克羅恩病的基因表達標記的製作方法

2023-04-30 00:21:31

專利名稱：克羅恩病的基因表達標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及炎症性腸病發病機理中的基因表達譜，包括在炎症性腸病檢測和診斷中的用途。相關領域的描述免疫相關的炎症性疾病是相當複雜的、常常是多個相聯生物途徑的表現或結果，在正常生理中這些生物途徑對於對損傷或創傷的反應，發起損傷或創傷修復和增加對外來生物的先天和獲得性防禦至關重要。當這些正常生理途徑引起另外的損傷或創傷是與反應強度直接相關，作為異常調節或過度刺激的結果，作為對自身的反應或這些的組合時，發生疾病或病狀。儘管這些疾病的起源常常涉及多步途徑，並且常常涉及多個不同的生物系統/途徑，但在關鍵時刻幹預這些途徑的一個或多個可具有改善或治療效果。可通過對抗有害過程/途徑或刺激有益過程/途徑進行治療幹預。已知許多免疫相關疾病並且已經得到廣泛研究。這類疾病包括免疫介導的炎症性疾病、非免疫介導的炎症性疾病、感染性疾病、免疫缺陷疾病、瘤形成等。術語炎症性腸病(「IBD」)描述了一組原因不明的慢性炎症性疾病，其中腸(腸道)變得發炎，常常引起復發性痙攣或腹瀉。估計在美國IBD的患病率為約每100，000人群中約200人患病。可將IBD患者分為兩個主要的群組，患有潰瘍性結腸炎(「UC」)的群組和患有克羅恩病(「⑶」)的群組。UC和⑶是慢性復發性疾病並且是暴露在至今仍還很不確定的環境刺激的遺傳易感個體中發生的複雜臨床實體。(Bonen和Cho, Gastroenterology. 2003 ；124:521-536 ；Gaya 等 Lancet. 2006 ；367 :1271-1284)。臨床上，IBD特徵在於常常引起長期、不可預測的病程的不同臨床表現。血性腹瀉和腹痛常常伴有發熱和體重減輕。正如嚴重疲勞，貧血很常見。從關節痛到急性關節炎以及肝功能異常的聯合表現通常與IBD有關。與普通人群相比，IBD患者患結腸癌的風險也升高。在IBD急性「發作」期間，通常工作和其它正常活動是不可能的，並且患者常常住院治療。雖然IBD的原因仍然不明，但已涉及若干因素，例如遺傳、感染和免疫易感性。在白種人，尤其是猶太血統的白種人中，IBD更常見。所述病狀的慢性炎症性性質已促使人們仔細尋找可能的感染原因。雖然已經找到刺激急性炎症的試劑，但未找到引起與IBD相關的慢性炎症的試劑。IBD是自身免疫性疾病的假設受到先前提到的如關節炎的IBD腸外表現和用已知抑制免疫反應的治療劑(如腎上腺糖皮質激素、環孢黴素和硝基咪唑硫嘌呤)治療IBD的已知積極反應支持。另外，使胃腸道比身體的任何其它器官更多地連續暴露於潛在抗原物質，例如來自食物的蛋白質、細菌副產物(LPS)等。IBD的亞型是UC和CD。UC和⑶的診斷標準有足夠重疊以致有時不可能確定指定患者患有UC還是⑶；然而，通常所見的病變類型不同，定位也是如此。UC主要在結腸、直腸近側出現，並且特徵性病變為黏膜表面潰瘍；CD可出現在腸的任何地方，偶爾涉及胃、食道和十二指腸，並且通常將病變描述為大量線性裂縫。CD與UC的區別在於炎症延伸穿過腸壁各層並且涉及腸繫膜以及淋巴結。CD可能影響從口腔至肛門的消化道的任何部分。所述疾病常常不連續，即嚴重病變腸段與顯然無疾病的區域分開。在⑶中，腸壁也變厚，這可導致梗阻。另外，瘻管和裂縫並不少見。當前IBD的治療通常涉及施用僅產生局部效果的抗炎或免疫抑試劑，例如柳氮磺胺吡啶、皮質類固醇、6-巰基嘌呤/硝基咪唑硫嘌呤或環孢黴素。如果抗炎/免疫抑制治療失敗，結腸切除術是最後一道防線。未涉及直腸的CD的典型手術是切除術(去除病變腸段)和吻合術(重接)，無需造瘻術。可去除小腸或大腸的區段。約30%的CD患者需要在診斷後的第I年內手術。在隨後幾年中，比率為每年約5%。不幸的是，CD的特徵在於復發率高；約5%的患者每年在最初手術後需要第二次手術。改進炎症性腸病的診斷涉及使用標準分類標準評估疾病的進展狀況。用於IBD的分類系統包括將結腸炎分為輕度、中度或重度的Truelove和Witts指標(Truelove
S.C.和 Witts, L. J. Br Med J. 1955 ;2 :1041-1048)以及 Lennard-Jones (Lennard-JonesJE. Scand J Gastroenterol Suppl 1989 ； 170 :2_6)和簡明臨床結腸炎活動性指標(SCCAI)(Walmsley等Gut. 1998 ；43 :29-32)。這些系統將這些變量分為每日排便、直腸出血、溫度、心率、血紅蛋白含量、紅細胞沉降率、體重、血細胞比容得分和血清白蛋白含量。在約10-15%病例中，不能確診潰瘍性結腸炎或克羅恩病並且常常將這種病例稱為「未定型結腸炎」。可用兩個能夠幫助診斷的抗體檢測試驗，每個試驗測定血液中的抗體。抗體為「核周抗中性粒細胞抗體」(pANCA)和「抗釀酒酵母抗體」(ASCA)。多數患有潰瘍性結腸炎的患者有PANCA抗體，但沒有ASCA抗體，而多數患有克羅恩病的患者有ASCA抗體，但沒有pANCA抗體。然而，因為一些患者不具有任何一種抗體並且一些克羅恩病患者可能僅有PANCA抗體，這兩個試驗均有缺點。對於臨床實踐而言，根據分子標記而非測量大量變量將表明IBD的存在和/或進展的可靠試驗可用於鑑定和/或治療患有IBD的個體。未假設的聯繫和相關研究已鑑定與UC相關的基因座，尤其是染色體6上的MHC區(Rioux等 Am J Hum Genet. 2000 ；66 :1863-1870 ；Stokkers 等 Gut. 1999 ；45 :395-401 ；Van Heel等 Hum Mol Genet. 2004 ; 13 :763-770)染色體 12 上的 IBD2 基因座(Parkes 等 Am J HumGenet. 2000 ；67 :1605-1610 ；Satsangi 等 Nat Genet. 1996 ；14 :199-202)和染色體 5 上的IBD5 基因座。(Giallourakis 等 Am J. Hum Genet. 2003 ;73 :205-211 ;Palmieri 等 AlimentPharmacol Ther. 2006 ；23 :497-506 ；Russell 等 Gut. 2006 ；55 :1114-1123；ffaller 等Gut. 2006 ；55 =809-814)。在鑑定染色體7q上UC的相關推定基因座的UK全基因組連鎖掃描後，進一步研究已牽涉UC細胞解毒中涉及的ABCBl (MDRl)基因的變體。(Satsangi等 Nat Genet. 1996;14 :199-202 ;Brant 等 Am J Hum Genet. 2003;73 :1282-1292 ;Ho 等Gastroenterology. 2005 ；128 :288-296)對於引起在炎症性腸病(IBD)中觀察到的慢性腸炎症的複雜的基因-基因和基因-環境的關係的鑑定和理解的互補方法是微陣列基因表達分析。微陣列允許在組織和細胞水平的基因表達的綜合圖，從而幫助理解潛在的病理-生理過程。(Stoughton等AnnuRev Biochem. 2005 ；74 :53-82)。1997年，最初將微陣列分析應用於IBD患者，比較CD患者的手術切除物中和風溼性關節炎患者的滑膜組織中96個基因的表達。(Heller等ProcNatl Acad Sci U S A. 1997 ;94 :2150-2155)。用微陣列平臺查詢來自IBD患者的手術樣本的進一步研究鑑定了病變樣本與對照比較時差異調節的許多新型基因。(Dieckgraefe等、Physiol Genomics. 2000 ；4 :1-11 ；Lawrance 等 Hum Mol Genet. 2001 ； 10 :445-456)。當前證據表明炎症性腸病、克羅恩病(CD)和潰瘍性結腸炎(UC)是有重要環境相互作用和刺激的複雜性非孟德爾式多基因病。(Gaya等Lancet 2006 ；367 =1271-1284) 0N0D2/CARD15基因的變體與對CD的易感性有關的發現被認為是具有裡程碑意義的發現並且已經促成對⑶發展中先天和適應性免疫反應的作用的廣泛關注。(Hugot等Nature2001 ；411 =599-603 ;Ogura 等 Nature 2001 ；411 :603-606)。最近全基因組掃描(GWS)已鑑定了許多與⑶有關的基因變體。對日本⑶人群進行了最初全基因組相關性研究(Yamazaki等Hum Mol Genet 2005 ; 14 :3499-3506)，並且現已對北美和歐洲的CD人群進行了後續研究。最初在US研究中觀察到染色體1ρ31上IL-23R基因的多態性與CD有關(Duerr等Science 2006 ；314 :1461-1463)，並且現在這已在歐洲流傳，促進了對IL_23/Thl7途徑的關注。(The Wellcome Trust Case Control Consortium,Nature 2007 ；447 :661-678)。在過去2年中，對歐洲血統人群進行的許多全基因組相關性研究(GWAS)和後續整合分析(meta-analysis)已鑑定了 32個確認的⑶易感性基因/基因座。(Barrett等Nat Genet2008年8月；40(8) :955-62)。