乾酪乳桿菌改組菌株、製備方法及發酵生產l－乳酸的製作方法
2023-04-30 05:27:41
專利名稱：乾酪乳桿菌改組菌株、製備方法及發酵生產l－乳酸的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種產酸速率快及耐酸性強的乾酪乳桿菌基因組改組菌株、該改組菌株的製備方法及該菌株用於發酵生產L-乳酸。
背景技術：
乳酸是一種廣泛應用於食品、醫藥、化工等行業的有機酸，尤其是以它作為單體可用於製備生物可降解塑料-聚乳酸，緩解能源和環境問題，因此乳酸的生產日益得到重視。由於乳酸的光學純度對聚乳酸的物理性質和生物可降解率有重要影響，高光學純度L-乳酸的需求量日益增加。微生物發酵可以獲得理想光學純度的乳酸，但是，在微生物發酵法生產乳酸過程中，因為菌種、培養基，培養條件、發酵和提取方法等諸多因素的影響，導致L-乳酸在產量、得率和純度上都有很大差異。目前應用生產L-乳酸常用的菌有兩大類，一類為乳酸菌，另一類為根黴(Rhizopus royzae)。根黴發酵屬於好氧異型發酵，通過糖酵解途徑，發酵產生L-乳酸的同時產生乙醇、富馬酸等，產物複雜；糖轉化率較低。乳酸菌發酵為同型發酵，可以將1mol葡萄糖轉化為2mol乳酸，理論轉化率為100％；另外，乳酸菌厭氧發酵可以大規模降低能耗，減少乳酸的生產成本。近年來，由於乳桿菌具有較強的耐酸性和可以利用基因工程選擇生產D-和L-乳酸的能力而廣泛用於乳酸發酵生產，其中乾酪乳桿菌鼠李糖亞種(L.caseisubsp.Rhamnosus)是僅生產L-乳酸的同型乳酸發酵菌株，也是L-乳酸生產最常用菌株。但是，在使用此菌株生產L-乳酸過程中，存在兩個重要問題，一個是產酸速率低，生產周期長；另一個是菌種耐酸性差，只能在近中性條件下發酵。乳酸發酵是典型的產物抑制型生物轉化過程，游離乳酸的積累會抑制細胞生長和產品生產，通常需要加入氨水和碳酸鈣等鹼性物質進行中和，使發酵體系pH維持在6.0-6.5之間。值得注意的是，近年來發展起來的乳酸原位分離耦聯發酵技術，即採用電滲析等方法除去反應體系中的乳酸來解除產物抑制作用。篩選能夠在低pH條件下生長代謝的微生物，尤其是在pH低於3.8(乳酸pKa＝3.86)以下，游離乳酸濃度佔總乳酸的比例將超過50％，可以有效的減少工業生產中雜菌的汙染，簡化產品後處理工藝，降低生產成本，還有利於發展乳酸發酵新工藝。因此，提高乳桿菌的耐酸性是改良乳酸生產菌種的一個重要發展方向，受到國內外學者的關注。Patnaik等人採用基因組改組技術，經過5輪改組，突變菌株能夠在pH 3.9條件下生長，在pH 4.0條件下發酵，乳酸產量較原始菌株菌株提高了3倍。Porro等人用Kluyveromyces Lactis表達牛的乳酸脫氫酶基因工程菌在pH 4.5條件下發酵生產L-乳酸，但是同時產生乙醇，轉化率僅為59.5％，而且發酵過程控制複雜，副產物多。我國天津科技大學也開展了細菌L-乳酸發酵的研究工作，經離子注入誘變獲得臨界乳酸濃度為24g/L的菌株，L-乳酸產量為70g/L。
基因工程作為比較成熟的基因操作技術在目前應用較為廣泛，但是生物化學和蛋白質組學以及基因分析表明乳酸菌的酸應答是一個包括與多個酶和基因相關的反應機制的複雜過程。研究表明，乳酸菌的耐酸性與F1F0-ATPase、細胞膜通透性、細胞內鹼性物質的產生以及細胞內存在的大分子保護物質(包括DNA和蛋白質)等多個機制有關。二維電泳分析表明Lactobacillus sanfranciscensis耐酸性突變子與原始菌株之間存在63種差異表達蛋白質。代謝工程分析表明代謝系統優化需要多個酶的調節，除了基因控制以外，可能還需要一些非編碼區域的參與。另外，本研究所用菌株還未被遺傳表徵。因此，直接用分子生物學手段提高其耐酸性和產酸速率是很困難的。利用傳統誘變方法，雖然可以獲得目的菌株，但是需要大量的時間和人力。基因組改組(genome shuffling)技術是由Patnaik等人(2002年)建立的進化工程新技術，即應用多母本遞近融合(recursive fusion)，定向篩選具有重要表型特徵改變的突變體。基因組改組作為有效的工業微生物菌種改造技術，可以用於工業微生物複雜表型的改良。值得注意的是，目前為止，僅僅應用基因組改組改良了菌株的某一個性狀，而且融合後突變庫容量大，篩選工作量大，篩選時間長。應用生物高技術手段進行分子育種，快速獲得耐酸性強和產酸速率快的雙突變L-乳酸生產菌種，並建立L-乳酸生產的工藝路線具有重要的現實意義。
發明內容
本發明的目的之一是以乾酪乳桿菌ATCC11443為原始菌株，通過改良基因組改組技術和篩選，獲得產酸速率快、光學純度高和耐酸性強的L-乳酸生產菌株；本發明的目的之二是提供一種上述產酸速率快、光學純度高和耐酸性強的L-乳酸生產菌株的生產方法；本發明的目的之三是提供一種利用本發明獲得的菌株發酵生產L-乳酸的方法。
原始菌株--乾酪乳桿菌鼠李糖亞種ATCC11443(以下簡稱Lc-WT)購自於美國典型培養物保藏中心(ATCC)，可以用於L-乳酸的生產。最佳培養溫度為37℃，發酵生產乳酸過程中pH一般控制在5.5-6.5之間，發酵過程中需要大量的鹼性物質中和，增加了L-乳酸下遊處理操作，提高了生產成本。另外，目前新發展起來的乳酸原位分離耦聯工藝可以解除發酵液中L-乳酸的抑制，所以提高該菌株的耐酸性是一個重要的研究方向。同時我們在前期實驗過程中發現提高該菌株的生產速率還有一定的研究空間，通過提高生產速率來縮短生產周期。為了使該菌株能夠更好的用於L-乳酸生產工業，降低產品生產成本，提高其耐酸性和生產速率具有重要意義。通過基因工程和傳統誘變方法都很難獲得這樣兩種複雜性狀同時發生突變的菌株。本發明採用改良的基因組改組技術手段，可以解決這一問題。
