1997，275 (5308): 1943-1947)，並通過促進腫瘤血管生成，增加血管通透性和下調宿主抗腫瘤免疫應答等機制，參與實體瘤的發生與發展。VEGF的表達水平反應了腫瘤的生長速度和轉移傾向，過度的VEGF表達使血管生成急劇增加，導致腫瘤擴展，VEGF具有重要的腫瘤生物學意義。Bevacizumab (商品名Avastin)是一種重組的人類單克隆IgGl抗體，通過抑制人類血管內皮生長因子的生物學活性而起作用。也就是說Avastin可結合VEGF並防止其與內皮細胞表面的受體(Flt-1和KDR)結合。在體外血管生成模型上，VEGF與其相應的受體結合可導致內皮細胞增殖和新生血管形成。有研究表明，VEGF基因表達水平高的患者的中位無進展生存期較長，而VEGFR基因表達水平低的患 者中位無進展生存期較短，療效不明顯。[0004]近年來，隨著腫瘤個性化診斷的不斷發展，腫瘤靶向位點表達水平檢測的普及度也不斷提升，但是在實際檢測中還是出現了不少的問題，其中「單一靶向位點檢測」結果的不穩定性已經成為限制腫瘤個性化診斷的一大瓶頸，此外「單一靶向位點檢測」也難以提供全面的診斷和預後信息。因此，越來越多的研究集中到了 「多靶向位點聯合檢測」，這既對檢測結果進行了雙重驗證，也為醫生的診斷和制定後期治療方案提供了可靠的參考信息。VEGF和PTEN正是這樣的一對基因，近期關於聯合檢測癌症組織中基因VEGF、PTEN的表達的報導在國內外大量出現，研究發現兩者的表達多數呈現負相關，聯合檢測PTEN和VEGF表達可作為各類癌症生物學行為和預後判斷的重要指標。
[0005]在實際操作中， 用於檢測PTEN、VEGF mRNA相對表達量的方法主要為免疫組化，儘管該法原理簡單，但是試驗過程過於繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，判讀結果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使我們探索新的方法來檢測PTEN、VEGF mRNA表達水平。
[0006]實時螢光定量PCR技術具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時在線檢測，反映PTEN、VEGF在組織中的初始含量，試驗節約了大量的檢測時間，還避免了遺留汙染的發生。常見的方法有SYBR Green I染料法、雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR Green I由於是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman探針法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。
[0007]此外，利用結合Taqman探針法的實時螢光PCR技術定量檢測待測樣品中的目的基因PTEN、VEGF相對表達量，僅僅通過設置內參基因actin，來計算出待測樣品中PTEN、VEGF基因表達量與待測樣品內參基因actin表達量的比值仍然不足以判斷這兩種基因的表達量是否處於正常範圍。

【發明內容】

[0008]為解決實時螢光定量PCR技術中SYBR Green I染料法、雙探針雜交法的不足，本發明採用結合Taqman探針法的實時螢光定量PCR方法，它綜合生物學、酶學和螢光化學於一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了 PCR產物汙染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易於統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好、靈敏度高、操作簡單、自動化程度高、防汙染和有較大的線性範圍等優點。
[0009]為此，本發明設計了聯合檢測目的基因(PTEN、VEGF)和內參基因actin的上下遊引物和探針，用螢光定量PCR技術檢測基因PTEN、VEGF相對表達量。通過調整這兩種目的基因和內參基因的上下遊、探針濃度及其比例，優化PCR的反應體系和反應條件，能夠準確地確定樣品中PTEN、VEGF基因相對表達量。
[0010]同時為了解決僅通過設置內參基因actin來確定基因PTEN、VEGF的相對表達量，並不足以判斷這兩種基因的相對表達量是否處於正常範圍，本發明利用健康人中的基因PTEN、VEGF相對表達量基準值作為參照，就可以非常準確地判斷所述相對表達量是否處於正常的表達範圍。
[0011]本發明提供用於聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸包括:[0012](I)檢測基因PTEN的上遊引物PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，其鹼基序列為:
[0013]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0014]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0015]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0016](2)檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe，其鹼基序列為:
[0017]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0018]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0019]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0020](3)檢測內參基因actin的上遊引物Actin_F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe,其喊基序列為:
[0021 ] Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0022]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0023]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
[0024]進一步地，檢測基因PTEN的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:PTEN-F:PTEN-R:PTEN-Probe=2:2:1。
[0025]進一步地，檢測基因VEGF的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:VEGF-F:VEGF-R:VEGF-Probe=2:2:1。
[0026]進一步地，內參基因actin的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:Actin_F:Actin-R:Actin-Probe=2:2:1。
[0027]進一步地，分別利用檢測基因PTEN、VEGF和內參基因actin的上遊引物、下遊引物和探針，在相同擴增條件下進行實時PCR擴增，然後確定樣品中基因PTEN相對表達量Fsp，以及樣品中基因VEGF相對表達量Fsv。
[0028]進一步地，根據所述Fsp和Fsv的值分別計算Fsp與Frp的比值Fp, Fsv與Frv的比值Fv，Frp和Frv分別為健康人中的基因PTEN、VEGF相對表達量基準值。
[0029]進一步地，所述Frp的值為0.72，所述Frv的值為0.55。
[0030]進一步地，所述擴增條件為:95°C預變性lmin，95°C 15s，58°C 35s，40個循環，螢光信號於58°C 35s時採集。
[0031]本發明還提供一種聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的方法，包括以下步驟:
[0032](I)提取樣品中的RNA ；
[0033](2)將(I)中提取出的RNA逆轉錄為cDNA ；
[0034](3)加入⑵中所述的cDNA到反應管中，分別利用檢測基因PTEN的PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe,檢測內參基因actin的上遊引物Actin_F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe， 獲得基因PTEN、VEGF和內參基因actin的Ct值，其特徵在於，
[0035]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0036]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG[0037]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0038]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0039]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0040]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA[0041 ] Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0042]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0043]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；
[0044](4)根據(3)中的基因PTEN、VEGF和內參基因actin的Ct值，並結合各自的標準定量曲線，計算樣品中基因PTEN的相對表達量Fsp和基因VEGF的相對表達量Fsv ；
[0045](5)根據(4)中的Fsp和Fsv值分別計算Fsp與Frp的比值Fp, Fsv與Frv的比值 Fv，其中 Frp=0.72，Frv=0.55 ；
[0046](6)根據Fp和Fv的值進行判斷:對Fp而言，當Fp>l.5時，基因PTEN相對表達量偏高，當Fp〈l.5時，基因PTEN相對表達量偏低，當0.5≤Fp≤1.5時，基因PTEN相對表達量正常；而對Fv而言，當Fv>25時，基因VEGF相對表達量偏高，當Fv〈15時，基因VEGF相對表達量偏低，當15≤Fv≤25時，基因PTEN相對表達量正常。
[0047]本發明還提供一種聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的試劑盒，所述試劑盒包括樣品RNA提取液；紅細胞裂解液；檢測基因PTEN的上遊引物PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe,檢測內參基因actin的上遊引物Actin-F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe ；陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其特徵在於，
[0048]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0049]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0050]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA[0051 ] VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0052]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0053]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0054]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0055]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0056]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0057]本發明的有益效果:本發明將實時螢光PCR技術和Taqman探針技術結合在一起，定量檢測受測者體內PTEN、VEGF基因相對表達量，並與健康人的PTEN、VEGF基因相對表達量基準值進行比較，而能夠更準確地衡量受測者體內PTEN、VEGF基因相對表達量是否正常。該發明特異性好，靈敏度高，操作簡單，降低了檢測成本，節約了檢測時間。此外，鑑於基因PTEN和VEGF的表達在腫瘤靶基因上的作用相反，聯合檢測基因PTEN和VEGF的相對表達量，能夠更加準確和更為全面地預測各類癌症進展，具有更為可靠的診斷價值，應用前景廣泛。