這些包括對CD有特異性的先天免疫基因；最初在2001年描述的 N0D2 (Hugot 等Nature 2001 ;411 (6837) :599-603 ;0gura等 Nature 2001 ;411 (6837)603-6)和自體吞曬基因 ATG16L1 和 IRGM(The Wellcome Trust Case Control Consortium,Nature 2007 ；447 :661-678)，清楚地表明細菌的細胞內加工的缺陷構成了 CD發病機理的主要特點。IL-23R的種系變體在CD中具有保護性的發現與詳述IL-23(而非與之共用P40亞單位的IL-12)對Thl7驅使的慢性腸炎症的作用的鼠科動物實驗一致。(Duerr等Science 2006 ;314(5804) : 1461-3 ;Maloy 等 mucousl Immunol 2008; I (5) :339-49)。對UC的整合分析和後續研究已證明3個其它IL-23途徑基因(IL12B、JAK2和STAT3)全部為IBD 易感性基因。(Barrett 等 Nat Genet 2008，Aug ;40 (8) :955-62)。目前，沒有對CD進行大規模腸全基因組表達研究。現在迫切需要詳細探究新型基因相關性的功能和表達。先前我們已經應用了全基因組表達技術來檢查來自UC患者的結腸活檢的基因譜。(Noble等Gut 2008，Oct ;57 (10) :1398-405)。發現包括健康成人結腸中的表達梯度和許多新型基因以及確定的候選基因(例如，α防禦素5和6)的表達變化。在健康成人結腸中，聚類分析顯示了左右結腸之間的基因表達差異，並且發育基因Η0ΧΑ13、Η0ΧΒ13、GLIl和GLI3主要促進了這種分離。在UC中，血清澱粉狀蛋白Al (SAAl)和α防禦素Α5&6的表達增強，並且通過免疫組織化學和原位雜交將DEFA5&6表達增強進一步表徵為潘氏細胞化生。觀察到越來越多的腸上皮細胞(IEC)在腸免疫自穩中起關鍵作用。實際上，發現N0D2/CARD15和其它病原相關分子模式(PAMP)受體在識別腸內病原體和響應細胞應激信號中起的作用已使IEC處於腸免疫防禦的前沿。(Strober等，J. C lin. Invest 2007 ；117(3) :514-21. )。IEC反應靶向核轉錄因子NF-κ B (該途徑的主要調節子)。目前，已對免疫細胞亞類進行了許多微陣列研究以試圖理解活化和炎症期間基因表達的差異。來自6個免疫細胞類型的匯總的全基因組表達已使研究人員鑑定了一批在免疫細胞中有特異性表達標記的在矽中的免疫反應基因。(Abbas等Genes Immun 2005 ；6 319-331)。這些基因已使研究人員區別在免疫細胞亞類中的信號轉導途徑並且表徵已知在免疫反應中起作用的基因和功能未知的基因的炎症反應。內窺鏡檢查pinch黏膜活檢已使研究人員獲得來自更大範圍患者(包括患有較輕疾病的那些)的微陣列組織。Langmann等使用微陣列技術分子分析了來自結腸和迴腸末端的肉眼觀察未染病區域的活檢樣本中的22，283個基因。(Langmann等Gastroenterology. 2004 ；127 26-40)。在UC患者的結腸中參與細胞解毒和生物轉化(孕烷X受體和MDR1)的基因顯著下調，然 而這些基因在來自⑶患者的活檢中的表達無變化。Costello 和同事(Costello 等 PLoS Med. 2005 ；2 el99)檢查 33792 序列在從健康對照、CD和UC患者獲得的內窺鏡檢查乙狀結腸活檢中的表達。差異性調節許多代表新型蛋白質的序列並且在矽之中的分析表明這些蛋白質具有與疾病發病機理相關的推定功能-轉錄因子、信號轉導分子和細胞粘著。在UC患者的研究中，Okahara等(AlimentPharmacol Ther. 2005 ；21 :1091-1097)觀察到與非炎症性活檢相比，在炎症性活檢中(移行抑制因子-相關蛋白14(MRP14)、生長相關致癌基因Y (GR0 Y )和血清澱粉狀蛋白Al (SAAl)上調，而 ΜΡ1和elfin下調。當觀察41趨化因子和21趨化因子受體時，Puleston等證明在活動性結腸CD和UC中趨化因子CXCL 1-3 和 8 與 CCL20 上調。(Aliment Pharmacol Ther. 2005 ;21 :109-120)。全部這些研究說明了早期微陣列平臺和組織收集的異質性。然而，儘管有這些問題，但始終觀察到許多基因的差異表達。儘管在IBD研究中有以上鑑定的改進，但是非常需要另外的能夠檢測哺乳動物中IBD和有效治療這種疾病的診斷和治療劑。本文提及的所有公布通過引用併入本文以公開並描述方法和/或引用公布相關的材料。在本申請的提交日之前引用本文引用的公布的內容。並不解釋為準許發明人沒有資格根據本發明的早先優先權日期或優先日期提前公布的日期。進一步地，實際公布日期可能與所示日期不同並且需要單獨驗證。發明概述本發明提供了與正常組織相比，在炎症性腸病(IBD)中過表達的多核苷酸和多肽，和使用這些多肽及其編碼核酸檢測或診斷哺乳動物受試者中IBD的存在並且隨後用適合的IBD治療劑治療檢測到IBD的那些受試者的方法。本發明還提供了檢測IBD(包括克羅恩病(CD))的存在並確定其進展的方法。本文公開的發明提供了檢查哺乳動物組織或細胞樣本中一個或多個基因表達標記的表達的方法和測定，其中一個或多個這種生物標記的表達預測從中取得組織或細胞樣本的哺乳動物受試者是否更可能患有IBD。在本發明的各實施方案中，所述方法和測定檢查基因表達標記(例如表I中所列的那些)的表達，並且測定表達相對於對照樣本是否是差異表達。一方面，本發明涉及檢測或診斷哺乳動物受試者中的IBD的方法，所述方法包括測定相對於在對照中的表達水平，從受試者獲得的生物樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的差異表達水平，其中差異表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID NO :5、6、8、11、12、2、14、16、18、20和22的任何一個所示的多肽的核酸的表達水平。
在一個實施方案中，診斷或檢測哺乳動物受試者中IBD的存在的方法包括測定從受試者獲得的測試樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii)一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的表達水平相對於對照中的表達水平更低，其中較低的表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID N0:5、6、8、ll、12、2、14和16的任何一個所示的多肽的核酸的較低的表達水平。
在另一個實施方案中，診斷或檢測哺乳動物受試者中存在IBD的方法包括測定從受試者獲得的測試樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii)一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的表達水平相對於在對照中的表達水平更高，其中較高的表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID NO :18、20和22的任何一個所示的多肽的核酸的較高的表達水平。一方面，所述方法涉及診斷或檢測先前診斷患有IBD並且目前處於緩解期的哺乳動物受試者中IBD的突發。受試者可能已經完成對於IBD的治療或現在正在接受對於IBD治療。在一個實施方案中，所述方法包括測定相對於對照的表達水平，從哺乳動物受試者獲得的生物樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸；或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的差異表達水平，其中表達差異表明受試者更可能有IBD突發。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID NO :5、6、8、11、12、2、14、16、18,20和22的任何一個所示的多肽的核酸的差異表達水平。在所有實施方案中，可將測試樣本與哺乳動物受試者先前的測試樣本進行比較，若可用，可在最初IBD診斷之前、之後或在最初IBD診斷時獲得先前的測試樣本。在所有方面,哺乳動物受試者優選為人患者,例如診斷患有IBD或處於發展IBD風險的人患者。受試者也可能是已經接受先前IBD治療,但處於IBD復發風險的IBD患者。對於本發明方法的所有方面，例如通過基因表達譜的方法可實現測定一個或多個本文所述基因(或編碼一個或多個由這類基因表達的多肽的一個或多個核酸)的表達水平。基因表達譜的方法可能是(例如)基於PCR的方法。在各個實施方案中，診斷包括例如通過免疫組織化學(IHC)和/或螢光原位雜交(FISH)定量(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸；或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的表達水平。對於本發明的所有方面，可相對於一個或多個參考基因或其表達產物的表達水平對基因的表達水平歸一化。對於本發明的所有方面，所述方法可進一步包括測定至少2、3、4、5、6、7、8或9個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。另一方面，本發明的方法還涵蓋根據其表達水平的證據使用一「組」這種基因(即，如本文公開的IBD標記)。在一些實施方案中，這組IBD標記將包括至少1、2、3、4、5、
