日本血吸蟲sjcxwl02基因的克隆、表達和dna疫苗的製作方法

2023-04-30 14:43:56 1

專利名稱：日本血吸蟲sjcxwl02基因的克隆、表達和dna疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因領域，具體涉及日本血吸蟲SJCXWL02基因的基因序列、日本血吸蟲SJCXWL02基因的克隆、日本血吸蟲SJCXWL02基因DNA疫苗的構建及小鼠免疫保護實驗。
背景技術：
血吸蟲病是一種分布廣乏，危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。抗血吸蟲病疫苗研究是當今血吸蟲病防治研究的熱點之一。
當今血吸蟲病基礎免疫，特別是免疫效應機制研究的進展，肯定了早期童蟲是宿主免疫力攻擊的靶標。這些新侵入的童蟲與宿主體內的成蟲存在抗原性的差異，即存在階段特異性抗原，為此，尋找童蟲階段特異性抗原，從而找到童蟲最易受宿主免疫力攻擊的靶位是篩選血吸蟲疫苗分子的一種策略。但是侵入宿主的童蟲可通過某些逃避機制而失去這些靶位，或者使這些靶位不充分暴露給宿主的免疫系統，有些特異性抗原也只在早期童蟲表膜上存在很短的時間，藉此與宿主的抗再感染免疫效應平衡。比如在體外機械轉化的3小時童蟲上能檢測到一種18kD蛋白質，而在肺期以後的童蟲及成蟲則不能檢測出這一成分。為了打破這種平衡，可採用輻射致弱尾蚴感染宿主，從而誘導宿主的抗再感染能力。因為輻射的作用阻止了童蟲的發育，從而使童蟲的敏感靶位，即某些階段特異性抗原較長時間地暴露給宿主的免疫系統，用這種動物模型的血清極有可能尋找到有潛力的疫苗候選分子。
國外最近的研究結果證實，用輻射致弱尾蚴免疫的兔血清篩選曼氏血吸蟲尾蚴cDNA文庫，獲得了2個編碼20.8kD蛋白的cDNA克隆，它編碼了181個胺基酸，與Sm21.7，Sm22.6及Sj22.6的同源性為30％左右，定位與3h童蟲的表膜，用抗Sm20.8的特異性IgG在體外試驗中能介導補體殺傷童蟲，而其裸DNA疫苗免疫小鼠可產生抗再感染的保護性免疫。對於日本血吸蟲輻射致弱尾蚴誘導宿主抗再感染能力的研究在國內也正在展開。

發明內容
本發明提供了日本血吸蟲SJCXWL02基因的基因序列、日本血吸蟲SJCXWL02基因DNA疫苗的構建及小鼠免疫保護性實驗。
本發明應用日本血吸蟲尾蚴血清免疫篩選日本血吸蟲尾蚴文庫，經過初篩和多輪復篩，獲得8個陽性克隆，應用PCR技術對這其中4個克隆的cDNA片斷進行擴增，通過NCBI資料庫的BLASTn、BLASTp程序在線進行核苷酸和蛋白質水平同源性分析。結果顯示有一個無顯著同源性(score值＜200)，表明該基因為新基因，該日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列及相應的胺基酸序列如下1ggggaatatagtttcgattttctcgtgggacgatggcaggggatgataaaMet Ala Gly Asp Asp Lys51 atgaatattgatagtatcattgccagattactggaggtccgacgcattcggMet Asn Ile Asp Ser Ile Ile Asp Arg Leu Leu Glu Val Arg Arg Ile Arg102 cccggcaaaaatgttcaactgaacgaggcagaaattcgcggattgtgtcttPro Gly Lys Asn Val Gln Leu Asn Glu Asn Glu Ile Arg Gly Leu Cys Ile153 aaatctcgcgagattttcttaagtcaacccattttactggaattagaggctLys Ser Arg Glu Ile Phe Leu Ser Gln Phe Ile Leu Leu Glu Leu Glu Ala204 cccctcaaaatttgtggtgacattcacggccaatattatgatttacttcgaPro Leu Lys Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr Tyr Asp Leu Leu Arg255 ctttttgaatatggagcgtttcctcctgaagcgaattatctgtttttgggtLeu Phe Glu Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Ala Asn Tyr Leu Phe Ile Gly306 gactatgtggatcgagggaagcagtcactggaaacaatatgcttattattaAsp Tyr Val Asp Arg Gly Lys Gln Ser Leu Glu Thr Ile Cys Leu Ile Ile357 gcttataaaatcaagtatccggaaaatttctttctgcttaggggtaatcatAla Tyr Lys Ile Lys Tyr Pro Glu Asn Phe Phe Leu Leu Arg Gly Asn His408 gaatgtgcctccatcaaccgtatatatggattttatgatgaatgtaaacgtGlu Cys Ala Ser Ile Asn Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Lys Arg459 cgatataatataaaattgtggaagaccttcacagactgcttcaactgtttgArg Tyr Asn Ile Lys Leu Trp Lys Thr Phe Thr Asp Cys Phe Asn Cys Leu510 ccgattgtagcgattatagacgagaaaatattttgctgtcatggtggtctcPro Ile Val Ala Ile Ile Asp Glu Lys Ile Phe Cys Cys His Gly Gly Leu