本發明的步驟為第一步，原始菌株的培養原始菌株-乾酪乳桿菌鼠李糖亞種ATCC11443(以下稱Lc-WT)採用MRS固體培養基進行分離純化，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基，37℃，120轉/分鐘，震蕩培養過夜，8000轉/分鐘離心收集菌體，滅菌0.01M Tris·HCl(pH6.8)洗滌兩次，重懸於滅菌0.01M Tris·HCl(pH 6.8)中；第二步，菌種初級誘變原始菌株培養後，分別採用物理和化學兩種不同的誘變方法(物理方法如紫外線(功率為15W)，X射線與Y射線；化學方法如磺酸乙酯，硫酸二乙酯、環氧乙烷與亞硝基胍)對原始菌株進行誘變處理(具體誘變方法參考周德慶主編的《微生物學教程》244-250頁)，再通過低pH平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗，分別篩選得到經物理方法誘變的產酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株-Lc-UV，和經化學方法誘變的產酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株-Lc-NTG；第三步，基因組改組(genome shuffling)(1)原生質體製備與再生菌體培養將分別經紫外線和NTG初級誘變篩選得到的突變菌株於MRS培養基中過夜培養後，分別接種(接種量為2～10％)於30ml含1.0～2.0％甘氨酸液體MRS培養基，37℃振蕩培養，8000轉/分鐘離心收集菌體。將收集的菌體用LPB洗滌2次，重懸於LPB中，加入溶菌酶和變溶菌素，終濃度分別為1～20mg/mL和5～50ug/mL，於37℃酶解0.5～2.0h，顯微鏡下觀察破壁情況，90％以上菌體破壁後，離心收穫原生質體，LPB洗滌2次，重懸於LPB中備用，菌液中原生質體數均為108cfu/mL數量級。
(2)多母本遞近式原生質體融合即基因組改組(genome shuffling)將步驟(1)得到的紫外誘變和NTG誘變菌株的原生質體菌液等體積(由於上一步驟中獲得的菌液中原生質體數是相同數量級的，故而同體積的每個菌株的原生質體菌液中原生質體是數量級相等的)混合後均分為兩組，一組置於功率為15W的紫外線下處理10～50min，另一組置於60℃水浴中處理30～150min完全滅活後，混合離心，重懸於50μL LPB中，加9倍體積的40％PEG 6000，室溫放置2～6min，加5mL LPB稀釋，離心、洗滌，重懸於100μL LPB，倍數稀釋塗RM平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養5天。RM平板菌落為融合後菌株。把RM平板上菌落用滅菌生理鹽水洗下來，稀釋，塗pH 4.0YE平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養，將pH 4.0平板上獲得的菌落用生理鹽水洗下來，適當稀釋後塗布碳酸鈣平板，37℃，CO2(5％)培養箱培養48h，挑取碳酸鈣平板上透明圈較大的菌落進行搖瓶培養17h，測定產酸量，得到產酸量比原始菌株高1％以上的突變菌株，記作Lc-F1；將多個Lc-F1菌株繼續步驟(1)、(2)進行下一輪的原生質體製備、滅活、融合與篩選(pH 3.8平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗)，測定產酸量，得到產酸量比Lc-F1突變菌株高2％以上的突變菌株，記作Lc-F2；再次將篩選到Lc-F2菌株繼續按步驟(1)、(2)進行下一輪的原生質體製備、滅活、融合與篩選(pH 3.6平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗)，測定產酸量，得到產酸量比Lc-F2突變菌株高2％以上的突變菌株，記作Lc-F3。
對上述獲得的Lc-F3各菌株進行穩定性試驗、耐酸性和產酸量性質分析，獲得一株耐酸性最強和產酸速率最快的突變菌株(Lc-F34)，採用高效液相色譜結果表明，該菌株發酵液中沒有產生其他有機酸產生，乳酸仍為主要發酵產物，轉化率高於90％；Boehringer Mannheim試劑盒測定其發酵液中L-乳酸光學純度高於95％。該菌株已於2005年9月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市海澱區中關村北一條13號(100080)，保藏編號為CGMCC No.1466，分類命名為乾酪乳桿菌鼠李糖亞種Lactobacillus casei subsp.rhamnosus。
本發明提供的CGMCC No.1466菌株的特徵如下1.菌體形態特徵菌體為彎曲形杆狀，革蘭氏染色陽性，無芽孢。
2.培養特徵菌落為乳白色，有明顯突起，邊緣整齊。液體培養可以在普通搖床中進行，發酵液渾濁，液面不產生膜。
3.生理生化特徵同型發酵，產L-乳酸；可利用葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖酸鈉作為唯一碳源；接觸酶陰性；明膠不液化；牛奶不腖化；不還原硝酸鹽；不水解澱粉；生長pH值為3.2～9.5；生長溫度為5～50℃。
4.菌株培養條件平板培養需在5％的二氧化碳培養箱中進行，液體培養可以在普通搖床中進行，最適培養溫度40℃，最適pH 5.5。
5.培養基固體純化培養基MRS(MAN，ROGOSA，SHARPE)瓊脂培養基，包括蛋白腖10.0g，肉浸膏10.0g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，三水醋酸鈉晶體5.0g，Tween 80 1.0mL，檸檬酸三銨2.0g，K2HPO42.0g，瓊脂15.0g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·2H2O 0.05g，蒸餾水1000mL。也可以通過ATCC購買。
液體增殖培養基MRS液體培養基(不含瓊脂)。也可以通過ATCC購買。