6、7、8或9個IBD標記。所述組可包括相對於對照在IBD中過表達的IBD標記、相對於對照在IBD中低表達的IBD標記或相對於對照在IBD中既過表達又低表達的IBD標記。所述組可用於篩選哺乳動物受試者的一個或多個IBD標記的差異表達以確定在受試者中是否存在 IBD0
在一個實施方案中，構成組的IBD標記選自表I。在一個優選的實施方案中，診斷或檢測哺乳動物受試者中IBD的存在的方法包括測定相對於在對照中的表達水平，從受試者獲得的測試樣本中來自IBD標記組的RNA轉錄產物或其表達產物的差異表達水平，其中差異表達水平表明從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在。在測試樣本中的差異表達可能相對於如本文所討論的對照更高和/或更低。對於本發明的所有方面，所述方法可能進一步包括創建總結所述預測的報告的步驟。對於本發明的所有方面，根據本發明的方法診斷或檢測的IBD為克羅恩病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)或CD和UC。對於本發明的所有方面，從哺乳動物受試者獲得的測試樣本源自結腸組織活檢。在一個優選的實施方案中，活檢是選自迴腸末端、上行結腸、下行結腸和乙狀結腸的組織。在其它優選的實施方案中，活檢來自炎症性結腸區域或非炎症性結腸區域。炎症性結腸區域可能急性炎症性的或慢性炎症性的。對於所有方面，表達水平的測定可進行一次以上。對於本發明的所有方面，可在任何手術之前和/或之後，患者受到任何治療之前進行表達水平的測定。在一些實施方案中，測定步驟表明手術之後在哺乳動物受試者中IBD的復發或表明在所述哺乳動物受試者中所述IBD的突發。在一個優選的實施方案中，IBD為克羅恩病。在另一方面，本發明涉及治療其中已通過本文所述的方法檢測到IBD的存在的哺乳動物受試者的方法。例如，在確定相對於一個或多個RNA轉錄產物或本文所述IBD標記的相應基因產物對照，從哺乳動物受試者獲得的測試樣本表現出差異表達後，可對哺乳動物受試者施用IBD治療劑。在一個實施方案中，治療有需要的哺乳動物受試者的IBD的方法包括(a)測定相對於對照的表達水平，從受試者獲得的試樣中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的差異表達水平，其中所述差異表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在；和(b)對所述受試者施用有效量的IBD治療劑。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID N0:5、6、8、ll、12、2、14、16、18、20和22的任何一個所示的多肽的核酸的表達水平。在一個優選實施方案中，治療IBD的方法包括(a)測定從受試者獲得的測試樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的表達水平相對於在對照中的表達水平更低，其中較低的表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在；和(b)對所述受試者施用有效量的IBD治療劑。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID N0:5、6、8、ll、12、2、14和16的任何一個所示的多肽的核酸的較低的表達水平。在另一優選實施方案中，治療IBD的方法包括(a)測定從受試者獲得的測試樣本中(i)編碼一個或多個選自表I的多肽的一個或多個核酸或(ii) 一個或多個選自表I的基因的RNA轉錄產物或其表達產物的表達水平相對於在對照中的表達水平更高，其中較高的表達水平表明在從中獲得測試樣本的受試者中IBD的存在。在所有實施方案中，測定了編碼SEQ ID NO 18,20和22的任何一個所示的多肽的核酸的較高的表達水平。在一些優選的實施方案中，IBD治療劑為氨基水楊酸鹽、皮質類固醇和免疫抑制劑、中的一種或多種。一方面，以上討論的IBD標記組用於治療哺乳動物受試者的IBD的方法中。在一個實施方案中，可對哺乳動物受試者篩選標記組並且如果確定IBD的存在，則可如本文討論施用IBD治療劑。在不同方面，本發明涉及試劑盒，其包含適於進行本發明的方法的(I)提取緩衝液/試劑和方法；⑵逆轉錄緩衝液/試劑和方法和⑶qPCR緩衝液/試劑和方法的一種或多種。試劑盒可包含數據檢索和分析軟體。在一個實施方案中，差異表達表明IBD的基因為以下一個或多個CCL23、CXCL13、IRTA1、ATG16L1、ATG4D、ATG3、ATG12、ATG16L2、LC3B 或其任何組合。 本發明的這些和更多實施方案對於本領域的普通技術人員將顯而易見。附圖簡述圖I描述了編碼人IRTAl多肽的核酸序列(SEQ ID NO :1)。圖2描述了由圖I的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3描述了編碼人CCL23多肽的CK β 8-1轉錄產物的核酸序列(SEQ ID NO :3)。圖4描述了編碼人CCL23多肽的CK β 8轉錄產物的核酸序列(SEQ ID NO 4)。圖5描述了由圖3的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 5)。圖6描述了由圖4的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 6)。圖7描述了編碼人CXCL13多肽的核酸序列(SEQ ID NO 7)。圖8描述了由圖7的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 8)。圖9描述了編碼人ATG16L1多肽(同種型2)的核酸序列(SEQ ID NO 9)。

圖10描述了編碼人ATG16L1多肽(同種型I)的核酸序列(SEQ ID NO 10)。圖11描述了由圖9的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO :11)。圖12描述了由圖10的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 12)。圖13描述了編碼人ATG4D多肽的核酸序列(SEQ ID NO 13)。圖14描述了由圖13的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 14)。圖15描述了編碼人ATG3多肽的核酸序列(SEQ ID NO 15)。圖16描述了由圖15的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 16)。圖17描述了編碼人ATG12多肽的核酸序列(SEQ ID NO 17)。圖18描述了由圖17的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 18)。圖19描述了編碼人ATG16L2多肽的核酸序列(SEQ ID NO 19)。圖20描述了由圖19的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 20)。圖21描述了編碼人LC3B多肽的核酸序列(SEQ ID NO 21)。圖22描述了由圖21的核酸序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO 22)。圖23說明了來自患有克羅恩病的女性和對照的迴腸末端活檢的分級群聚。數據包括來自8名⑶患者的迴腸末端活檢，群聚了 3名具有正常迴腸末端病理學的健康對照和I名具有正常迴腸末端病理學的UC患者。對⑶、UC和對照患者注釋了活檢的炎症狀態。可使用對數鑰對紅色的測量上調程度和藍色的測量下調程度進行量化。似乎兩個區域推進了這種分離，並且對這些進行突出顯示，實線橢圓形-下調和虛線橢圓形-上調。圖24描述了比較⑶活檢和對照的基因表達的倍數變化。基因注釋-.SAAl-血清澱粉狀蛋白Al、REG L-大鼠胰島再生源性樣人同系物、S100A8&9-鈣結合蛋白A8和A9、TNIP3-TNFAIP3相互作用蛋白、IL-8-白細胞間素、IF-I受體(補體)、KCND3-鉀電壓門控通道(Shal相關亞家族)成員3、CLECSF12-C-型(鈣依賴性糖識別結構域)凝集素、胰島再生源性3 Y-胰腺炎相關蛋白2、TFECT轉錄因子EC、IGSF6-免疫球蛋白超家族成員6、八_32_卩90385-未知、6胃112-嗅質蛋白_4前體(0LM4)、MGC27165_含有4個免疫球蛋白(Ig)結構域的蛋白質、MMP3-基質金屬蛋白酶3、KLK12-血管舒緩素12、TZFP-睪丸鋅指蛋白、REG4-胰島再生源性家族成員4、CLECSF9-C-型(鈣依賴性糖識別結構域)凝集素超家族成員9、IF-I受體(補體)、AVP-預加工精氨酸抗利尿激素後葉激素運載蛋白II、AATK-細胞凋亡相關酪胺酸激酶、ECT2-上皮細胞轉化序列2致癌基因、SLC26A2-溶質載體蛋白家族26、XRRAl-X-射線輻射耐受性相關I、RPS28-核糖體蛋白S28、ISLl-胰島素基因增強子蛋白I、MGC29643-含有LY6/PLAUR結構域的蛋白I、AQP8-水通道蛋白8、FLJ25770-假定蛋白、ANKRD17-錨蛋白重複結構域17、A_32_P191066-與PN0099不大相似、FLJ12572-假定蛋白、L0C339881-與真核起始因子4B相似、NKDl-裸露表皮同系物、CA1&2-碳酸酐酶1&2、PRAC-前列腺、直腸和結腸表達的基因蛋白、L0C389023-假定基因、SLC14A2-溶質載體蛋白家族14。