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將SJCWL02基因亞克隆至真核表達載體pcDNA3中，構建成重組質粒pcDNA3/SJCWL02，轉化DH5α細菌後擴大培養，製備純化的重組質粒DNA作為DNA疫苗免疫5-6周齡的昆明系小鼠，每次每隻小鼠後腿肌肉注射重組質粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫後第3周以日本血吸蟲尾蚴進行攻擊感染，攻擊後第45天處死小鼠，心臟灌注法收集成蟲，肝臟用10％NaOH消化後計算每克肝組織蟲荷數(EPG)。結果發現pcDNA3/SJCWL02免疫小鼠獲得了24.6％的減蟲率和32.0％的減卵率。


圖1陽性克隆PCR產物凝膠電泳結果MDNA Marker，P1～P8陽性克隆圖2重組質粒pcDNA3/SjCXWL02雙酶切和PCR驗證MDNA Marker，1空白質粒PCDNA雙酶切，2目的片段PCR，3重組質粒PCDNA/SJCXWL02雙酶切具體實施方式
一、致弱尾蚴免疫兔血清篩選日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫及SJCWL02全長基因的克隆1.材料1.1文庫與菌株日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫採用定向克隆的方法將日本血吸蟲(中國大陸株)尾蚴cDNA克隆入λTripEx/BM25.8系統的SfiIA及SfiIB之間。尾蚴文庫容量為1.8×107.(由南方醫科大學寄生蟲教研室陳曉光教授提供).
大腸桿菌BM25.8和大腸桿菌XL1-Blue均由中南大學湘雅醫學院病原生物學系保存。
1.2重要試劑與儀器胰蛋白腖、酵母提取物均購自OXOID公司；Taq酶、dNTP、DNAMarker、質粒DNA提取試劑盒均為大連寶生物公司產品；異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)、瓊脂粉為上海生工公司產品；辣根過氧化物酶聯葡萄球A蛋白(HRP-SPA)購自上海科欣生物技術研究所；硝酸纖維素膜(NC膜)為台州市路橋四甲生化塑料廠產品；其他試劑均為國產分析純。
PCR儀系德國Biometra公司產品；電泳儀為美國Bio-Rad公司生產；英國UVP-GDS8000凝膠成像分析系統。
1.3實驗動物紐西蘭大白兔3隻購自中南大學湘雅醫學院動物學部。平均體重2.5kg，用作日本血吸蟲的感染宿主。
1.4日本血吸蟲尾蚴由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。
1.5PCR引物(由大連寶生物公司合成)P15』-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3』P25』-TAATACGACTCACTATAGGG-3』2.方法2.1致弱尾蚴免疫兔血清的製備常規法逸出尾蚴後，經紫外線致弱處理400μw/min.cm2，1min，立即於每兔腹部經皮膚免疫約2000條致弱尾蚴，45天後剖殺兔，頸動脈取血。經ELISA測定，血清中抗尾蚴抗原IgG滴度1∶51200。該血清按1∶50比例與大腸桿菌BM25.8裂解液混合，4℃吸附過夜，即可用於篩選尾蚴cDNA文庫。
2.2尾蚴cDNA文庫的篩選將cDNA文庫按1∶10000稀釋，每5μL稀釋文庫加入200μL新鮮大腸桿菌XL1-Blue，鋪於固體培養基上，37℃溫育至噬菌斑為針尖大小。覆以經10mM IPTG浸泡過的NC膜，繼續培養6h後，定位揭膜，5％脫脂牛奶4℃封閉過夜，PBST洗滌3次，置1∶50致弱尾蚴免疫兔血清中，37℃，2h；洗滌後置1∶150 HPR-SPA中，37℃，2h；洗滌後DAB顯色。從平板上挑取三輪篩選持續陽性噬菌斑，置200μL1×λ稀釋液中，4℃過夜後，與200μL新鮮大腸桿菌BM25.8、400μL液體培養基混勻後，37℃振蕩1h。取10μL上清塗布LB/A+平板，37℃溫育8-12h，挑取單菌落，按質粒DNA提取試劑盒說明書提取質粒DNA。
2.3PCR擴增與測序以陽性克隆噬菌體為摸板進行PCR，按以下體系進行10×buffer 10ulMgCl2 10uldNTP 2ul引物P1 1ul引物P2 1ul