發酵培養基碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖糖漿(長春大成實業集團)和乳糖的一種或多種；營養物質包括酵母抽提物、麥根、麥芽汁、毛髮水解液、大豆蛋白水解液和玉米漿(玉米漿為棕褐色、黏稠狀液體或乾粉，玉米浸泡液通過雙效或三效蒸發器進行處理即可製得玉米漿。玉米漿乾粉中蛋白質含量為20％，胺基酸為12％；液體玉米漿中含蛋白質16％～30％，胺基酸8％～12％)的一種或多種。
根據「伯傑系統細菌學手冊」(Bergy’s Manual of Systematic Bacteriology)第八版提供的鑑定方法和上述試驗結果表明，上述菌株仍屬乾酪乳桿菌鼠李糖亞種。
本發明採用滅活的雙親原生質體再融合互補獲得活性融合子的方法，進行遞近式原生質體融合，有效地提高了基因組改組(genome shuffling)後的篩選效率，為基因組改組技術的普遍應用提供了新途徑。
本發明對每一輪突變菌株進行雙表型(耐酸性和產酸速率)篩選，獲得多個親本突變株後進行基因組改組(genome shuffling)，使菌株的正突變特性高度組合，篩選到產酸速率快、耐酸性強、光學純度高的L-乳酸生產菌株。
本發明採用低pH平板(每一輪改組後所用的低pH平板的pH不同，依次為4.2，4.0，3.8，3.6)和碳酸鈣平板初篩兩種簡單的初篩方法及搖瓶復篩的方法，選育耐酸性強和產酸速率快的雙表型突變的優良菌株。具體方法如下1.平板篩選再生培養基(RM)平板固體MRS培養基(不含Tween80)中含有2.5％的明膠，20mM的MgCl2，0.5M的蔗糖，115℃滅菌20分鐘滅菌，冷卻至50℃，添加0.5％的小牛血清，倒平板。將40％聚乙二醇(PEG)6000處理6分鐘後的原生質體稀釋液塗布再生平板，CO2(5％)培養箱37℃培養，5天後觀察結果。
低pH值YE平板篩選酵母抽提物15.0g，葡萄糖100.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，4M鹽酸調節pH至4.2，4.0，3.8和3.6，115℃滅菌20分鐘滅菌，冷卻至50℃倒平板。將再生平板上融合子轉移到低pH值YE平板，CO2(5％)培養箱37℃培養，5天後觀察結果。
碳酸鈣平板篩選酵母抽提物15g，葡萄糖100g，CaCO3為2g，蒸餾水1000mL，115℃滅菌20分鐘，冷卻至50℃倒平板。將低pH平板上菌落刮下來，適當稀釋後塗布於碳酸鈣平板，CO2(5％)培養箱37℃培養，24h觀察結果。
2.搖瓶試驗 酵母抽提物15.0g，葡萄糖100.0g，瓊脂3.0g，蒸餾水1000mL，混合均勻，分別取100mL溶液置於250mL三角瓶中，加9g碳酸鈣，115℃滅菌20分鐘。實驗菌株過夜培養物接種(接種量為10％)於含100mL YE培養基(含9克碳酸鈣)的250mL三角燒瓶，37℃，120轉/分鐘振蕩培養。分別於15h～24h之間，每小時取樣測定乳酸含量。
本發明所使用的分析方法包括乳酸、乳酸鈣、葡萄糖和生物量分析。
(1)乳酸發酵液中總乳酸採用日本島津LC-9A高效液相色譜法分析，色譜條件SCR-101H有機酸柱，SPD-6AV紫外檢測器，波長210nm，流動相為10mmol HClO4；L-和D-乳酸採用Boehringer Mannheim試劑盒分析。
(2)乳酸鈣的定量測定發酵液經8000rpm，離心5min，取上清液1mL於100mL的蒸餾水中，加入1M的NaOH 10mL，加鈣指示劑2滴，用0.05M EDTA·Na2試劑滴定，終點為溶液顏色變為純藍色。由EDTA·Na2體積計算乳酸鈣和乳酸的含量。結果計算如下乳酸鈣含量WCaL.2＝218.2c*V(mg)乳酸含量WLa＝180c*V(g/L)其中V-滴定消耗EDTA·Na2的量(mL)c-EDTA·Na2的濃度(mol/L)(3)葡萄糖採用3′5-二硝基水楊酸(DNS)法進行分析。
(4)生物量細胞密度用紫外分光光度計(cary50)測定OD600。將發酵液後收集菌體，蒸餾水洗滌，重懸於蒸餾水中，調整細胞密度OD600為10左右，取50mL菌體溶液於105℃乾燥至衡重，稱重並計算。1OD600菌體密度相當於0.35g/L菌體乾重。
本發明還涉及一種生產L-乳酸的方法首先採用本領域熟知的逐級種子擴大培養方法獲得Lc-F34突變菌株的純培養物，再按2％～20％發酵培養基體積濃度的接種量將Lc-F34突變菌株的純培養物接種於含發酵培養基的密閉發酵設備中，發酵培養基中包括2％～30％體積濃度的初始碳源和1％～15％體積濃度的氮源，其餘為水；發酵液於35℃～50℃、200rpm攪拌條件下進行厭氧發酵培養，發酵過程中控制發酵液的pH值為3.2～7.0，發酵15h～120h。
在具體發酵過程中，為獲得較好的發酵效果，獲得較高的產率，可以進行補料分批發酵，在上述發酵工藝基礎上，需要補加碳源和氮源，使發酵液中碳源體積濃度維持在發酵液總體積的1％～20％之間，氮源的體積濃度維持在發酵液總體積的1％～10％之間；補加碳源時間為10h～20h；補加氮源時間為8h～20h。
發酵過程中使用鹼性物質控制發酵液的pH值，所使用的鹼性物質包括NaOH、氨水、CaCO3中的一種或多種。
本發明Lc-F34菌株所利用的碳源和氮源等營養物範圍不局限於任何指定的糖類和含氮類物質，只要能被該菌株利用並轉化形成乳酸的物質都可以。適合本發明的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖糖漿(長春大成實業集團)和乳糖，適合的氮源包括硫酸銨、酵母抽提物(Yeast extract)、硝酸銨、玉米漿以及其它營養因素-硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸鈉、乙酸鈉、米糠。
在優選實施方案中，本發明使用葡萄糖，蔗糖，乳糖作為碳源；硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白腖、酵母抽提物和玉米漿為氮源；進一步優選實施方案中，本發明使用葡萄糖作為碳源；酵母抽提物和玉米漿為氮源；本發明最佳實施方案中碳源採用D-葡萄糖，玉米漿為氮源。
進一步，本發明採用響應面分析方法，在5升發酵罐中進行本發明菌株Lc-F34發酵條件的優化實驗，確定其發酵時間、溫度、攪拌速度等生產工藝參數，以及分批補料發酵過程中最佳的補料時間。