圖25描述了比較迴腸末端的CD活檢和對照的基因表達的倍數變化。基因注釋UBD-雙泛素、TIMD4-T細胞免疫球蛋白和含有粘蛋白結構域的蛋白質4前體、FLJ25393&FLJ27099-假定蛋白、S0X14-SRY(性別決定區 Y)-盒 14、BX108833_Soares 嬰兒大腦1NIB、HK2-己糖激酶-2、RP11-653A5. I-新型蛋白、TEX12-睪丸表達序列12、III-前列腺特異性膜抗原樣蛋白質、S100P-S100鈣結合蛋白P、Clorf34-DEME-6蛋白、朊病毒蛋白的Spm-shadow、FOLHl-葉酸水解酶、L0C92552-與MJD同系物相似、EYA2-缺眼同系物2、CEACAM3-癌胚抗原相關細胞粘著分子3、C14orf81_假定蛋白L0C90925、MUC4-粘蛋白4、TNFRSF13C-腫瘤壞死因子受體超家族成員13C、HEBPl-血紅素結合蛋白、ARHGAP24_RhoGTP酶活化蛋白24、L0C375180-智人L0C388920、SUSD2-含有sushi結構域的蛋白2、AGXT2-丙氨酸乙醛酸轉氨酶2、CYFIP2-細胞質FMRl相互作用蛋白2、FNBPl-甲酸精結合蛋白1、SLC28A2-溶質載體蛋白家族28成員2、0TTHUMP00000011522_假定蛋白MGC27169、PAX8-成對盒基因8、CXCR4-CXC趨化因子受體4、APOAl-載脂蛋白A_I、C6orf32-染色體6開放閱讀框32、NPPC-C-型尿鈉肽、CCL23-趨化因子(C-C基序)配體23、AP0C3_載脂蛋白C-III、IRTAl-免疫球蛋白超家族受體易位相關蛋白I、MGC27169-假定蛋白。圖26描述了比較非炎症性⑶和對照乙狀結腸活檢的基因表達的倍數變化。圖27描述了比較炎症性和非炎症性CD乙狀結腸活檢的基因表達的倍數變化。圖28說明了對克羅恩病和對照中IL_23/Thl7途徑的表達分析。連同由炎症狀態分開的CD和對照活檢中組成分子的基因表達一起描述了 IL-23途徑。基因表達如盒須圖所示。盒為第25和第75百分位數。與對照相比在CD活檢中和與非炎症性CD活檢相比在炎症性⑶活檢中IL-23途徑上調。圖29說明了對克羅恩病和對照中自體吞噬途徑的表達分析。基因表達的自體吞噬途徑如盒須圖所示。在20個檢查基因的6個中觀察到差異基因表達，其中ATG16LI、ATG4D和ATG3下調，而ATG12、ATG16L2和LC3B少量上調。PE-磷脂醯乙醇胺，一種與ATG8/LC3共價連接並介導自身附著於自體吞噬膜的脂質。
圖30示出由上皮細胞標記群聚的乙狀結腸克羅恩病和對照活檢。沿圖的頂部注釋結腸活檢對照(例如，數字1-5和7-11)、非炎症性^(數字6、12、34、50-51和57)、炎症性 CD(數字 15、45、49、52-55、58 和 60-61)、未治療 CD(數字 42、46_48、56 和 59)。在圖的右邊，注釋了上皮細胞因子。可使用對數鑰對紅色的測量上調程度和藍色的測量下調程度進行量化。發明詳述A.定義除非另有定義，本文使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。Singleton 等 Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 第 2版，J. Wiley&Sons (New York, NY 1994)和March, Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure 第 4 版，John ffiley&Sons (New York, NY 1992)為本領域的技術人員提供了對本申請中使用的許多術語的一般性指導。
本領域的技術人員將認識到與本文所述的方法和材料相似或等效的許多方法和材料，這些方法和材料可用於本發明的實踐中。實際上，本發明決不限於所述的方法和材料。為了本發明的目的，以下定義了以下術語。術語「炎症性腸病」或「IBD」用作潰瘍性結腸炎和克羅恩病的總稱。雖然所述兩種疾病通常被視為兩種不同的實體，但是它們的共同特徵，例如表面上皮的片狀壞死、鄰近腺隱窩的白細胞病灶性積聚和上皮內淋巴細胞(IEL)和某些巨噬細胞亞類數量增多決定將它們作為單個疾病群組進行治療。術語「克羅恩病」或「⑶」在本文中用於指涉及胃腸道慢性炎症的病狀。克羅恩相關炎症通常影響腸，但是可能在從口腔到肛門的任何地方發生。CD與UC的區別在於炎症貫穿腸壁各層並且涉及腸繫膜以及淋巴結。所述疾病常常不連續，即嚴重病變腸段與顯然無疾病的區域分開。在CD中，腸壁也變厚，這可導致梗阻，並且瘻管和裂縫的發展並不少見。如本文使用的CD可能是幾種CD的一種或多種，包括但不限於迴腸結腸炎(影響迴腸和大腸)、迴腸炎(影響迴腸)、胃十二指腸⑶(在胃和十二指腸中的炎症)、空腸迴腸炎(空腸中炎症性斑片)和克羅恩(肉芽腫)結腸炎(僅影響大腸)。術語「潰瘍性結腸炎」或「UC」在本文中用於指涉及大腸和直腸炎症的病狀。在UC患者中，存在主要涉及結腸黏膜的炎症反應。炎症通常一致且持續，不會幹預正常黏膜區域。具有嗜中性粒細胞浸潤的炎症反應中涉及表面黏膜細胞以及隱窩上皮和和黏膜下層。最後，這種反應通常發展為上皮損傷和上皮細胞損失，導致結腸多處潰瘍、纖維化、發育異常和縱向收縮。術語「非活動性」 IBD在本文中用於指先前在個體中診斷到的，但目前處於緩解期的IBD。這與其中個體已經診斷到IBD但未接受治療的「活動性」 IBD形成對比。另外，活動性IBD可能是先前診斷並且經治療的已進入緩解期(即，變成非活動性IBD)的IBD的復發。本文也可將這種復發稱為IBD的「突發」。患有活動性自身免疫疾病(例如IBD)的哺乳動物受試者可能經受突發，這是疾病活動性提高期或相應症狀重現。突發可能響應於嚴重感染、過敏反應、身體緊張、情緒創傷、手術或環境因素而發生。術語「調製」在本文中用於指上調或下調基因的表達，或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的RNA分子或等效RNA分子的水平或一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的活性，以致表達、水平或活性比在沒有調製劑的情況下觀察到的表達、水平或活性高或低。
術語「抑制」、「下調」、「低表達」和「降低」交換使用並且指相對於一個或多個對照，例如一個或多個陽性和/或陰性對照，降低基因的表達，或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的RNA分子或等效RNA分子的水平或一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的活性。術語「上調」或「過表達」用於指相對於一個或多個對照，例如一個或多個陽性和/或陰性對照，升高基因的表達，或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的RNA分子或等效RNA分子的水平或一種或多種蛋白質或蛋白質亞單位的活性。術語「診斷」在本文中用於指分子或病理狀況、疾病或病狀的鑑定，例如IBD的鑑定。術語「預後」在本文中用於指IBD發展或進展，包括手術後自身免疫突發和復發的可能性的預測。預後因素是那些與IBD自然史相關的變量，一旦患者發展了 IBD所述變量就影響患者的復發率和結果。可能與不良預後有關的臨床參數包括(例如)腹部腫塊或壓痛、皮疹、關節腫脹、口腔潰瘍和腹鳴(在腸道的咕嚕聲或擊水聲)。預後因素可用於將患者分類為基線復發風險不同的亞組。IBD的「病理」包括所有危及患者健康的現象。IBD病理主要歸因於在沒有任何已知外來抗原的情況下可導致慢性或急性炎症並且隨後潰瘍的腸內免疫系統的異常活化。臨床上，IBD特徵在於常常引起長期、不可預測的病程的不同表現。血性腹瀉和腹痛常常伴有發熱和體重減輕。正如嚴重疲勞，貧血症並不少見。從關節痛到急性關節炎以及肝功能異常的聯合表現通常與IBD有關。在IBD急性「發作」期間，通常工作和其它正常活動是不可能的，並且常常患者住院治療。這些疾病的病因未知並且尚未清楚定義首例病變；然而，已將表面上皮的片狀壞死、鄰近腺隱窩的白細胞病灶性積聚和上皮內淋巴細胞和某些巨噬細胞亞類數量增多描述為尤其是在克羅恩病中的假定早期變化。術語「治療」指對IBD的治療性治療和預防或防止措施，其中受試者將防止或減緩(減輕)目標病理病狀或病症。需要治療的受試者包括已經患有IBD的受試者以及有患IBD傾向的受試者或待防止IBD的受試者。一旦通過本文公開的方法進行了 IBD的診斷,治療目的是誘導和保持緩解。本領域的技術人員已知適於用作「IBD治療劑」的各種試劑。如本文所述，這類試劑包括但不限於氨基水楊酸鹽、皮質類固醇和免疫抑制劑。術語「測試樣本」指來自懷疑患有IBD、已知患有IBD或已知處於IBD緩解期的哺乳動物受試者的樣本。測試樣本可源於哺乳動物受試者的各種來源，包括但不限於血液、精液、血清、尿液、糞便、骨髓、黏膜、組織等。