一種溶血性鏈球菌含量檢測方法與流程
2023-04-30 14:18:31
本發明涉及一種檢測方法，具體是一種溶血性鏈球菌含量檢測方法。
背景技術：
鏈球菌溶血毒素是溶血性鏈球菌的代謝產物之一，是一種含-SH基的蛋白質，能溶解紅細胞，易被氧化，與空氣接觸可暫時失去溶血能力，形成-SS基但可藉助還原劑使其恢復活力，重新具有溶血作用，溶血毒素具有很強的抗原性。人受溶血鏈球菌感染後約85-90％的患者在感染後2-3周到病癒後數月或一年可查到鏈球菌溶毒素抗體，若被檢血清中有相應抗體，與溶血毒素結合，不出現溶血，表示機體近期曾受過溶血性鏈球菌感染或反覆受過溶血性鏈球菌侵害。故依據抗鏈球菌溶血毒素抗體效價高低可輔助風溼熱、急性腎小球腎炎等鏈球菌性變態反應疾病的診斷。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種溶血性鏈球菌含量檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種溶血性鏈球菌含量檢測方法，包括以下步驟：（1）提取待溶血性鏈球菌樣本基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；採用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重複樣，於37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性鏈球菌增菌肉湯中，37℃培養18-24h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩衝液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反覆凍融3次，然後10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取後的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）PCR預擴增：以步驟一提取的待溶血性鏈球菌樣本的基因組DNA作為模板，使用PCR預擴增引物對提取的肺炎鏈球菌標本基因組DNA進行預擴增；MLPA探針雜交、連接、擴增：使用MLPA探針對待溶血性鏈球菌樣本基因組DNAPCR預擴增產物進行雜交,同時在反應體系中加入相應的螢光檢測探針；用連接酶連接已雜交的MLPA探針,並以MLPA通用擴增引物PCR擴增已雜交並連接好的MLPA探針；MLPA產物檢測：使用多色螢光溶解曲線分析PCR產物。
作為本發明進一步的方案：步驟（1）所述提取DNA方法採用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。
作為本發明進一步的方案：所述的PCR預擴增引物是選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5』端9nt合成為RNA序列，3』端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3』端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。
作為本發明再進一步的方案：所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明方法能克服傳統的檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間大大縮短到2-3天，操作步驟和勞動強度也大為縮減，達到省時省力、快速靈敏的要求。
具體實施方式
下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。
本發明實施例中，一種溶血性鏈球菌含量檢測方法，包括以下步驟：（1）提取待溶血性鏈球菌樣本基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；採用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重複樣，於37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性鏈球菌增菌肉湯中，37℃培養18-24h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩衝液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反覆凍融3次，然後10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取後的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）PCR預擴增：以步驟一提取的待溶血性鏈球菌樣本的基因組DNA作為模板，使用PCR預擴增引物對提取的肺炎鏈球菌標本基因組DNA進行預擴增；MLPA探針雜交、連接、擴增：使用MLPA探針對待溶血性鏈球菌樣本基因組DNAPCR預擴增產物進行雜交,同時在反應體系中加入相應的螢光檢測探針；用連接酶連接已雜交的MLPA探針,並以MLPA通用擴增引物PCR擴增已雜交並連接好的MLPA探針；MLPA產物檢測：使用多色螢光溶解曲線分析PCR產物。步驟（1）所述提取DNA方法採用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。所述的PCR預擴增引物是選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5』端9nt合成為RNA序列，3』端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3』端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。
實施例1：
本發明溶血性鏈球菌含量檢測方法，包括以下步驟：（1）提取待溶血性鏈球菌樣本基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5個稀釋度；採用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3個重複樣，於37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性鏈球菌增菌肉湯中，37℃培養18h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩衝液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反覆凍融3次，然後10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取後的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）PCR預擴增：以步驟一提取的待溶血性鏈球菌樣本的基因組DNA作為模板，使用PCR預擴增引物對提取的肺炎鏈球菌標本基因組DNA進行預擴增；MLPA探針雜交、連接、擴增：使用MLPA探針對待溶血性鏈球菌樣本基因組DNAPCR預擴增產物進行雜交,同時在反應體系中加入相應的螢光檢測探針；用連接酶連接已雜交的MLPA探針,並以MLPA通用擴增引物PCR擴增已雜交並連接好的MLPA探針；MLPA產物檢測：使用多色螢光溶解曲線分析PCR產物。步驟（1）所述提取DNA方法採用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。所述的PCR預擴增引物是選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5』端9nt合成為RNA序列，3』端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3』端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。
實施例2：
溶血性鏈球菌含量檢測方法，包括以下步驟：（1）提取待溶血性鏈球菌樣本基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設7個稀釋度；採用三管或者五管平行法，每個稀釋度設5個重複樣，於37℃培養24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性鏈球菌增菌肉湯中，37℃培養24h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩衝液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反覆凍融3次，然後10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取後的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）PCR預擴增：以步驟一提取的待溶血性鏈球菌樣本的基因組DNA作為模板，使用PCR預擴增引物對提取的肺炎鏈球菌標本基因組DNA進行預擴增；MLPA探針雜交、連接、擴增：使用MLPA探針對待溶血性鏈球菌樣本基因組DNAPCR預擴增產物進行雜交,同時在反應體系中加入相應的螢光檢測探針；用連接酶連接已雜交的MLPA探針,並以MLPA通用擴增引物PCR擴增已雜交並連接好的MLPA探針；MLPA產物檢測：使用多色螢光溶解曲線分析PCR產物。步驟（1）所述提取DNA方法採用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。所述的PCR預擴增引物是選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5』端9nt合成為RNA序列，3』端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3』端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。
實施例3：
本發明溶血性鏈球菌含量檢測方法，包括以下步驟：（1）提取待溶血性鏈球菌樣本基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩8min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設6個稀釋度；採用三管或者五管平行法，每個稀釋度設4個重複樣，於37℃培養20h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性鏈球菌增菌肉湯中，37℃培養20h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩衝液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反覆凍融3次，然後10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取後的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）PCR預擴增：以步驟一提取的待溶血性鏈球菌樣本的基因組DNA作為模板，使用PCR預擴增引物對提取的肺炎鏈球菌標本基因組DNA進行預擴增；MLPA探針雜交、連接、擴增：使用MLPA探針對待溶血性鏈球菌樣本基因組DNAPCR預擴增產物進行雜交,同時在反應體系中加入相應的螢光檢測探針；用連接酶連接已雜交的MLPA探針,並以MLPA通用擴增引物PCR擴增已雜交並連接好的MLPA探針；MLPA產物檢測：使用多色螢光溶解曲線分析PCR產物。步驟（1）所述提取DNA方法採用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。所述的PCR預擴增引物是選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5』端9nt合成為RNA序列，3』端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3』端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。
對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。