殼聚糖酶的分離純化工藝的製作方法
2023-04-30 15:39:01
專利名稱：殼聚糖酶的分離純化工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種殼聚糖酶的分離純化工藝，具體而言就是用交聯殼聚糖樹脂對產殼聚糖酶的真菌粗提液中殼聚糖酶進行親和吸附，用Cu2+洗脫，再用凝膠過濾層析而分離提純出來的方法。
背景技術：
殼聚糖酶為殼聚糖的專一性水解酶，被廣泛用於殼寡糖的製備工藝中，具有很高的應用價值。目前，殼聚糖酶的生產主要是從產殼聚糖酶的真菌發酵液中來提取。在殼聚糖酶的分離純化中，目前文獻報導的常用工藝是鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析相結合的方法。例如，《鄭州工程學院學報》2001(4)，19～23報導蔡靜平等將假單胞菌VIIIT39發酵液依次進行硫酸銨鹽析、透析和Sephadex G-100層析，得到電泳純的殼聚糖酶，活力回收為36.55％；《無錫輕工業大學學報》2004(3)，10～14報導陳小娥等將麴黴CJ22-326的初提液依次經過乙醇沉澱、CM-Sepharose FF離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析和Phenyl SepharoseCL-4B疏水層析，得到電泳純的殼聚糖酶，活力回收為22.17％；《中國醫藥工業雜誌》2002(8)，378～381報導葛正紅等分離純化青黴菌產生的殼聚糖酶，依次採用硫酸銨分級沉澱、DEAE-cellulose離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析，得到電泳純的殼聚糖酶，活力回收率為21％；《食品與發酵工業》2004(5)，49～52報導邱樂泉等對假單胞菌H3的殼聚糖酶粗酶液依次用硫酸銨沉澱、Sephadex G-25脫鹽、Sepharose Q-XL陰離子交換層析和Superdex G-75凝膠過濾層析進行純化，得到電泳純的殼聚糖酶，活力回收率為18.2％。綜上所述，採用鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析相結合的方法雖可純化殼聚糖酶，但純化步驟繁瑣、工藝條件控制複雜、經多步驟操作後酶活力損失大，回收率較低，而且煩瑣的分離工藝中使用了多種分離介質，導致成本增加。
發明內容
綜合考慮各種分離純化工藝的利弊，本發明提出了一種用交聯殼聚糖樹脂親和層析純化殼聚糖酶的具體方法。該方法具有特異性高、工藝簡便、蛋白質不易失活、純化效果好、回收率高以及成本低等優點，具有推廣應用價值。
本發明的殼聚糖酶的分離純化工藝是將產殼聚糖酶的真菌發酵液用交聯殼聚糖樹脂進行親和吸附，經緩衝液洗至無蛋白流出後，用1-5‰的Cu2+溶液洗脫，收集洗脫液，4℃透析濃縮後，用凝膠過濾層析進行分離。
本發明的上述方法利用酶與其天然底物的自然結合，用交聯殼聚糖樹脂直接作為親和層析的配基，不需另外選擇載體，避免了傳統親和層析載體需活化並與配基偶聯、偶聯劑溴化氰有毒等缺點，其吸附特異性高、吸附性能穩定，僅親和層析這一步純化倍數即可達30。
本發明的上述方法採用低濃度的Cu2+作為親和層析的洗脫劑，大大降低了成本。有研究表明Cu2+能通過與殼聚糖的N原子之間形成N→Cu2+配位鍵而吸附於交聯殼聚糖樹脂，因此利用Cu2+和殼聚糖酶與交聯殼聚糖樹脂之間的競爭性結合即達到洗脫目的。交聯殼聚糖樹脂可用濃度低於1％的醋酸或1mmol/L的EDTA再生。
本發明的上述方法將親和層析和凝膠過濾層析相結合，能得到電泳純的殼聚糖酶，活力回收率達45％。
以下結合附圖所示的試驗結果，通過若干實例的具體實施方式
，再對本發明的上述內容作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅局限於下述的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