Template 1.5ulddH2O 73.5ulTaq酶 10ulPCR程序94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃1min)，35個循環，72℃7min。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。陽性克隆的測序由大連寶生物公司完成。
2.4序列分析與新基因的獲取、登錄對原始序列進行編輯，去除序列中酶切位點序列，再通過NCBI(The National Center for Biotechnology Information)資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTn、BLASTp程序在線進行核苷酸和蛋白質水平同源性分析。根據獲得的score值確定所獲序列是否新基因，如為新基因則利用sequin程序進行登錄。
3結果3.1Sj尾蚴cDNA文庫的免疫篩選利用致弱尾蚴免疫兔血清進行三輪篩選，共獲得8個持續陽性克隆。經PCR初步鑑定，8個陽性克隆全部擴增出特異條帶，插入的cDNA片段大小分布於0.6kb～3.0kp之間(見圖1)。
3.2測序結果隨機選取4個陽性克隆進行測序，結果顯示其中一個序列與其他已知基因無顯著同源性(score＜200)，命名為SJCWL02基因。
SJCWL02基因全長1879bp，具一個長為984bp的完整ORF，起始密碼子位於第33~35核苷酸，終止密碼子TAA位於第1014~1016核苷酸。3』端含PolyA尾和加尾信號AATAAA(位於第1064～1069核苷酸)。該基因與其他已知基因無顯著同源性，為日本血吸蟲新基因，GenBank登錄號為AY879341。編碼蛋白含327個胺基酸，理論分子量為37.346kDa，等電點為6.34。與磷酸酶1催化亞單位蛋白同源性最高(88％)，二級結構分析顯示富含a-螺旋(46.48％)和無規則捲曲(43.73％)，無規則捲曲主要分布於191-228、269-281、300-327等區域。
二、日本血吸蟲真核表達質粒pcDNA3/SJCWL02的構建及其序列測定1.材料1.1質粒與受體菌pcDNA3質粒，大腸桿菌DH5α為本室貯存。
1.2工具酶與試劑限制性內切酶KpnI、ApaI、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒均為大連寶生物公司產品，Marker為Sigma公司產品，UNIQ-10質粒小量抽提試劑盒(030828)、PCR試劑盒為上海生工生物工程公司產品，其它試劑均為國產分析純產品。
1.3引物的設計與合成根據SjHGPRT(ORF)的基因序列設計引物一對，由大連寶生物公司合成。
H35』-ACGGTACCCGGTATGATCAAGGATAG-3』，其中AC為保護性鹼基，GGTACC為KpnI酶切位點。
H45』-CAGGGCCCATTAAACTGATTTCGGCA-3』，其中CA為保護性鹼基，GGGCCC為ApaI酶切位點。
2.方法2.1模板製備將適量日本血吸蟲尾蚴文庫加入過夜培養的大腸桿菌Y1090中，37℃預吸附20min左右。在吸附液中加入氨苄青黴素、MgSO4、20％麥芽糖並混勻，然後加入到55℃保溫的頂瓊脂中，快速混勻後倒入9cm的LB平板中，42℃培養約4h，待出現密集的噬菌斑後，在LB培養基平板中加入SM液，4℃輕搖過夜。次日收集洗脫液，5000rpm室溫離心5min，取上清液，加入20％PEG/NaCl(20％的PEG，2mol/LNaCl)，混合後室溫放置30min，然後12,000rpm×15min離心，棄上清，加入100μl雙蒸水，溶解沉澱物，沸水浴5min，使噬菌體DNA變性。存-20℃備用。
2.2PCR擴增得到目的基因以文庫噬菌體DNA為模板，以H3，H4為引物，進行PCR擴增目的片段。PCR反應體系(100μl總反應量)10×buffer 10μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP 2μl，引物H3和H4各2μl，模板DNA 13μl，Taq酶(5U/μl)1μl，補雙蒸水至100μl。PCR反應參數為96℃預變性3min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min共35個循環，72℃繼續延伸8min。1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑑定分子量大小，並回收SjHGPRT基因的目的片段。
2.3目的基因和真核表達質粒pcDNA3的酶切、回收和連接回收的目的片段以KpnI、ApaI雙酶切，37℃酶切2-4h，凝膠電泳回收雙酶切產物。按質粒提取試劑盒說明書抽提質粒pcDNA3，同樣以KpnI、ApaI雙酶切、回收。將酶切的目的基因與酶切質粒按照摩爾比5∶1，反應體系為20μl，通過T4DNA連接酶進行連接反應，16℃連接16-18h。
2.4感受態細胞的製備和連接產物的轉化用CaCl2法製備大腸桿菌DH5α的感受態細胞，將連接產物20μl轉化200μl感受態大腸桿菌DH5α，塗布於氨苄青黴素抗性LB平板上，37℃培養12-16h，挑取單菌落加入到LB液體培養基中增菌，用質粒提取試劑盒提取質粒。