本發明Lc-F34菌株接種量為2％～20％(體積比)，進一步優選實施方案中，本發明使用接種量為5％～15％，本發明最佳實施方案中接種量為10％。
本發明發酵過程的pH為3.2～7.0，發酵溫度為35℃～50℃；進一步優選實施方案中，本發明控制pH為4.5～6.0，控制溫度為37℃～42℃；本發明最佳實施方案中控制pH為5.5，控制溫度為40℃。
本發明採用初始碳源濃度為2％～30％，進一步優選實施方案中，本發明使用初始碳源濃度為8％～20％，本發明最佳實施方案中初始碳源濃度為10％～16％。
本發明採用初始氮源濃度為1％～15％，進一步優選實施方案中，本發明使用初始氮源濃度-酵母抽提物為1.0％～2.5％、玉米漿4.5％～7.0％；最佳實施方式中氮源濃度-酵母抽提物為1.5～2.0％、玉米漿為5.0～6.5％。
圖1(A)突變菌株庫與原始菌株在低pH 4.4值YE平板上比較；圖1(B)突變菌株庫與原始菌株在低pH 3.6值YE平板上比較；圖2改組菌株與原始菌株菌株在含CaCO3YE搖瓶發酵結果圖；圖3(A)突變菌株與原始菌株在pH 3.8 YE培養基中生長比較圖；圖3(B)突變菌株與原始菌株在pH 3.8 YE培養基中產酸比較圖；
圖4(A)改組菌株與原始菌株在pH 3.8條件下的搖瓶發酵生長過程比較圖；圖4(B)改組菌株與原始菌株在pH 3.8條件下的搖瓶發酵產酸過程比較圖；圖5優化發酵條件響應面法立體分析圖；圖65L發酵罐補料分批發酵結果圖；圖730L發酵罐的補料分批發酵結果圖；圖8pH 4.5條件下改組菌株與原始菌株發酵結果比較圖；圖9pH 5.0條件下改組菌株與原始菌株發酵結果比較圖。
如圖1所示，其中1表示原始菌株Lc-WT；2表示紫外線誘變菌株庫Lc-UV(紫外線誘變後未經篩選的混合菌株)；3表示亞硝基胍誘變菌株庫Lc-NTG(NTG誘變後未經篩選的混合菌株)；4表示第三輪改組菌株庫Lc-F3(第三輪改組後未經篩選的混合菌株)。
如圖2所示，改組菌株與原始菌株分別於YE搖瓶培養17h，乳酸產量的比較。WT表示原始菌株Lc-WT；UV依次表示紫外誘變菌株Lc-UV1，Lc-UV2；NTG依次表示NTG誘變菌株Lc-NTG1、Lc-NTG2、Lc-NTG3；F1依次表示第一輪改組菌株Lc-F11-16；F2依次表示第二輪改組菌株Lc-F21-24；F3依次表示第三輪改組菌株Lc-F31-34。
如圖3所示，突變菌株與原始菌株菌株分別於pH 3.8 YE液體搖瓶培養48小時，發酵過程中於不同時間取樣，測定OD600和乳酸產量。WT表示原始菌株Lc-WT；UV依次表示紫外誘變菌株Lc-UV1，2；NTG依次表示NTG誘變菌株Lc-NTG1-3；F1依次表示第一輪改組菌株Lc-F11-16；F2依次表示第二輪改組菌株Lc-F21-24；F3依次表示第三輪改組菌株Lc-F31-34。
如圖4所示，第三輪改組菌株與原始菌株分別於pH 3.8液體YE中搖瓶培養48小時過程中，菌體密度(OD600)與乳酸產量的比較。曲線0表示原始菌株Lc-WT；曲線1表示改組菌株Lc-F31；曲線2表示改組菌株Lc-F32；曲線3表示改組菌株Lc-F33；曲線4表示改組菌株Lc-F34。
如圖5所示，應用本發明所述菌株Lc-F34製備L-乳酸菌工藝中較適發酵溫度為37～42℃，較適pH為5.0～6.0；最適發酵溫度為40℃，最適pH為5.5。
如圖6所示，為本發明所述應用菌株Lc-F34製備L-乳酸菌工藝中採用5L發酵罐補料分批發酵結果。Lc-F34以玉米漿和葡萄糖培養基(初糖濃度為10％)，控制轉速200rpm，溫度為40℃，以碳酸鈣中和發酵過程中產生的乳酸，發酵12h，補加葡萄糖200.0g，玉米漿60.0g，發酵26h。曲線1殘糖；曲線2菌體乾重；曲線3乳酸產量。
圖7所示，30L發酵罐的補料分批發酵結果。Lc-F34以玉米漿和葡萄糖培養基(初糖濃度為10％)，控制轉速200rpm，溫度為40℃，以碳酸鈣中和發酵過程中產生的乳酸，發酵24h，補加葡萄糖1600.0g，發酵40h。曲線1殘糖；曲線2乳酸產量。
圖8所示，pH 4.5條件下改組菌株與原始菌株發酵結果比較。Lc-WT和Lc-F34，分別於5L發酵罐發酵培養，發酵培養基為液體YE培養基，工作體積為3L，以7.0M的NH4OH將pH分別控制為4.5，發酵84h，監測發酵過程中菌體密度和乳酸產量的變化。曲線1Lc-F34菌株殘糖；曲線2Lc-F34菌株菌體乾重；曲線3Lc-F34菌株乳酸產量。曲線4Lc-WT菌株殘糖；曲線5Lc-WT菌株菌體乾重；曲線6Lc-WT菌株乳酸產量。
圖9所示，pH 5.0條件下改組菌株與原始菌株發酵結果比較。Lc-WT和Lc-F34，分別於5L發酵罐發酵培養，發酵培養基為液體YE培養基，工作體積為3L，以7.0M的NH4OH將pH分別控制為5.0，發酵84h，監測發酵過程中菌體密度和乳酸產量的變化。曲線1Lc-F34菌株殘糖；曲線2Lc-F34菌株菌體乾重；曲線3Lc-F34菌株乳酸產量。曲線4Lc-WT菌株殘糖；曲線5Lc-WT菌株菌體乾重；曲線6Lc-WT菌株乳酸產量。
具體實施例方式
實施例1L-乳酸菌種的選育(1)菌種初級誘變本發明對原始菌種分別採用紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)進行如下誘變紫外線(UV)誘變原始菌株採用MRS固體培養基進行分離純化，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基，37℃，120轉/分鐘，震蕩培養過夜，8000轉/分鐘離心收集菌體，滅菌0.01M Tris·HCl(pH 6.8)洗滌兩次，重懸於滅菌0.01MTris·HCl(pH 6.8)，調整菌體濃度為108cfu/mL。將10mL菌體溶液置於滅菌(160℃乾熱滅菌箱滅菌2h)的帶磁力棒的培養皿(直徑90mm)中，培養皿放置在磁力攪拌器載物臺上，開啟攪拌器，在預熱20min的紫外燈(功率為15W，距離20cm)下邊照射邊攪拌，並計時。分別於0.5min，1.0min，1.5min，3.0min，5.0min各取2mL菌液混合，進行適當稀釋後，塗布於pH 4.2 YE平板，CO2(5％)培養箱37℃培養，5天後觀察結果。將pH 4.2 YE平板上的菌落用滅菌生理鹽水洗下來，適當稀釋後塗布碳酸鈣平板，CO2(5％)培養箱37℃培養48h，挑取碳酸鈣平板上透明圈兒較大的菌落進行搖瓶發酵，17h取樣測定產酸量。獲得兩株產酸量較高的菌株-Lc-UV1和Lc-UV2。
