基於HiSeq測序技術檢測B型肝炎病毒分型和耐藥基因的方法
2023-04-30 12:55:36 1
專利名稱：基於HiSeq測序技術檢測B型肝炎病毒分型和耐藥基因的方法
技術領域：
本發明屬於基因組學和分子生物學中有機生物分子領域，具體而言涉及HBV核酸樣本突變位點類型的檢測方法、PCR引物、標籤弓I物及其試劑盒。
背景技術：
B型肝炎病毒(HBV)感染是嚴重的全球公共衛生問題之一，全球約3. 5-4億人感染HBV，每年大約有100萬人死於HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌。目前，用於HBV治療的主要有兩種藥物幹擾素和核苷酸類藥物。隨著核苷酸類似物在臨床上廣泛應用於治療慢性B型肝炎，HBV的耐藥問題日益凸顯，已經成為臨床上制約抗病毒療效的重要 原因。而且感染不同的HBV型別其臨床表現和預後也有所不同，所以對B肝患者進行HBV分型和耐藥基因的檢測對指導臨床用藥有重要意義。然而，目前對B肝患者進行HBV分型和耐藥基因的檢測手段仍有待改進。
發明內容
本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。為此，本發明的一個方面，提出了一種確定HBV核酸樣本中突變位點類型的方法，包括下列步驟使用第一引物組，對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物；對第一擴增產物進行測序，以便得到測序結果；以及基於測序結果，確定HBV核酸樣本中是否存在突變，其中，第一引物組包含第一引物和第二引物，第一引物具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，第一引物的5』端進一步包含第一標籤序列(即正向標籤)，第一標籤序列具有選自如SEQ ID NO :5-52至少之一所不的核苷酸序列，第二引物的5』端進一步包含第二標籤序列(即反向標籤)，第二標籤序列具有選自如SEQ ID NO :53-100至少之一所示的核苷酸序列。由此，能夠有效地確定HBV核酸樣本中突變位點的類型，並且能夠同時對多種核酸樣本進行分析。根據本發明的另一個方面，本發明還提供一組PCR引物，其包含第一引物和第二引物，其中第一引物具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，其中，第一引物的5』端進一步包括第一標籤序列(即正向標籤)，第一標籤序列具有選自如SEQ ID NO 5-52至少之一所示的核苷酸序列，第二引物的5』端進一步包含第二標籤序列(即反向標籤)，第二標籤序列具有選自如SEQ ID NO :53-100至少之一所示的核苷酸序列。根據本發明的實施例，上述引物組還進一步包括第三引物和第四引物，第三引物具有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，第四引物具有如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。利用根據本發明實施例的引物組，能夠有效地實施前述確定HBV核酸樣本中突變位點的類型的方法，進而能夠用於有效地確定HBV核酸樣本中突變位點的類型，並且能夠同時對多種核酸樣本進行分析。根據本發明的另一方面，本發明還提供一組分離的寡核苷酸，由SEQ ID NO :5-100所示的寡核苷酸構成。利用這些寡核苷酸可以作為標籤，可以有效地用於高通量測序，從而能夠有效地利用高通量測序平臺，同時對多種樣本進行測序，並通過預知的標籤的核苷酸序列對所得到測序結果的來源進行區分。根據本發明的另一方面，本發明還提供一種試劑盒，其包括上述引物組或寡核苷酸組，同時，本發明還提供該試劑盒在檢測HBV基因的核苷酸突變中的用途。利用根據本發明實施例的試劑盒，能夠有效地實施前述確定HBV核酸樣本中突變位點的類型的方法，進而能夠用於有效地確定HBV核酸樣本中突變位點的類型，並且能夠同時對多種核酸樣本進行分析。根據本發明的另一方面，本發明還提供一種確定HBV核酸樣本中突變位點類型的系統。根據本發明的實施例，該系統包括擴增裝置，所述擴增裝置中設置有前述的一組PCR引物，用於對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物；測序裝置，所述測序裝置與所述擴增裝置相連，並且適於對所述第一擴增產物進行測序，以便得到測序結果；以及分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用於對基於所述測序結果，確定所述HBV核酸樣本中是否存在突變。利用根據本發明實施例的確定HBV核酸樣本中突變位點類型的 系統，能夠有效地實施前述確定HBV核酸樣本中突變位點的類型的方法，進而能夠用於有效地確定HBV核酸樣本中突變位點的類型，並且能夠同時對多種核酸樣本進行分析。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I是根據本發明一個實施例的確定HBV核酸樣本中突變位點類型的方法的流程示意圖；以及圖2是根據本發明一個實施例的確定HBV核酸樣本中突變位點類型的系統的結構示意圖。發明詳細描述下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。需要說明的是，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說明，「多個」的含義是兩個或兩個以上。核酸標籤根據本發明的一個方面，本發明提供了一組核酸標籤(在本文中有時也稱為「分離的寡核苷酸」)。根據本發明的實施例，這些核酸標籤分別為SEQ ID NO :5-100所示。在本說明書中，這48對核酸標籤分別被命名為PI-N，其中N=l-48中的任意整數，其序列如下表I
表I標籤引物的序列
權利要求
1.一種確定HBV核酸樣本中突變位點類型的方法，其特徵在於，包括下列 使用第一引物組，對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物； 對所述第一擴增產物進行測序，以便得到測序結果；以及 基於所述測序結果，確定所述HBV核酸樣本中是否存在突變， 其中，所述第一引物組包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列， 所述第一引物的5』端進一步包含第一標籤序列，所述第一標籤序列具有選自如SEQIDNO 5-52至少之一所不的核苷酸序列， 所述第二引物的5』端進一步包含第二標籤序列，所述第二標籤序列具有選自如SEQIDNO :53-100至少之一所不的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述HBV核酸樣本是從HBV的宿主中分離的。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述HBV核酸樣本是從B肝患者血清樣本中分離的。