2.5陽性克隆的鑑定對真核表達重組質粒進行KpnI和ApaI雙酶切鑑定，酶切反應條件同前，酶切產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
3結果3.1重組質粒pcDNA3-SjHGPRT的構建及其鑑定以H3、H4為引物從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫中擴增出564bp的片段。將重組子經KpnI和ApaI雙酶切後出現兩條帶，大小分別為0.57Kb，5.4Kb；而空白質粒pcDNA3經KpnI和ApaI雙酶切後，只有一條帶，大小與原質粒一致，約為5.4Kb(見圖2)三、日本血吸蟲pcDNA3/SjCXWL02重組質粒免疫小鼠的保護性效果觀察1材料1.1主要試劑酵母粉、胰蛋白腖、RnaseA為BBI公司產品；苯酚、氯仿、異丙醇為上海生工產品；其它試劑均為國產分析純。
1.2實驗動物和陽性釘螺昆明系小鼠，雄性，5-6周齡，由中南大學湘雅醫學院動物學部提供。陽性釘螺由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。
1.3菌株和質粒大腸桿菌DH5α、pcDNA3載體為本室保存，pcDNA3/SjHGPRT由本室構建。
2方法2.1質粒的大量製備採用SDS鹼裂解法大量製備質粒。然後溶於無菌的生理鹽水，經751紫外分光光度計測質粒DNA的濃度和純度(260/280≥1.80)，用無菌生理鹽水調整濃度至1mg/ml，置-20℃備用。
2.2實驗動物分組將實驗小鼠隨機分為A、B、C三組，A組為pcDNA3空質粒對照組，B組為pcDNA3/SJCWL02免疫組，C組為注射生理鹽水組，每組各10隻昆明系小鼠。
2.3DNA免疫途徑和方法按常規免疫方法進行，分別於免疫前一天進行預處理，即每隻小鼠後腿肌肉注射50μl鹽酸布比卡因(0.5mg/ml)，第二天在該部位按分組要求注射質粒100μg/100μl或生理鹽水100μl。每間隔2周免疫1次，共3次。
2.4免疫酶組織化學檢測SJCWL02蛋白在小鼠肌肉中的表達末次免疫後2周，每組剖殺2隻小鼠，取注射部位股四頭肌0.5cm3，10％福馬林固定過夜，然後進行石蠟包埋、組織切片、HE染色和免疫酶組織化學鑑定。免疫酶組化所用SIEA26-28kDa免疫血清由本室製備，工作濃度為1∶100；生物素化山羊抗兔IgG為武漢博士德生物公司產品。具體操作方法為先製備3μm厚的切片，60℃烤片30min，常規脫蠟、去水，用新鮮配製的3％雙氧水處理切片5-10min，以滅活內源性酶，再用蒸餾水洗3次。然後，加0.01M枸櫞酸鹽緩衝液，微波處理2次，5min/次，PBS浸泡同前處理後，加5％BSA封閉液，置室溫20min，甩出多餘液體，直接加SIEA26-28kDa免疫血清，置4℃冰箱反應過夜。次日以PBS洗3次，5min/次，加酶標二抗置37℃20min，PBS洗3次，5min/次，滴加試劑SABC，37℃20min，PBS洗滌後DAB顯色，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，37℃烘乾，蓋片，顯微鏡下觀察結果。
2.5免疫小鼠攻擊感染實驗及保護性效果評價末次免疫後第3周，按常規方法經小鼠腹部人工感染40±1條日本血吸蟲尾蚴，感染後第45天處死小鼠，採用心臟灌注法收集血吸蟲成蟲，並計算減蟲率。同時，每鼠取1g肝研磨，加10％NaOH於37℃消化過夜，取50μl混懸液塗片鏡檢全部蟲卵數，計算每克肝蟲卵數(EPG)。運用SPSS統計軟計進行單因素方差分析(ANOVA)計算其保護效果，經統計學處理得出P＜0.05，表示有顯著性差異。減蟲率和減卵率的計算公式如下。
減蟲率(％)＝(1-實驗組檢獲成蟲均數/對照組檢獲成蟲均數)×100減卵率(％)＝(1-實驗組檢獲肝蟲卵均數/對照組檢獲肝蟲卵均數)×1003結果3.1免疫組織化學結果對小鼠肌組織切片進行HE染色，可見切片部位細胞分布正常且均勻，肌細胞核被染成藍色，胞漿被染成紅色；用正常兔血清做對照，在肌細胞肌漿內外凡未見棕色反應產物者，為陰性反應；採用SIEA26-28kDa免疫兔血清做為一抗，可見在肌細胞胞漿中有大小不一、被染成深棕色顆粒狀物質，為陽性反應。
3.2pcDNA3/SjCWL02誘導小鼠抗血吸蟲感染的保護作用攻擊感染後45d剖殺小鼠衝蟲，計數蟲荷及每克肝臟蟲卵數(LEPG)，由表1、表2可見，pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠獲得了24.6％的減蟲率和32.0％的減卵率，與空白質粒pcDNA3及NS對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。
表1.pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠的減蟲率

表2 pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠的減卵率

權利要求