亞硝基胍(NTG)誘變原始菌株按紫外線誘變中所述方法進行培養，離心，洗滌，收集菌體，重懸於0.01M Tris·HCl(pH 6.0)中，調整菌體濃度為108cfu/mL。取10mL菌液等分為5份，分別加入NTG至終濃度為50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，置於30℃下保溫過夜，離心，洗滌，混勻後進行倍數稀釋，按紫外線誘變後篩選方法進行篩選，獲得三株NTG誘變菌株-Lc-NTG1、Lc-NTG2和Lc-NTG3。
以上誘變所得5株突變菌株為用於基因組重組的初始菌株。
(2)基因組改組(genome shuffling)A.原生質體製備與再生將初步篩選的紫外線和NTG誘變的5個菌株於MRS培養基中過夜培養後，分別接種(接種量為10％)於30mL含1.0％甘氨酸MRS液體培養基，37℃振蕩培養12h，離心收集菌體。將收集的菌體用LPB(0.01M Tris·HCl中含20mM MgCl2和0.5M蔗糖，pH 6.8)洗滌2次，重懸於LPB中，同時加入溶菌酶(Lysozyme北京鼎國生物技術有限責任公司提供)和變溶菌素(Mutannolysin，Sigma公司提供)，終濃度分別為10mg/mL和25ug/mL，於37℃酶解1.0～1.5h，顯微鏡下觀察破壁情況。90％以上菌體破壁後，離心收穫原生質體，LPB洗滌2次，重懸於LPB中備用。
B.多母本遞近式原生質體融合即基因組改組(genome shuffling)將步驟A中製備的5株紫外誘變菌株和NTG誘變菌株的原生質體溶液等體積混合後(保證每個菌株的原生質體數量相等)均分為兩組，一組置於紫外線下(功率為15W，距離紫外燈20cm)處理15min，另一組置於60℃水浴中處理50min完全滅活後，兩組滅活後的原生質體混合離心，重懸於50μL LPB中，加9倍體積的40％PEG 6000，室溫放置2min，加5mL LPB稀釋，離心、洗滌，重懸於100μL LPB，倍數稀釋塗RM平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養5天。把RM平板上菌落用滅菌生理鹽水洗下來，稀釋，塗pH 4.0 YE平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養，經pH 4.0平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗篩選，獲得6株產酸量高、耐酸性強的突變菌株，即第一輪重組菌株Lc-F11、Lc-F12、Lc-F13、Lc-F14、Lc-F15、Lc-F16。將所得6個F1菌株按同樣的策略進行培養，原生質體製備，融合，再生後於pH 3.8 YE平板、碳酸鈣平板和搖瓶發酵實驗篩選，獲得第二輪重組菌株(F2)4株，記作Lc-F21、Lc-F22、Lc-F23、Lc-F24；再次將4株F2菌株進行融合、篩選(pH 3.6平板，碳酸鈣平板和搖瓶發酵實驗篩選)獲得F3菌株，Lc-F31、Lc-F32、Lc-F33、Lc-F34。以未經PEG處理的每一輪原生質體再生菌株作對照。
(3)突變菌株的遺傳穩定性實驗將第三輪改組菌株分別進行MRS液體培養基傳代培養20次，塗布pH 3.6 YE平板，通過計算活菌數比較其在平板上耐酸性變化；同時，分別進行搖瓶發酵實驗(37℃震蕩培養，17h取樣測定產酸量)，比較其產酸速率(表1)。結果可見，突變菌株經20次傳代培養，在固體平板上耐酸性和搖瓶發酵容積產率沒有發生顯著變化，表明突變菌株具有很好的遺傳穩定性。
表1.突變菌株穩定性實驗結果
實施例2突變菌株與原始菌株的比較(1)突變菌株與原始菌株在低pH YE平板上的比較將紫外線(Lc-UV)，NTG(Lc-NTG)和第三輪改組(Lc-F3)突變菌株庫與原始菌株Lc-WT分別於pH 4.4，3.6 YE平板上培養(圖1)。Lc-UV，Lc-NTG和Lc-F3菌株庫與Lc-WT在pH 4.4 YE平板上均能夠生長繁殖，而在pH 3.6 YE平板上只有Lc-F3能夠生長，其他菌株(庫)不能生長。
(2)突變菌株與原始菌株產酸速率的比較將各步驟製備的突變菌株與原始菌株(Lc-WT)分別於含9％CaCO3YE搖瓶中發酵17小時，採用EDTA滴定法測定發酵液中乳酸的含量。比較其乳酸生產情況。結果(圖2)表明，傳統誘變方法(紫外線和NTG誘變)得到突變菌株(Lc-UV1，2和Lc-NTG1-3)搖瓶發酵培養17h，其乳酸生產量較原始菌株區別不顯著；而改組菌株(Lc-F11-16，Lc-F21-24和Lc-F31-34)乳酸產量較原始菌株都有明顯提高，第三輪改組菌株提高更顯著，發酵17h，產酸量較野生菌株提高了27％。原始菌株的容積產率為4.55g/L/h，而第三輪融合菌株的容積產率在5.72-5.82g/L/h之間。取發酵液進行離心，過濾，稀釋。採用高效液相色譜與Boehringer Mannheim試劑盒分析L-乳酸純度。高效液相色譜結果表明，突變菌中沒有產生其他有機酸，乳酸仍為主要發酵產物；Boehringer Mannheim試劑盒測定改組菌株發酵液中L-乳酸光學純度達到98.2％。說明改組菌株的代謝途徑未發生改變。