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，使用第一引物組，對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物進一步包括 使用第二引物組，對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第二擴增產物；以及 使用第一引物組，對所述第二擴增產物進行擴增，以便得到所述第一擴增產物， 其中， 所述第二引物組包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，進一步包括通過選自瓊脂糖凝膠電泳、磁珠純化和純化柱純化的至少一種分離純化所述第一擴增產物。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，對所述第一擴增產物進行測序，以便得到測序結果進一步包括 針對所述第一擴增產物，構建測序文庫；以及 對所述測序文庫進行測序，以便得到所述測序結果。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，利用選自Hiseq2000、S0LID、454和單分子測序裝置的至少一種進行所述測序。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，針對所述第一擴增產物，構建測序文庫進一步包括 將所述第一擴增產物片段化，以便得到DNA片段； 對所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段； 對所述經過末端修復的DNA片段進行3』端添加鹼基A，以便獲得3』末端添加鹼基A的DNA片段； 將所述3』末端添加鹼基A的DNA片段與接頭相連，以便獲得連接產物； 對所述連接產物進行PCR擴增，以便獲得第三擴增產物；以及 將所述第三擴增產物進行純化回收，以便獲得回收產物，所述回收產物構成所述測序文庫。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，通過選自化學打斷方法和物理打斷方法的至少一種將所述第一擴增產物片段化，其中所述化學方法包括酶切方法，所述物理打斷方法包括超聲波打斷方法和機械打斷方法。
10.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述末端修復是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，所述Klenow片段具有5』 -3』聚合酶活性和3』 -5』外切酶活性，但缺少5』 -3』外切酶活性。
11.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，利用Klenow(3』 -5』 exo-)對所述經過末端修復的DNA片段進行3』端添加鹼基A。
12.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，將所述3』末端添加鹼基A的DNA片段與接頭相連是利用T4DNA連接酶進行的。
13.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，通過瓊脂糖凝膠電泳、磁珠純化和純化柱純化的至少一種純化回收所述第三擴增產物。
14.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，基於所述測序結果，確定所述HBV核酸樣本中是否存在突變進一步包括 將所述測序結果與參照序列進行比對，以便確定所述HBV核酸樣本中是否存在突變。
15.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述突變為選自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F, rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一種。
16.一組PCR引物，其特徵在於，包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQIDNO :1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列， 所述第一引物的5』端進一步包括第一標籤序列，所述第一標籤序列具有選自如SEQIDNO 5-52至少之一所不的核苷酸序列， 所述第二引物的5』端進一步包含第二標籤序列，所述第二標籤序列具有選自如SEQIDNO :53-100至少之一所不的核苷酸序列。
17.根據權利要求16所述的一組PCR引物，其特徵在於，進一步包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列。
18.—組分離的寡核苷酸，其特徵在於，由SEQ ID NO :5-100所示的寡核苷酸構成。
19.一種試劑盒，其特徵在於，包含權利要求16或17所述的一組PCR引物。
20.權利要求19所述的試劑盒在檢測HBV基因的核苷酸突變中的用途。
21.根據權利要求20所述的用途，其特徵在於，所述突變為選自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F, rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一種。
22.一種確定HBV核酸樣本中突變位點類型的系統，其特徵在於，包括 擴增裝置，所述擴增裝置中設置有權利要求16或17所述的一組PCR引物，用於對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物； 測序裝置，所述測序裝置與所述擴增裝置相連，並且適於對所述第一擴增產物進行測序，以便得到測序結果；以及 分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用於基於所述測序結果，確定所述HBV核酸樣本中是否存在突變。
23.根據權利要求22所述的系統，其特徵在於，進一步包括 核酸分離裝置，所述核酸分離裝置適於從HBV的宿主分離HBV核酸樣本。
24.根據權利要求22所述的系統，其特徵在於，所述測序裝置為選自HiSeq2000、SOLID,454和單分子測序裝置的至少一種。
25.根據權利要求22所述的系統，其特徵在於，所述分析裝置進一步包括比對單元，所述比對單元中存儲有參照序列，用於將所述測序結果與參照序列進行比對，以便確定所述HBV核酸樣本是否存在突變。
全文摘要
提供了HBV核酸樣本突變位點類型的檢測方法、PCR引物、標籤引物及其試劑盒。其中，確定HBV核酸樣本中突變位點類型的方法包括使用第一引物組，對所述HBV核酸樣本進行擴增，以便得到第一擴增產物；對所述第一擴增產物進行測序；基於測序結果，確定HBV核酸樣本中是否存在突變，其中，所述第一引物組包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，所述第一引物的5』端進一步包含第一標籤序列，所述第二引物的5』端進一步包含第二標籤序列。利用該方法能夠有效確定HBV核酸樣本中是否存在突變。
文檔編號C12Q1/68GK102758026SQ20121022262
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者劉濤, 張印新, 梅嚴花, 汪建, 王玉琦, 韓穎鑫 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司