1.一種編碼日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列，其特徵在於它具有如下核苷酸序列1 ggggaatatagtttcgattttctcgtgggacgatggcaggggatgataaaMet Ala Gly Asp Asp Lys51 atgaatattgatagtatcattgccagattactggaggtccgacgcattcggMet Asn Ile Asp Ser Ile Ile Asp Arg Leu Leu Glu Val Arg Arg Ile Arg102 cccggcaaaaatgttcaactgaacgaggcagaaattcgcggattgtgtcttPro Gly Lys Asn Val Gln Leu Asn Glu Asn Glu Ile Arg Gly Leu Cys Ile153 aaatctcgcgagattttcttaagtcaacccattttactggaattagaggctLys Ser Arg Glu Ile Phe Leu Ser Gln Phe Ile Leu Leu Glu Leu Glu Ala204 cccctcaaaatttgtggtgacattcacggccaatattatgatttacttcgaPro Leu Lys Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr Tyr Asp Leu Leu Arg255 ctttttgaatatggagcgtttcctcctgaagcgaattatctgtttttgggtLeu Phe Glu Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Ala Asn Tyr Leu Phe Ile Gly306 gactatgtggatcgagggaagcagtcactggaaacaatatgcttattattaAsp Tyr Val Asp Arg Gly Lys Gln Ser Leu Glu Thr Ile Cys Leu Ile Ile357 gcttataaaatcaagtatccggaaaatttctttctgcttaggggtaatcatAla Tyr Lys Ile Lys Tyr Pro Glu Asn Phe Phe Leu Leu Arg Gly Asn His408 gaatgtgcctccatcaaccgtatatatggattttatgatgaatgtaaacgtGlu Cys Ala Ser Ile Asn Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Lys Arg459 cgatataatataaaattgtggaagaccttcacagactgcttcaactgtttgArg Tyr Asn Ile Lys Leu Trp Lys Thr Phe Thr Asp Cys Phe Asn Cys Leu510 ccgattgtagcgattatagacgagaaaatattttgctgtcatggtggtctcPro Ile Val Ala Ile Ile Asp Glu Lys Ile Phe Cys Cys His Gly Gly Leu561 tcaccagatctttcaacaatggaacaaataagacgaatcatgcgtcctacaSer Pro Asp Leu Ser Thr Met Glu Gln Ile Arg Arg Ile Met Arg Pro Thr612 gatgttcctgagcaaggtttactatgtgatttactttggtcagatccagacAsp Val Pro Glu Gln Gly Leu Leu Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Asp663 aaagatgtatctggttggggtgaaaatgatcgtggtgtcagttatacatttLys Asp Val Ser Gly Trp Gly Glu Asn Asp Arg Gly Val Ser Tyr Thr Phe714 ggtccagatattgtagctagattcttacataaacatgatctggatttaataGly Pro Asp Ile Val Ala Arg Phe Leu His Lys His Asp Leu Asp Leu Ile765 tgtcgtgctcatcaggttgttgaagacggttatgaa ttcttcgctaaacgtCys Arg Ala His Gln Val Val Glu Asp Gly Tyr Glu Phe Phe Ala Lys Arg816 cagttagttacactgttttccgctccaaattattgtggtgaattcgataatGln Leu Val Thr Leu Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Gly Glu Phe Asp Asn867 gcaggagctatgatgtctgtagatgacacattattatgttcatttcaaattAla Gly Ala Met Met Ser Val Asp Asp Thr Leu Leu Cys Ser Phe Gln Ile918 