測試樣本可源於胃腸道的組織活檢，包括但不限於上行結腸組織、下行結腸組織、乙狀結腸組織、回結腸和迴腸末端組織。術語「對照」或「對照樣本」指其中預期陰性結果以幫助使測試樣本中的陽性結果關聯的陰性對照。適於本發明的對照包括但不限於已知具有正常基因表達水平的樣本、從已知沒有患有IBD的哺乳動物受試者獲得的樣本和從已知正常的哺乳動物受試者獲得的樣本。對照也可能是從先前診斷並對IBD進行了治療，目前處於緩解期的受試者獲得的樣本；並且這種對照用於測定處於緩解期的受試者中IBD的任何復發。另外，對照可能是含有與試樣中所含細胞來源相同的正常細胞的樣本。本領域的技術人員將了解適合用於本發明的其它對照。術語「微陣列」指基質上的可雜交陣元，優選多核苷酸探針的有序排列。術語「多核苷酸」當以單數或複數使用時通常指可為未經修飾的RNA或DNA或經修飾的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸。因此，例如本文定義的多核苷酸包括但不限於單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈和雙鏈區的DNA、單鏈和雙鏈RNA和包含單鏈和雙鏈區的RNA、包含可為單鏈或更通常為雙鏈或包含單鏈和雙鏈區的DNA和RNA的雜交分子。另外，如本文使用的術語「多核苷酸」指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區。這種區域中的鏈可來自相同分子或不同分子。該區域可包含一個或多個分子的全部，但更通常僅包括一些分子的一個區域。三螺旋區的一個分子通常為寡核苷酸。術語「多核苷酸」特別包括cDNA。術語包括含有一個或多個經修飾的鹼基的DNA (包括cDNA)和RNA。因此，如本文中該術語的用意，為了穩定或其它原因修飾了骨架的DNA或RNA為「多核苷酸」。而且，包含稀有鹼基(例如次黃嘌呤核苷)或經修飾的鹼基(例如氚化鹼基)的DNA或RNA包括在如本文定義的術語「多核苷酸」內。通常，術語「多核苷酸」包括未經修飾的多核苷酸的所有經化學、酶和/或代謝修飾的形式以及病毒和細胞(包括單細胞和複雜細胞)DNA和RNA特徵的化學形式。術語「寡核苷酸」指相對較短的多核苷酸，包括但不限於單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸、RNAiDNA雜交物和雙鏈DNA。常常通過化學方法，例如使用可商購的自動化寡核苷酸合成器合成寡核苷酸，例如單鏈DNA探針寡核苷酸。然而，可通過各種其它方法，包括體外重組DNA介導的技術和通過在細胞和生物體內表達DNA來製備寡核苷酸。可交換使用的術語「差異表達的基因」、「差異基因表達」及其同義詞指相對於在正常或對照受試者中，在患疾病，特別是IBD (例如UC或CD)的受試者中其表達被活化為更高或更低水平的基因。該術語還包括在相同疾病的不同階段其表達被活化為更高或更低水平的基因。還應了解，可在核酸水平或蛋白質水平活化或抑制差異表達的基因，或者可進行選擇性剪接以產生不同的多肽產物。mRNA水平、表面表達、分泌或例如多肽的其它劃分中的變化可證明這種差異。差異基因表達可包括兩個或更多個基因或其基因產物之間的表達的比較，或兩個或更多個基因或其基因產物之間的表達率的比較，或相同基因的兩種不同加工產物的比較，這在正常受試者和患病，特別是患IBD的受試者之間或在相同基因的各個階段不同。差異表達包括例如在正常和患病細胞中或已經歷不同疾病事件或疾病階段的細胞中，基因或其表達產物中的時間或細胞表達模式的定量以及定性差異。為了本發明的目的，當指定基因在正常和患病受試者中或在患病受試者疾病發展的各階段的表達存在至少I倍、至少I. 5倍、至少2倍、至少2. 5倍、至少3倍、至少3. 5倍、至少4倍、至少4. 5倍、至少5倍、至少5. 5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍差異時，認為存在「差異基因表達」。關於RNA轉錄產物的術語「過表達」用於指通過相對於參考mRNA水平歸一化而確定的轉錄水平，參考mRNA可能是在樣本或特定參考mRNA集中檢測到的所有轉錄產物。詞組「基因擴增」指在特定細胞或細胞系中形成多個拷貝的基因或基因片段的過程。常常將複製區(一段擴增DNA)稱為「擴增子」。通常，產生的信使RNA (mRNA)的量(SP基因表達水平)也按組成所表達的特定基因的拷貝數的比例增加。通常，術語「標記」或「生物標記」指染色體上可辨認的物理位置，例如限制性內切、酶識別位點或遺傳可監控的基因。標記可能是稱為「基因表達標記」的基因表達區或某一編碼功能未知的DNA片段。如本文使用的「IBD標記」指表I中所列的那些基因。本領域的普通技術人員容易地確定雜交反應的「嚴格性」，並且通常是取決於探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經驗計算。通常，較長的探針需要較高的溫度用於適當退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決於當互補鏈存在於低於其解鏈溫度的環境中時變性DNA再退火的能力。探針和可雜交序列之間所需同源性越高，可用的相對溫度越高。因此，由此可見較高的相對溫度將傾向於使反應條件更嚴格，而較低的溫度使反應條件不嚴格。雜交反應嚴格性的另外的詳情和解釋，見Ausubel等Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。如本文定義的「嚴格條件」或「高嚴格性條件」通常(1)採用低離子強度和高溫洗滌，例如在50°C下的O. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. I %十二烷基硫酸鈉；(2)在 雜交期間採用變性劑，例如甲醯胺，例如在42°C下的50% (v/v)甲醯胺和0. 1%牛血清白蛋白/0. 1% Ficol 1/0. I %聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6. 5)，和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)採用在42°C下的50%甲醯胺、5xSSC(0. 75M NaCl、0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6. 8)、0. I %焦磷酸鈉、5xDenhardt溶液、經超聲處理的鮭魚精子DNA(50y g/ml)、0. 1% SDS和10%葡聚糖硫酸酯，在42°C下在0. 2xSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)、50%甲醯胺中洗滌，然後在55°C下用含有EDTA的0. IxSSC組成的高嚴格性洗液洗滌。如 Sambrook 等 Molecular CloninR A Laboratory Manual, New York ColdSpring Harbor Press, 1989所述可鑑定「中等嚴格條件」,並且包括使用洗漆液和以上所述的較低嚴格的雜交條件(例如，溫度、離子強度和％ SDS)。中等嚴格條件的實例為在37°C下於包含20%甲醯胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7. 6)、5xDenhardt溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20mg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜，然後在約37-50°C下於IxSSC中洗滌過濾器。熟練的技術人員將認識到如何調節溫度、離子強度等，因為必須適應探針長度等因素。在本發明的上下文中提及任何特定基因集中所列的「至少I個」、至少2個」、至少5個」基因等指任何一個所列基因或所列基因的任何和所有的組合。術語「剪接」和「RNA剪接」交換使用並且指去除內含子並連接外顯子以產生成熟mRNA的RNA加工，所述成熟mRNA具有移入真核細胞細胞質的連續編碼序列。理論上，術語「外顯子」指成熟RNA產物中表示的任何斷裂基因片段(B. Lewin.Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990)。理論上，術語「內含子」指經轉錄，但通過將其任一側的外顯子拼接在一起而從轉錄產物內去除的任何DNA片段。可操作地，外顯子序列在如參考SEQ ID數字定義的基因的mRNA序列中出現。可操作地，內含子序列是被外顯子序列包括其中並且在它們的5』和3』邊界具有GT和AG剪接共有序列的基因的基因組DNA內的間插序列。「幹擾RNA」或「小幹擾RNA(SiRNA) 」是長度通常少於30個核苷酸，降低了靶基因表達的雙鏈RNA分子。可使用已知方法鑑定和合成幹擾RNA(Shi Y. ,Trends in Genetics19(1) :9-12(2003)，TO/2003056012 和 W02003064621)，並且可商購 siRNA 文庫，例如從Dharmacon, Lafayette, Colorado 購買。「天然序列」多肽是與來源於自然界的多肽具有相同的胺基酸序列的多肽，包括天然生成或等位基因變體。可從自然界分離或可通過重組或合成方式產生這種天然序列多肽。