殼聚糖酶SDS-PAGE圖譜1為粗酶液，2為親和層析穿透峰，3為親和層析洗脫液，4為分子篩層析收集的殼聚糖酶，5為低分子量蛋白標準
具體實施例方式
實例1(1)球孢白僵菌發酵液離心除去菌絲體，收集上清得到粗酶液。(2)交聯殼聚糖樹脂製備將2.5％殼聚糖鹽酸溶液用注射器注入凝結液(20％NaOH、30％甲醇混合均勻)，得白色空心球，用水洗至中性後用丙酮洗滌，50℃真空乾燥。將上述方法所得乾燥品置於戊二醛溶液中，磁力攪拌4小時後用水和丙酮反覆洗滌除去戊二醛，最後50℃真空乾燥即得交聯的珠狀殼聚糖樹脂。(3)交聯殼聚糖樹脂裝柱，取粗酶液100ml上樣，再用20mmol/L醋酸緩衝液洗至無蛋白流出。(4)以4‰的Cu2+、25ml/h的流速洗脫8小時。(5)收集洗脫液透析濃縮後以Superdex 75分離，收集活性峰。(6)交聯殼聚糖樹脂用1％醋酸再生。得到電泳純的殼聚糖酶，回收率為45.32％。
實例2(1)球孢白僵菌發酵液離心除去菌絲體，收集上清得到粗酶液。(2)交聯殼聚糖樹脂製備將2.5％殼聚糖鹽酸溶液用注射器注入凝結液(20％NaOH、30％甲醇混合均勻)，得白色空心球，用水洗至中性後用丙酮洗滌，50℃真空乾燥。將上述方法所得乾燥品置於戊二醛溶液中，磁力攪拌4小時後用水和丙酮反覆洗滌除去戊二醛，最後50℃真空乾燥即得交聯的珠狀殼聚糖樹脂。(3)交聯殼聚糖樹脂裝柱，取粗酶液100ml上樣，再用25mmol/L醋酸緩衝液洗至無蛋白流出。(4)以5‰的Cu2+、25ml/h的流速洗脫10小時。(5)收集洗脫液透析濃縮後以Superdex 75分離，收集活性峰。(6)交聯殼聚糖樹脂用1mmol/L EDTA再生。得到電泳純的殼聚糖酶，回收率為46.55％。
實例3(1)球孢白僵菌發酵液離心除去菌絲體，收集上清得到粗酶液。(2)交聯殼聚糖樹脂製備將2.5％殼聚糖鹽酸溶液用注射器注入凝結液(20％NaOH、30％甲醇混合均勻)，得白色空心球，用水洗至中性後用丙酮洗滌，50℃真空乾燥。將上述方法所得乾燥品置於戊二醛溶液中，磁力攪拌4小時後用水和丙酮反覆洗滌除去戊二醛，最後50℃真空乾燥即得交聯的珠狀殼聚糖樹脂。(3)交聯殼聚糖樹脂裝柱，取粗酶液100ml上樣，再用20mmol/L醋酸緩衝液洗至無蛋白流出。(4)以3‰的Cu2+、25ml/h的流速洗脫8小時。(5)收集洗脫液透析濃縮後以Superdex 75分離，收集活性峰。(6)交聯殼聚糖樹脂用1mmol/L EDTA再生。得到電泳純的殼聚糖酶，收率為43.63％。
殼聚糖酶活力測定採用PMAB法。用鹽酸氨基葡萄糖(GlcN-HCl)溶液做標準曲線。一個酶活力單位定義為每分鐘釋放1μg GlcN-HCl還原糖所需要的酶量。
權利要求
1.殼聚糖酶的分離純化工藝，用交聯殼聚糖樹脂親和層析進行分離純化。其特徵在於將產殼聚糖酶真菌發酵液離心得粗酶液，經交聯殼聚糖樹脂親和吸附，以緩衝液洗至無蛋白流出，再以一定濃度的Cu2+洗脫，洗脫液透析濃縮後用凝膠過濾層析進行分離，獲得電泳純的殼聚糖酶。交聯殼聚糖樹脂用醋酸或EDTA再生。
2.如權利要求1所述的殼聚糖酶的分離純化工藝，其特徵在於可用於產殼聚糖酶真菌發酵液或粗酶提取液中殼聚糖酶的分離純化。
3.如權利要求1所述的殼聚糖酶的分離純化工藝，其特徵在於直接用交聯殼聚糖樹脂進行親和層析。
4.如權利要求1所述的殼聚糖酶的分離純化工藝，其特徵在於用Cu2+作為親和層析的洗脫液。
5.如權利要求1所述的殼聚糖酶的分離純化工藝，其特徵在於洗脫用Cu2+的濃度為1-5‰。
全文摘要
本發明涉及殼聚糖酶的分離純化工藝。將產殼聚糖酶真菌發酵液離心得粗酶液，經交聯殼聚糖樹脂親和吸附，用緩衝液洗至無蛋白流出，再以1－5‰的Cu
文檔編號C12N9/24GK101078008SQ20071004834
公開日2007年11月28日 申請日期2007年1月29日 優先權日2007年1月29日
發明者餘蓉, 李曉紅, 楊俐, 楊繼虞 申請人:四川大學