ttacgcccagctgaaaagaaaaagtattacgctggtgtcccaactggcagtLeu Arg Pro Ala Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Val Pro Thr Gly Ser979 cgaccaattactccacctcgtggagctaaagctaaggggaaattataaArg Pro Ile Thr Pro Pro Arg Gly Ala Lys Ala Lys Gly Lys Leu *1010 actatctatc tcatcgcgta tctctccaat ttatttgctt1050 ttgcttttat gacaataaaa tcgaggcgtc aagtggacga1090 acaaagttat ttgagaatat caccccctgt tcaaactgtc1130 attaaaatca tttttgcgtc ataaagtgta gatttccctt1170 acatgtgtct ttttcggaat ggcaaatgtt tttttggtcc1210 tgcacatcaa gattggataa tcagtgtgaa atcctgtttt1250 tagtgtttat acgttgttaa acagccttca tgtttccctt1290 tctatactta tttacaagcc tcatccttat cgactggctt1330 gttctctttc ctttttgcat gttttgtaag caagcataca1370 caaaagattg gttgttgatt gtgtcctatt tagtagtacc1410 atttttatta ccactggtat aattgtacat ttcttcttcg1450 tatgttttat tcttattgaa atattcaaat taaagaatga1490 gttgttttta tcagtttcgc tcaacattat tcatttgatt1530 tgatcattca gtcagtccag tgtgtaaaac acataattta1570 acagtagaaa ctgtttacat gtagtagttt ttataaatca1610 caagcatctt tgtttcttct gtcagtattt atttgtttgt1650 gtgtatgtga ttatagtgat gatgaatgtg tgcatgctgt1690 tttttcttgt cttcgaattc gattgttcac aatgataact1730 gaagtttttc acattttctg ttttcccaat ttacttttat1770 tgtacagtca gctactttct gttataaaaa aacctatcct1810 tagtatgtta aattgagtga aatataattt cacctttcga1850 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa。
2.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列的克隆方法，其特徵在於以日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫為模板，設計引物擴增得到SJCXWL02基因完整的核苷酸序列。
3.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸編碼序列在真核生物中的表達方法，其特徵在於所使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達質粒為pcDNA3。
4.一種用於防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特徵在於它是由日本血吸蟲SJCXWL02基因和真核表達質粒組成。
5.根據權利要求4所述的一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特徵在於其中的真核表達質粒為pcDNA3。
全文摘要
本發明涉及生物基因領域，具體涉及日本血吸蟲(中國大陸株)SjCXWL02基因的基因序列、真核表達質粒pcDNA3/SjCXWL02的構建及重組質粒免疫小鼠的保護性效果觀察。採用日本血吸蟲致弱尾蚴血清篩選尾蚴cDNA文庫，獲得8個陽性克隆後，PCR擴增出其中4個含完整ORF的基因。同源性序列分析表明其中一個為新基因(SjCXWL02)，該基因全長1879bp，開放閱讀框含984bp，編碼328個胺基酸。將SjCXWL02亞克隆入真核表達載體pcDNA3中，構建成重組質粒pcDNA3/SjCXWL02，製備DNA疫苗免疫昆明系小鼠，獲得24.6％的減蟲率、32.0％的減卵率。
文檔編號C12N15/10GK1749395SQ200510031440
公開日2006年3月22日 申請日期2005年4月12日 優先權日2005年4月12日
發明者呂志躍, 汪世平, 周松華, 曾少華, 劉雪琴, 姜孝新, 何卓, 徐紹銳, 彭先楚, 戴橄, 車宏莉, 肖小芹, 吳仕筠, 羅臣 申請人:呂志躍, 汪世平