因此，天然序列多肽可具有天然生成的人多肽、鼠多肽或來自任何其它哺乳動物物種的多肽的胺基酸序列。本文的術語「抗體」在廣義上使用並且特別包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(即，雙特異性抗體)和抗體片段，只要這些抗體表現出所需生物活性。本發明特別涵蓋了針對本文公開的一種或多種IBD標記的抗體。這種抗體可稱為「抗IBD標記抗體」。如本文使用的術語「單克隆抗體」指來自一群大體上同源的抗體的抗體，即包含相同的群和/或結合相同表位的單個抗體，除在產生單克隆抗體期間可能出現的可能變體，這種變體通常少量存在。這種單克隆抗體通常包括包含結合靶標的多肽序列的抗體，其中通過包括從多個多肽序列選擇單個靶結合多肽序列的過程獲得靶標結合多肽序列。本文中的單克隆抗體特別包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類的抗體以及這種抗體的片段中的相應序列相同或同源，只要這些抗體表現出所需生物活性(美國專利No. 4，816，567 ;和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。本文的目標嵌合抗體包括包含源自非人靈長類(例如舊大陸猴、無尾猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恆定區序列的「靈長源化」抗體以及「人源化」抗體。「人源化」形式的非人(例如，齧齒動物)抗體為含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。就絕大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區的殘基被來自非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和性和能力的非人靈長類的高變區的殘基替換。本文的「完整抗體」是包含兩個抗原結合區和Fe區的抗體。優選地，完整抗體具有功能性Fe區。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選地包含其抗原結合區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段、雙鏈抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。「天然抗體」通常是由兩條相同輕(L)鏈和兩條相同重⑶鏈組成的約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數量在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間不同。每條重鏈和輕鏈也具有規律性間隔的鏈間二硫橋鍵。每條重鏈在一端具有可變結構域(Vh)，其後是若干恆定結構域。每條輕鏈在一端具有可變結構域而在另一端有恆定結構域。輕鏈的恆定結構域與重鏈的第一恆定結構域比對，並且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域比對。特定胺基酸殘基被認為形成輕鏈和重鏈可變結構域之間的界面。術語「可變的」指抗體之間可變結構域的某些部分的序列廣泛不同並且用於每個特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性在抗體的整個可變結構域不均勻分布。其集中於輕鏈和重鏈可變結構域中稱為高變區的3個片段中。可變結構域的更高保守 性部分稱為骨架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含4個FR，主要採用β摺疊構型，由3個高變區連接，形成環連接並且在一些情況下形成部分β摺疊結構。FR將每條鏈中的高變區靠在一起，並且和來自其它鏈的高變區靠在一起，有助於形成抗體的抗原結合位點(見 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。術語「高變區」、「HVR」或「HV」在本文使用時指序列可雜交和/或形成結構確定的環的抗體可變結構域的區域。通常抗體包含6個HVR，3個在VH中(HI、H2、H3)，3個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3顯示出6個HVR的大多數多樣性，並且認為尤其是H3在賦予抗體良好特異性中起獨特作用。見，例如，Xu等Immunity 13 =37-45(2000)；Johnson 和 Wu in Methods in Molecular Biology 248 1-25 (Lo 編 Human Press, Totowa,NJ, 2003) )0實際上，由重鏈組成的天然生成的駱駝抗體在沒有輕鏈的情況下具有功能且穩定。見，例如，Hamers-Casterman 等，Nature 363 :446-448(1993)和 Sheriff 等，NatureStruct. Biol. 3 :733-736 (1996)。許多HVR描述被使用並涵蓋於本文。Kabat互補決定區(OTR)基於序列可變性並且最常使用(Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991))。相反，Chothia 指結構環的位置(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))。AbM HVR 表不Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且為Oxford Molecular' s AbM抗體建模軟體所使用。「接觸」HVR基於可用複雜晶體結構的分析。以下標註了來自這些HVR的每一個的殘基。
環 Kabat AbMChothia 接觸
LIL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36
L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55
L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96HlH31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat 編號)
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia 編號)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H 58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可能包括如下的「延長 HVR」:VL 中的 24-36 或 24-34 (LI) ,46-56 或 50-56 (L2)和 89-97 或 89-96 (L3)和 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或95-102 (H3)。根據上文Kabat等這些定義的每一個為可變結構域殘基編號。表達「如Kabat中的可變結構域殘基編號」或「如Kabat中的胺基酸位置編號」及其變型指用於上文Kabat等的抗體編輯的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。使用這種編號系統，實際線性胺基酸序列可能含有很少或另外的與縮短或插入可變結構域的FR或HVR相對應的胺基酸。例如，重鏈可變結構域可包括在H2的殘基52後面的單個胺基酸插入(根據Kabat的殘基52a)和重鏈FR殘基82後面的插入殘基(例如，根據Kabat的殘基82a、82b和82c等)。可通過在抗體 序列的同源區與「標準」Kabat編號序列比對來為指定抗體確定殘基的Kabat編號。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段的相同抗原結合片段和殘留的「Fe」片段，每個抗原結合片段具有一個抗原結合位點，「Fe」片段的名稱反應了其易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生有兩個抗原結合位點的F(ab' )2片段並且仍然能夠交聯抗原。「Fv」是含有完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。這個區域由緊密非共價結合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。正是這種構型以致每個可變結構域的3個高變區相互作用以限定Vh-' 二聚體表面上的抗原結合位點。總的來說，6個高變區對抗體賦予了抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或僅包含3個對抗原有特異性的高變區的Fv的一半)有識別並結合抗原的能力，雖然親和性比整個結合位點低。Fab片段還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CHl)。通過在重鏈CHl結構域的羧基端添加幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸，Fab'片段不同於Fab片段。