(3)突變菌株與原始菌株搖瓶發酵特徵比較突變菌株與原始菌株搖瓶發酵結果比較將突變菌株與原始菌株分別於pH 3.8YE液體搖瓶中培養48小時，比較其生長和乳酸生產情況(圖3)。結果表明，傳統誘變方法得到突變菌株(Lc-UV1-2和Lc-NTG1-3)在pH 3.8條件下發酵培養48h，其菌體生長與乳酸生產量較原始菌株區別不顯著；而改組菌株(Lc-F11-16，Lc-F21-24和Lc-F31-34)無論是菌體生長量還是乳酸產量較原始菌株都有明顯提高，第三輪改組菌株提高更顯著，發酵48h，原始菌株(Lc-WT)菌體密度(OD600)為1.69，乳酸產量僅為1.59g/L，而改組菌株的菌體密度(OD600)達到3.4左右，乳酸產量均在4.6-5.0g/L之間，最好的改組菌株產酸量達到5.00g/L，是原始菌株的3.14倍。圖3所示，(4)第三輪重組菌株與原始菌株搖瓶發酵進程比較將第三輪重組菌株與原始菌株分別接種於pH 3.8 YE液體培養基，37℃發酵96h，監測發酵過程中菌體密度與乳酸產量變化情況(圖4)。由圖4可見，發酵24h前，第三輪重組菌株與Lc-WT的生長(如圖A所示)與產酸(如圖B所示)有相似之處，且各菌株之間菌體密度和產酸量又存在差異，但是，第三輪重組菌株的菌體密度和產酸量均明顯高於原始菌株。發酵24h後，原始菌株(Lc-WT)菌體密度略有增加，乳酸產量卻沒有變化，而改組後菌株的菌體密度與產酸量均呈現明顯的上升趨勢。發酵96h，而改組菌株的菌體密度(OD600)達到5.0左右，乳酸產量均在4.7-5.67g/L之間，最好的改組菌株產酸量達到5.67g/L，是原始菌株的3.5倍。說明改組菌株在酸性條件下仍能進行生長代謝，充分證明改組菌株的耐酸性得到明顯提高。由於乳桿菌產酸主要集中在對數生長期，提高菌種在穩定期的產酸量能夠有效提高發酵過程中乳酸的產量。改組菌株Lc-F31-34發酵96小時pH最低可以達到3.3，原始菌株僅達到3.5左右。
實施例3培養基的優化在L-乳酸生產過程中，原材料的價格是產品成本的一個重要影響因素。乳酸菌對營養要求較苛刻，通常需要以酵母抽提物為氮源，根據Tejayadi和Cheryan(1995)報導，用酵母抽提物為氮源生產L-乳酸的成本中，酵母抽提物佔總成本的38％。篩選廉價的發酵培養基對於降低L-乳酸的生產成本是非常必要的。因此，我們採用Placket-Burman設計(本領域常用的一種統計優化實驗設計法)方法對葡萄糖、玉米漿、米糠等營養物質進行優化，從而獲得適於大規模生產的發酵培養基。
(1)二水平試驗 對基因組改組菌株Lc-F34，採用Placket-Burman設計(表2)表.2 Placket-Burman實驗設計
對葡萄糖、硫酸銨、酵母抽提物、硝酸銨、玉米漿、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸鈉、乙酸鈉、米糠等營養物質進行優化，考察各因素的主效應和交互作用的一級作用(表3)。利用SAS軟體(Statistics Analysis System，著名的計算機統計軟體，可由網上下載)進行分析，結果表明葡萄糖、酵母抽提物和玉米漿對改組菌株Lc-F34產酸有顯著影響。
表3.Placket-Burman設計篩選培養基成分結果
(2)玉米漿濃度對對改組菌株發酵生產L-乳酸影響分別以2.5％，3.5％，4.0％，5％和5.5％玉米漿為氮源，D-葡萄糖為碳源，其濃度100g/L，進行搖瓶發酵試驗，研究不同玉米漿濃度對改組菌株Lc-F34分批發酵生產乳酸的影響(表4)。結果表明，玉米漿濃度在2.5％-5.0％之間，L-乳酸濃度隨葡萄糖濃度增加而增加。5.0％和5.5％玉米漿發酵結果基本一致。由此表明，5.0％玉米漿可以提供足夠的氮源，玉米漿作為氮源最佳濃度是5.0％。
表4.初始玉米漿濃度對改組菌株Lc-F34發酵生產乳酸影響
(3)初始葡萄糖糖濃度對改組菌株發酵生產L-乳酸影響分別以5％玉米漿為氮源，D-葡萄糖濃度為30g/L，50g/L，70g/L，90g/L，110g/L，140g/L，170g/L，200g/L進行搖瓶發酵試驗，研究不同初始葡萄糖濃度對改組菌株Lc-F34分批發酵生產乳酸的影響(表5)。結果表明，L-乳酸濃度隨葡萄糖濃度增加而增加。轉化率隨葡萄糖濃度的增加呈下降趨勢，容積產率受初糖濃度影響也很大，在初糖濃度30～110g/L之間時，容積產率逐漸增大，初糖濃度為110g/L時，容積產率達到最大(5.84g/L/h)，葡萄糖濃度繼續增加，容積產率反而減少。這是因為高糖濃度下，滲透壓增大，影響了菌體的正常生長和代謝。為了得到較高的L-乳酸的生產速度和葡萄糖轉化率，可以將初糖濃度控制在90～110g/L進行補料分批發酵。補料時間應該控制通過監測發酵液中葡萄糖濃度進行控制，使發酵液中的總糖濃度不超過110g/L為益。
表5.初始葡萄糖濃度對改組菌株Lc-F34發酵生產乳酸影響
(4)玉米漿和酵母抽提物發酵生產L-乳酸結果比較採用5L發酵罐發酵培養，發酵培養基營養物質分別為酵母抽提物和玉米漿，D-葡萄糖濃度為10％，工作體積為3L，接種Lc-F34(接種量10％)，以7.0M的NH4OH將pH控制為5.5(表6)。
表6.分別以酵母抽提物和玉米漿為氮源Lc-F34菌株發酵生產L-乳酸的結果
以玉米漿代替酵母抽提物為氮源發酵17h，菌體密度和乳酸產率，轉化率及最大體積產率與酵母抽提物為氮源發酵相同時間結果基本一致。因此，玉米漿可以作為氮源用於乳酸發酵生產。
實施例4Lc-F34菌株補料分批發酵生產乳酸為了進一步研究採用改組菌株Lc-F34補料分批發酵生產乳酸工藝，採用搖瓶(酵母抽提物1.5％，D-葡萄糖初始濃度為100g/L，250mL三角瓶，裝液量100mL)發酵，並於不同時間分批補加D-葡萄糖100g/L，發酵至終點(殘留D-葡萄糖為1g/L以下)，取樣測定乳酸含量(見表7)。由表7可見，發酵液中乳酸濃度和總發酵時間隨補料時間不同而發生變化，補料時間控制在12～15h之間，乳酸產量最高，發酵時間最短。
表7不同補料時間對Lc-F34菌株發酵生產乳酸的影響
實施例5發酵條件優化採用5L發酵罐發酵培養，以液體YE培養基為發酵培養基，工作體積為3L，以7.0M的NH4OH控制pH，攪拌速度為200rpm，溫度和pH按表8中設計進行發酵17h。
表8.改組菌株Lc-F34發酵溫度和pH優化試驗設計