[0058]鑑於僅僅通過設置基因actin作為內參，計算出待測樣品目的基因PTEN、VEGF相對表達量Fsp和Fsv，仍然不足以判斷它們的相對表達量是否處於正常範圍，為此本發明根據健康人樣品的大量臨床檢測結果，利用統計學方法創造性地計算出健康人的PTEN相對表達量基準值Frp和健康人的VEGF相對表達量基準值Frv。Frp是根據1000例健康人樣品中基因PTEN和內參基因actin的Ct值，並結合各自的標準定量曲線，獲得每例健康人樣品中的PTEN和actin拷貝數，然後計算每例健康人樣品中的PTEN相對表達量，即PTEN拷貝數與actin拷貝數的比值，再求這些比值的平均數而計算出來的，其值為0.72，即Frp=0.72。而Frv是根據1000例健康人樣品中基因VEGF和內參基因actin的Ct值，並結合各自的標準定量曲線，獲得每例健康人樣品中的VEGF和actin拷貝數，然後計算每例健康人樣品中的VEGF相對表達量，即VEGF拷貝數與actin拷貝數的比值，再求這些比值的平均數而計算出來的，其值為0.55,即Frv=0.55。根據Frp和Frv的值,分別計算Fp和Fv,其中Fp=Fsp/Frp, Fv=Fsv/Frv。
[0059]接著，根據對大量PTEN相對表達量偏高的臨床樣品進行分析，所測得的Fp值均大於1.5，因此設定當Fp>l.5時，PTEN相對表達量偏高；根據對大量PTEN相對表達量處於正常範圍的臨床樣品進行分析，所測得的Fp值均不小於0.5且不大於1.5，因此設定當
0.5 ≤ Fp ≤ 1.5時，PTEN相對表達量正常；根據對大量PTEN相對表達量偏低的臨床樣品進行分析，所測得的Fp值均小於0.5，因此設定當Fp〈0.5時，PTEN相對表達量偏低。
[0060]與此同時，根據對大量VEGF相對表達量偏高的臨床樣品進行分析，所測得的Fv值均大於25，因此設定當Fv>25時，VEGF相對表達量偏高；根據對大量VEGF相對表達量處於正常範圍的臨床樣品進行分析，所測得的Fv值均不小於15且不大於25，因此設定當15 ≤ Fv ≤ 25時，VEGF相對表達量正常；根據對大量VEGF相對表達量偏低的臨床樣品進行分析，所測得的Fv值均小於15，因此設定當Fv〈15時，VEGF相對表達量偏低。
[0061]此外，正是因為引入了健康人的PTEN相對表達量基準值Frp和健康人的VEGF相對表達量基準值Frv作為對照，通過計算出待測樣品目的基因PTEN相對表達量Fsp與Frp的比值Fp，以及待測樣品目的基因VEGF相對表達量Fsv與Frv的比值Fv，這樣就可將Fp和Fv作為一種衡量指標來判定待測者體內的基因PTEN、VEGF相對表達量是否正常，從而能夠對待測者的基因PTEN、VEGF相對表達量進行全面的評價，並指導後期治療與用藥。這是因為僅僅根據Fsp和Fsv只能評估待測者體內的基因PTEN、VEGF相對表達量在一段時間內的波動，但是這些相對表達量本身是否處於正常範圍之內，人們無法評判，而且實際中還存在Fsp升高但是待測者體內的基因PTEN相對表達量仍然偏低或Fsv值下降但是待測者體內的基因VEGF相對表達量仍然偏高的情形，這時如果根據Fsp升高和Fsv值下降就以為待測者健康狀況好轉從而停止治療或者不更換藥物而繼續使用原有藥物，那麼就會錯過最好的治療時機，甚至導致病情惡化。但是如果依據Fp和Fv的值，就可很好地克服這種Fsp升高但Fp仍然偏低或Fsv下降但Fv仍然偏高的情形。另外，鑑於在很多癌症中，基因PTEN、VEGF相對表達量存在負相關的關係，僅僅檢測PTEN或VEGF相對表達量，或者僅僅判斷PTEN或VEGF相對表達量是否在正常範圍，不能準確地和全面地反應疾病特徵，而將對這兩種基因的檢測和判斷有機結合在一起，就不存在這個問題，而且還可更好地評估疾病預後。
[0062]總之，本發明不但能夠對待測者體內的基因PTEN、VEGF相對表達量進行檢測，同時還能夠指導後期治療方案的確定和藥物選擇，還可用於輔助臨床各類癌症的早期診斷、早期預防及高危人群的篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】[0063]圖1是利用基於螢光定量PCR技術聯合檢測基因PTEN、VEGF相對表達量的試劑盒檢測樣品I的結果圖
[0064]圖2是利用基於螢光定量PCR技術聯合檢測基因PTEN、VEGF相對表達量的試劑盒檢測樣品2的結果圖
【具體實施方式】
[0065]下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》 第四版，或者按照製造廠商所建議的步驟和條件。
[0066]實施例1用於聯合檢測PTEN和VEGF的寡核苷酸和試劑盒
[0067]用於聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括:
[0068](I)檢測基因PTEN的上遊引物PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，其鹼基序列為:
[0069]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0070]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0071 ] PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0072](2)檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe，其鹼基序列為:
[0073]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0074]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0075]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0076](3)檢測內參基因actin的上遊引物Actin_F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe,其喊基序列為:
[0077]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0078]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0079]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0080]一種聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的試劑盒，所述試劑盒包括樣品RNA提取液；紅細胞裂解液；基因PTEN檢測體系PCR反應液；基因VEGF檢測體系PCR反應液；內參基因actin檢測體系PCR反應液；陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0081]RNA 提取液:QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
[0082]IOX 紅細胞裂解液配方為:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA_Na23.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0083]基因PTEN 檢測體系 PCR 反應液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、上遊引物PTEN-F0.8uM (10μM)、下遊引物PTEN-R0.8uM (10 μ M),PTEN-probe (探針)0.4uM (10μΜ),其中:
[0084]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0085]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0086]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA[0087]基因VEGF 檢測體系 PCR 反應液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、上遊引物VEGF-F0.8uM (10 μ M)、下遊引物 VEGF-R0.8uM (10 μ M)、VEGF_probe (探針)0.4uM (10 μ Μ),其中:
[0088]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0089]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0090]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0091]陽性對照品:含VEGF或PTEN基因的溶液；
[0092]陰性對照品:不含VEGF或PTEN基因的溶液；
[0093]空白對照品:生理鹽水或不加任何物質。
[0094]基因actin 檢測體系 PCR 反應液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X)、上遊引物 Actin-F0.8uM (10 μ M)、下遊引物 Actin-R0.8uM (10 μ M)、Actin-probe (探針)0.4uM(10μΜ)，其中:
[0095]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0096]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0097]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0098]實施例2檢測流程
[0099](I)抽提石蠟切片中的組織RNA:切去組織或者石蠟片樣品於1.5ml離心管中(刮拭)；加入Iml組織透明液,振蕩混勻後13000rpm離心Imin ;去除上清,加入500ml組織透明液，振蕩混勻後13000rpm離心Imin ;去除上清,加入Iml無水乙醇振蕩混勻後13000rpm離心Imin ;去除上清後至於37°C金屬浴IOmin (開蓋)，直至液體乾燥；參考QIAGEN RNeasyFFPEKit石蠟RNA抽提試劑盒說明書，提取樣品RNA。
[0100](2)參考Τ0Υ0Β0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為cDNA。(3)試劑配置:按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X μ I,每人份25 μ I分裝:
[0101]Χ=25μ1反應液X (8份內參基因(標準定量曲線)+8份目的基因(標準定量曲線)+η份樣品+1份陽性對照品+1份陰性對照品+1份空白對照品)。如下表所示:
[0102]
【權利要求】
1.用於聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸包括: (1)檢測基因PTEN的上遊引物PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，其鹼基序列為:
PTEN -F: CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