Fab' -SH是為本文中Fab'的名稱,其中恆定結構域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基。最初將F(ab' )2抗體片段產生為之間有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段對。抗體片段的其它化學耦合也已知。可根據恆定結構域的胺基酸序列將來自任何脊椎動物物種的抗體的「輕鏈」指定為兩種明顯不同類型(稱為K和λ)的一種。術語「Fe區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區，包括天然序列Fe區和變體Fe區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe區的界限可能不同，但是通常將人IgG重鏈Fe區定義為從位置Cys226處的胺基酸殘基或從Pro230延伸到其羧基端。例如，可在抗體生成或純化期間或通過重組工程化編碼抗體重鏈的核酸來去除C端賴氨酸(根據EU編號系統的殘基447)。因此，完整抗體的組合物可包含去除了所有K447殘基的抗體群、沒有去除K447殘基的抗體群和具有有和無K447殘基的抗體的混合物的抗體群。除非另外指明，本文免疫球蛋白重鏈中殘基的編號是如通過引用特別併入本文的Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)中 EU 指數的編號。「如Kabat中的EU指數」指人IgGl EU抗體的殘基編號。「天然序列Fe區」包含與在自然界中找到的Fe區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人Fe區包括天然序列人IgGl Fe區(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2Fe區、天然序列人IgG3 Fe區和天然序列人IgG4 Fe區及其天然生成的變體。「變體Fe區」包含由於至少一個胺基酸修飾，優選一個或多個胺基酸取代與天然序列Fe區的胺基酸序列不同的胺基酸序列。優選地，與天然序列Fe區或親本多肽的Fe區相比，變體Fe區有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fe區中或在親本多肽的Fe區中約I個至約10個胺基酸取代，並且優選約I個至約5個胺基酸取。本文中變體Fe區將優選與天然序列Fe區和/或親本多肽的Fe區具有至少約80%的同源性，並且最優選與之具有至少約90%的同源性，更優選與之具有至少約95%的同源性。根據其重鏈恆定結構域的胺基酸序列，可將完整抗體指定為不同「類別」。有5個主要的完整抗體類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類別中的幾個可進一步分為「亞類」(亞型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應抗體的不同類別的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型眾所周知。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的V1^Pt結構域，其中單多肽鏈中存在這些結構域。優選地，Fv多肽進一步包含在Vh和\結構域之間使scFv能夠形成抗原結合的所需結構的多妝連接子。對scFv的評論,見Pliickthun, The Pharmacology of MonoclonalAntibodies 中，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315頁(1994)。術語「雙鏈抗體」指帶兩個抗原結合位點的小抗體片段，這些片段包含在相同多肽鏈(Vh-VJ中與輕鏈可變結構域(')連接的重鏈可變結構域(Vh)。通過使用太短而不能使相同鏈上的兩個域之間配對的連接子，迫使結構域與另一鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。例如，在 EP 404, 097,WO 93/11161 和 Hollinger 等 Proc. Natl. Acad.Sci. USA,90 :6444-6448(1993)中更全面地描述了雙鏈抗體。「裸抗體」是未與異源分子例如小分子或放射性同位素標記偶聯的抗體。「分離的」抗體是已經鑑定並從其自然環境的組分中分離和/或回收的抗體。其自然環境的汙染物組分是幹擾抗體的診斷或治療用途的物質，並且可能包括酶、激素和其它蛋白質或非蛋白質溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化為(I)如通過Lowry方法測定以抗體重量計高於95%，並且最優選按重量計高於99%，(2)足以利用旋杯式測序儀獲得N端至少15個殘基或內部胺基酸序列的程度，或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優選使用銀染色通過SDS-PAGE均勻化。由於不存在抗體的自然環境的至少一種組分，分離的抗體包括在重組細胞內的原位抗體。然而一般地，通過至少一個純化步驟製備分離的抗體。「親和性成熟」抗體是在其一個或多個高變區有一個或多個改變，與不具有這些改變的親本抗體相比，引起抗體對抗原的親和性升高的抗體。優選的親和性成熟抗體對靶抗原有毫微摩爾或甚至皮摩爾級親和性。通過本領域已知的方法製備親和性成熟抗體。Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通過VH和VL結構域混排進行親和性成熟化。Barbas 等，Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994) ;Schier 等,Gene 169:147-155(1995) ；Yelton 等 J. Immunol. 155 :1994-2004 (1995) Jackson 等，J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995)和 Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889-896 (1992)描述了HVR和/或骨架殘基的隨機誘變。本文中「胺基酸序列變體」抗體是胺基酸序列不同於主要物種抗體的抗體。一般地，胺基酸序列變體與主要物種抗體將具有至少約70%同源性，並且優選地，胺基酸序列變體與主要物種抗體具有至少約80%，更優選至少約90%同源性。胺基酸序列變體在主要物種抗體的胺基酸序列內或與之相鄰的某些位置具有取代、缺失和/或添加。本文胺基酸序列變體的實例包括酸性變體(例如，脫醯胺化抗體變體)、鹼性變體、在其一條或兩條輕鏈上有氨基末端前導序列延伸(例如VHS-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上有C端賴氨酸殘基的抗體等，並且包括重和/或輕鏈胺基酸序列的變化的組合。本文特別感興趣的抗體變體是包含在其一條或兩條輕鏈上的氨基末端前導序列延伸，任選地進一步包含相對於主要物種抗體的其它胺基酸序列和/或糖基化差異的的抗體。
本文中「糖基化變體」抗體是與之相連的一個或多個糖類部分和與主要物種抗體相連的一個或多個糖類部分不同的抗體。本文中糖基化變體的實例包括具有與其Fe區相連的Gl或G2寡糖結構而非GO寡糖結構的抗體、有一個或兩個糖類部分與其一條或兩條輕鏈相連的抗體、沒有糖類與其一條或兩條重鏈相連的抗體等，和糖基化改變的組合。當抗體有Fe區時，寡糖結構可與抗體的一條或兩條重鏈相連，例如在殘基299 (298，殘基的EU編號)處。對於帕妥珠單抗(pertuzumab)，GO是主要寡糖結構，在帕妥珠單抗組合物中發現更少量的其它寡糖結構，例如GO-F、G-U Man5、Man6、Gl-U Gl (1-6)、Gl(1-3)和 G2。除非另外指明，本文中的「G1寡糖結構」包括G-1、G1-1、G1(1_6)和Gl (1_3)結構。本文中的「氨基末端前導序列延伸」指在抗體的任何一條或多條重鏈或輕鏈的氨基末端存在的氨基末端前導序列的一個或多個胺基酸殘基。示例性的氨基末端前導序列延伸包含或由存在於抗體變體的一條或兩條輕鏈上的3個胺基酸殘基VHS組成。「脫醯胺化」抗體是其中一個或多個天冬醯胺殘基被衍生為(例如)天冬氨酸、琥珀醯亞胺或異天冬氨酸的抗體。B. I本發明的概沭除非另外指明，本發明的實踐將採用本領域技術範圍之內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學和生物化學的常規技術。文獻中全面解釋了這類技術，例如 「Molecular Cloning A Laboratory Manual」，第 2 版(Sambrook 等，1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait 編，1984) ；^Animal Cell Culture」(R.I. Freshney 編，1987) ;「Methods in Enzymology^(Academic Press,Inc. ) ；^Handbook ofExperimental Immunology」，第 4 版(D. M. ffeir&C. C. Blackwell 編，Blackwell ScienceInc.,1987) ；^Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J. M. Miller&M. P. Calos編，1987) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel 等編，1987)和「PCR :The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis 等編，1994)。如上討論，目前通過依賴於在患者中觀察到的許多變量的各種分類系統獲得IBD檢測或診斷。本發明基於與IBD相關的基因的鑑定。因此，這種基因的表達水平可用作鑑定IBD患者的診斷標記。如實施例中所述，已經觀察到IBD患者中許多基因的差異表達。因此，根據本發明，將表I中所列的基因鑑定為在IBD中差異表達。表I