應用響應面分析(Response Surface Methodology，一種統計優化技術)對改組後菌株的最佳發酵條件進行優化-發酵溫度和pH值，運行SAS軟體分析實驗結果(圖5)。所得到的擬合全變量二次回歸方程為Y＝68.7530+7.2897pH+10.9896T-8.3966pH*pH+0.125T*pH-12.1477T*T由結果可知，決定係數R2＝0.8935，說明回歸方程的擬合程度較好。溫度與pH是影響改組菌株Lc-F34生產L-乳酸的重要因素(p＝0.0326和0.0418)。由圖5可知，較適發酵溫度為37～42℃，pH為4.5～6.0，最適合pH為5.5，溫度為40℃。
實施例6採用小容量發酵罐分批補料發酵生產乳酸採用5L發酵罐，初始培養基為酵母抽提物(1.5％)和D-葡萄糖培養基(初糖濃度為10％)，初始工作體積為2.5L，接種10％Lc-F34培養液，控制轉速200rpm，溫度為40℃，以碳酸鈣(在滅菌後培養基中添加9％的滅菌碳酸鈣)中和發酵過程中產生的乳酸(pH控制在4.5-6.0)，發酵10h，補加酵母抽提物30.0g；發酵12h，殘糖降為4％，補加D-葡萄糖200.0g，發酵至26h，發酵液總體積為3.36L，殘糖為1.02％，L-乳酸的濃度為118.38g/L，轉化率為95.7％，平均體積產率為4.55g/L/h(圖6)。常規乳酸生產必須添加碳酸鈣或氨水等鹼性物質進行中和，否則過多的乳酸會抑制菌體生長。
實施例7採用大容量發酵罐分批補料發酵生產乳酸採用30L發酵罐，以玉米漿(5％)和D-葡萄糖為發酵基質，初糖濃度為16％，初始工作體積為20L，接種10％Lc-F34培養液，控制轉速200rpm，溫度為40℃，以碳酸鈣(在滅菌後培養基中添加9％的滅菌碳酸鈣)中和發酵過程中產生的乳酸(pH控制在4.5-6.0)。發酵15h，補加玉米漿800g；發酵24h後，補加D-葡萄糖1600.0g，繼續發酵至40h，發酵液總體積為26.4L，殘糖為0.10％，L-乳酸的濃度為154.6g/L，轉化率為91％，平均體積產率為3.85g/L/h(圖7)。
實施例8低pH發酵生產L-乳酸Lc-WT菌株的最低生長pH為4.4，採用接近原始菌株的最低生長pH(4.5)的液體YE培養基培養Lc-WT和Lc-F34，比較兩菌株的生長及生產特徵。將第三輪重組後篩選的耐酸性高產菌株Lc-F34和Lc-WT菌株分別於5L發酵罐發酵培養，發酵培養基為液體YE培養基，工作體積為3L，以7.0M的NH4OH將pH分別控制為4.5，5.0，監測發酵過程中菌體密度和乳酸產量的變化。在pH 4.5(圖8)的條件下，發酵至84h，Lc-F34菌株獲得的菌體乾重4.54g/L，發酵液中殘糖為3.82g/L，乳酸濃度83.8g/L，轉化率為86％，平均容積產率為0.998g/L/h，最大容積產率3.59g/L/h；而Lc-WT菌株獲得的菌體乾重3.59g/L，發酵液中乳酸濃度52.17g/L，殘糖為43.1g/L，轉化率為56.2％，平均容積產率為0.623g/L/h，最大容積產率3.02g/L/h。Lc-F34菌株發酵液中乳酸濃度較原始菌株提高了60.6％，平均容積產率提高了60.2％。
在pH 5.0(圖9)的條件下，發酵至60h，Lc-F34菌株獲得的菌體乾重6.34g/L，發酵液中殘糖為0.93g/L，乳酸濃度88.06g/L，轉化率為89.6％，平均容積產率為1.47g/L/h，最大容積產率5.17g/L/h；而Lc-WT菌株獲得的菌體乾重4.36g/L，發酵液中乳酸濃度61.75g/L，殘糖為43.1g/L，轉化率為74.9％，平均容積產率為1.03g/L/h，最大容積產率4.11g/L/h。結果表明，在接近原始菌株的最低生長pH條件下，改組菌株比原始菌株耐酸性有顯著提高。突變菌株可以用於低pH發酵工藝生產L-乳酸。Lc-F34菌株發酵液中乳酸濃度較原始菌株提高了42.61％，平均提高了42.7％。
在pH(5.0和4.5)較低條件下，Lc-F34菌株比原始菌株的產酸量和容積產率均有明顯提高，說明改組菌株的耐酸性較原始菌株明顯增強。尤其在pH 4.5條件下進行發酵，發酵液中游離乳酸的含量約佔總乳酸含量的20％，可以降低發酵過程中的鹼性物質的用量，降低乳酸下遊處理的成本；另外，可以適用於新發展起來的乳酸原位分離耦聯發酵生產工藝(電滲析等)。
權利要求
1.一種乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)-Lc-F34，其於2005年9月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No1466，分類命名為乾酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)。
2.一種製備權利要求1所述乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34的方法，其包括如下步驟第一步，原始菌株的培養將原始菌株—乾酪乳桿菌鼠李糖亞種ATCC11443，採用MRS固體培養基進行分離純化，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基，37℃，120轉/分鐘，震蕩培養過夜，8000轉/分鐘離心收集菌體，滅菌0.01M Tris·HCl、pH6.8洗滌兩次，重懸於滅菌0.01M