PTEN -R: GTGAAACAACAGTGCCACTG
PTEN -Probe: FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA (2)檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe，其鹼基序列為:
VEGF-F: CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
VEGF-R: ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
VEGF-Probe: FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA (3)檢測內參基因actin的上遊引物Actin_F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe,其鹼基序列為:
Actin-F: TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R: TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe: FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
2.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特徵在於，檢測基因PTEN的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:PTEN-F: PTEN-R: PTEN-Probe=2:2:1。
3.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特徵在於，檢測基因VEGF的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:VEGF-F:VEGF-R:VEGF-Probe =2:2:1。
4.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特徵在於，內參基因actin的上遊引物、下遊引物和探針的使用濃度比為:Actin_F:Actin-R:Actin_Probe=2:2:1。
5.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特徵在於，分別利用檢測基因PTEN、VEGF和內參基因actin的上遊引物、下遊引物和探針，在相同擴增條件下進行實時PCR擴增，然後確定樣品中基因PTEN相對表達量Fsp，以及樣品中基因VEGF相對表達量Fsv。
6.如權利要求5所述的寡核苷酸,其特徵在於，根據所述Fsp和Fsv的值分別計算Fsp與Frp的比值Fp，Fsv與Frv的比值Fv，Frp和Frv分別為健康人中的基因PTEN、VEGF相對表達量基準值。
7.如權利要求6所述的寡核苷酸，其特徵在於，所述Frp的值為0.72，所述Frv的值為0.55。
8.如權利要求5所述的寡核苷酸，其特徵在於，所述擴增條件為:95°C預變性lmin，95°C 15s，58°C 35s，40個循環，螢光信號於58°C 35s時採集。
9.一種聯合檢測樣品中基因PTEN、VEGF相對表達量的方法，包括以下步驟: (1)提取樣品中的RNA； (2)將⑴中提取出的RNA逆轉錄為cDNA； (3)加入⑵中所述的cDNA到反應管中，分別利用檢測基因PTEN的PTEN-F、下遊引物PTEN-R和探針PTEN-Probe，檢測基因VEGF的上遊引物VEGF-F、下遊引物VEGF-R和探針VEGF-Probe,檢測內參基因actin的上遊引物Actin-F、下遊引物Actin-R和探針Actin-Probe，獲得基因PTEN、VEGF和內參基因actin的Ct值，其特徵在於，
PTEN -F: CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
PTEN -R: GTGAAACAACAGTGCCACTG
PTEN -Probe: FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
VEGF-F: CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
VEGF-R: ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
VEGF-Probe: FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R: TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe: FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ； (4)根據(3)中的基因PTEN、VEGF和內參基因actin的Ct值，並結合各自的標準定量曲線，計算樣品中基因PTEN的相對表達量Fsp和基因VEGF的相對表達量Fsv ； (5)根據(4)中的Fsp和Fsv值分別計算Fsp與Frp的比值Fp,Fsv與Frv的比值Fv,其中 Frp=0.72, Frv=0.55 ； (6)根據Fp和Fv的值進行判斷:對Fp而言，當Fp>1.5時，基因PTEN相對表達量偏高，當Fp〈1.5時，基因PTEN相對表達量偏低，當0.5≤Fp≤1.5時，基因PTEN相對表達量正常；而對Fv而言，當Fv>25時，基因VEGF相對表達量偏高，當Fv〈15時，基因VEGF相對表達量偏低，當15≤Fv ^ 25時，基因PTEN相對表達量正常。
【文檔編號】C12N15/11GK103740820SQ201310722709
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】周曉犢, 薛群, 王淑一 申請人:合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司