權利要求
1.一種診斷哺乳動物受試者中炎症性腸病(IBD)的存在的方法，所述方法包括測定相對於對照的表達水平，從受試者獲得的測試樣本中編碼如SEQ ID NO :5、6、8、11、12、2、14、.16、18、20和22的任何一個所示的多肽的核酸的差異表達水平，其中所述差異表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述差異表達水平是編碼如SEQID N0:5、6、8、.11、12、2、14和16的任何一個所示的多肽的核酸的較低的表達水平,其中所述較低的表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述差異表達水平是編碼如SEQID NO :18、20和.22的任何一個所示的多肽的核酸的較高的表達水平，其中所述較高的表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在。
4.根據權利要求1、2或3所述的方法，其中所述哺乳動物受試者為人患者。
5.根據權利要求4所述的方法，其中通過基因表達譜的方法獲得所述表達水平的證據。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述方法是基於PCR的方法。
7.根據權利要求5所述的方法,其中相對於一個或多個參考基因或其表達產物的表達水平對所述表達水平歸一化。
8.根據權利要求1、2或3所述的方法，所述方法包括測定至少2個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
9.根據權利要求1、2或3所述的方法，所述方法包括測定至少3個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
10.根據權利要求I或2所述的方法，所述方法包括測定至少4個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
11.根據權利要求I或2所述的方法，所述方法包括測定至少5個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
12.根據權利要求1、2或3所述的方法，所述方法進一步包括創建總結所述IBD檢測的報告的步驟。
13.根據權利要求1、2或3所述的方法，其中所述IBD是克羅恩病。
14.根據權利要求1、2或3所述的方法，其中所述測試樣本來自結腸組織活檢。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述活檢來自選自迴腸末端、上行結腸、下行結腸和乙狀結腸的組織。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述活檢來自炎症性結腸區域。
17.根據權利要求14所述的方法，其中所述活檢來自非炎症性結腸區域。
18.根據權利要求1、2或3所述的方法，其中所述測定步驟表明在所述哺乳動物受試者中IBD的復發，並且其中所述哺乳動物受試者被先前診斷患有IBD並且對於所述先前診斷的IBD對其進行治療。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述治療包括手術。
20.根據權利要求1、2或3所述的方法，其中所述測定步驟表明在所述哺乳動物受試者中所述IBD的突發。
21.一種治療有需要的哺乳動物受試者的炎症性腸病(IBD)的方法，所述方法包括以下步驟 (a)測定相對於對照的表達水平，從所述受試者獲得的測試樣本中編碼如SEQID NO5、6、8、11、12、2、14、16和18的任何一個所示的多肽的核酸的差異表達水平，其中所述差異表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在；和 (b)對所述受試者施用有效量的IBD治療劑。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述差異表達水平是編碼如SEQID NO :5、6、8、11、12、2、14和16的任何一個所示的多肽的核酸的較低的表達水平,其中所述較低的表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述差異表達水平是編碼如SEQID NO :18、20和22的任何一個所示的多肽的核酸的較高的表達水平，其中所述較高的表達水平表明在從中獲得所述測試樣本的所述受試者中IBD的存在。
24.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述哺乳動物受試者為人患者。
25.根據權利要求24所述的方法，其中通過基因表達譜的方法獲得所述表達水平的證據。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述方法是基於PCR的方法。
27.根據權利要求26所述的方法,其中相對於一個或多個參考基因或其表達產物的表達水平對所述表達水平歸一化。
28.根據權利要求21、22或23所述的方法，所述方法包括測定至少2個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
29.根據權利要求21、22或23所述的方法，所述方法包括測定至少3個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
30.根據權利要求21或22所述的方法，所述方法包括測定至少4個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
31.根據權利要求21或22所述的方法，所述方法包括測定至少5個所述基因或其表達產物的表達水平的證據。
32.根據權利要求21、22或23所述的方法，所述方法進一步包括創建總結所述IBD檢測的報告的步驟。
33.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述IBD是克羅恩病。
34.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述測試樣本來自結腸組織活檢。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述活檢來自選自迴腸末端、上行結腸、下行結腸和乙狀結腸的組織。
36.根據權利要求34所述的方法，其中所述活檢來自炎症性結腸區域。
37.根據權利要求34所述的方法，其中所述活檢來自非炎症性結腸區域。
38.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述測定步驟表明在所述哺乳動物受試者中IBD的復發，並且其中所述哺乳動物受試者被先前診斷患有IBD並且對於所述先前診斷的IBD對其進行治療。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述治療包括手術。
40.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述測定步驟表明在所述哺乳動物受試者中所述IBD的突發。
41.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述IBD治療劑為氨基水楊酸鹽。
42.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述IBD治療劑為皮質類固醇。
43.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中所述IBD治療劑為免疫抑制劑。
全文摘要
本發明涉及炎症性腸病發病機理的基因表達譜的方法，其中測定了相對於對照，來自哺乳動物受試者的測試樣本中一個或多個IBD標記的差異表達，其中所述測試樣本中的差異表達表明從中獲得所述測試樣本的所述哺乳動物受試者中的IBD。
文檔編號C12Q1/68GK102639710SQ201080041766
公開日2012年8月15日 申請日期2010年7月19日 優先權日2009年7月20日
發明者A.R.阿巴斯, C.L.諾布爾, C.李斯, H.克拉克, J.薩特桑吉, L.迪爾 申請人:基因泰克公司