Tris·HCl、pH6.8中；第二步，菌種初級誘變分別採用紫外線-UV和亞硝基胍-NTG兩種誘變方法對第一步培養的原始菌株進行誘變處理，再通過低pH平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗，分別篩選得到經紫外線誘變的產酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株-Lc-UV，和亞硝基胍誘變的產酸速率和耐酸性比原始菌株增加1％以上的多株突變菌株-Lc-NTG；第三步，基因組改組(1)原生質體製備與再生菌體培養將經UV和NTG初級誘變篩選得到的Lc-UV和Lc-NTG突變菌株於MRS培養基中過夜培養後，分別接種於30ml含1.0～2.0％甘氨酸液體MRS培養基，接種量為2～10％，37℃振蕩培養，8000轉/分鐘離心收集菌體；將收集的菌體用LPB洗滌2次，重懸於LPB中，加入溶菌酶和變溶菌素，終濃度分別為1～20mg/mL和5～50ug/mL，於37℃酶解0.5～2.0h，顯微鏡下觀察破壁情況，90％以上菌體破壁後，離心收穫原生質體，LPB洗滌2次，重懸於LPB中備用，菌液中原生質體數均為108cfu/mL；(2)多母本遞近式原生質體融合即基因組改組將步驟(1)得到的UV誘變和NTG誘變菌株的原生質體菌液等體積混合後均分為兩組，一組置於功率為15W的紫外線下處理10～50min，另一組置於60℃水浴中處理30～150min完全滅活後，混合離心，重懸於50μL LPB中，加9倍體積的40％ PEG 6000，室溫放置2～6min，加5mL LPB稀釋，離心、洗滌，重懸於100μL LPB，倍數稀釋塗RM平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養5天。RM平板菌落為融合後菌株。把RM平板上菌落用滅菌生理鹽水洗下來，稀釋，塗pH4.0YE平板，37℃，CO2(5％)培養箱避光培養，將pH4.0平板上獲得的菌落用生理鹽水洗下來，適當稀釋後塗布碳酸鈣平板，37℃，CO2(5％)培養箱培養48h，挑取碳酸鈣平板上透明圈較大的菌落進行搖瓶培養17h，測定產酸量，得到產酸量比原始菌株高2％以上的突變菌株-Lc-F1；將多個Lc-F1菌株繼續步驟(1)、(2)進行下一輪的原生質體製備、滅活、融合與pH3.8平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗篩選，測定產酸量，得到產酸量比Lc-F1突變菌株高2％以上的突變菌株-Lc-F2；再次將篩選到Lc-F2菌株繼續按步驟(1)、(2)進行下一輪的原生質體製備、滅活、融合與pH3.6平板、碳酸鈣平板和搖瓶試驗篩選，測定產酸量，得到產酸量比Lc-F2突變菌株高2％以上的突變菌株-Lc-F3；對上述獲得的F3菌株進行穩定性試驗、耐酸性和產酸量性質分析，獲得一株耐酸性最強和產酸速率最快的突變菌株-Lc-F34，即本發明所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)。
3.權利要求1所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用。
4.如權利要求3所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其工藝步驟如下經逐級種子擴大培養獲得Lc-F34突變菌株的純培養物，再按2％～20％發酵液體積濃度的接種量將Lc-F34突變菌株的純培養物接種於含發酵培養基的密閉發酵設備中，發酵培養基中包括2％～30％體積濃度的初始碳源和1％～15％體積濃度的氮源，其餘為水；發酵液於35℃～50℃、200rpm攪拌條件下進行厭氧發酵培養，發酵過程中控制發酵液的pH值為3.2～7.0，發酵過程中保持發酵液中碳源體積濃度在1％～20％。
5.如權利要求4所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於使用鹼性物質控制發酵液的pH值。
6.如權利要求4所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於鹼性物質為NaOH、氨水或GaGO3中的一種或多種。
7.如權利要求4所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖糖漿或乳糖，氮源為硫酸銨、酵母抽提物、硝酸銨、玉米漿、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸鈉、乙酸鈉或米糠。
8.如權利要求7所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於碳源為葡萄糖；氮源為酵母抽提物或玉米漿。
9.如權利要求8所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於Lc-F34菌株接種量為5％～15％，發酵過程控制pH為4.5～6.0，控制溫度為37℃～42℃，碳源濃度為8％～20％，氮源濃度—酵母抽提物為1.0％～2.5％或玉米漿4.5％～7.0％。
10.如權利要求9所述的乾酪乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)-Lc-F34在用於厭氧發酵生產L-乳酸中的應用，其特徵在於Lc-F34菌株接種量為10％，發酵過程pH為5.5，控制溫度為40℃，碳源濃度為10％～16％，氮源濃度—酵母抽提物為1.5～2.0％或玉米漿為5.0～6.5％。
全文摘要
本發明涉及一種產酸速率快及耐酸性強的乾酪乳桿菌基因組改組菌株、改組菌株的製備方法及該菌株發酵生產L－酸。該菌株於2005年9月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1466。分類命名為乾酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)。該菌株可用於發酵生產L－乳酸，接種量為2％～20％體積濃度，發酵培養基中包括2％～30％體積濃度的初始碳源和1％～15％體積濃度的氮源，發酵液於35℃～45℃、200rpm攪拌條件下進行厭氧發酵培養，發酵過程中控制發酵液的pH值為3.2～7.0，發酵15h～120h。
文檔編號C12N13/00GK1840653SQ20051011904
公開日2006年10月4日 申請日期2005年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者馮雁, 王玉華, 李巖, 裴曉林, 於雷 申請人:吉林大學