中和針對因子ⅷ的c1結構域的抑制性抗體的抑制活性的抗獨特型抗體的製作方法

2023-04-30 15:10:11

專利名稱：中和針對因子ⅷ的c1結構域的抑制性抗體的抑制活性的抗獨特型抗體的製作方法
中和針對因子Vl I I的C1結構域的抑制性抗體的抑制活性
的抗獨特型抗體現有技術和引言本發明涉及針對因子VIII抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述因子VIII抑 制性抗體結合因子VIII的Cl結構域，以及涉及產生這種單克隆抗獨特型抗體的細胞系，涉 及這種單克隆抗獨特型抗體作為藥物的用途，以及更特別地，涉及其用於製造治療血友病A 的藥物的用途。血友病A是與染色體X的異常相關的遺傳疾病，其在受影響的人中顯示了自身不 能凝結。這種疾病是涉及凝結的蛋白質因子VIII (FVIII)蛋白的基因上突變的結果，其決 定了血液中因子VIII的完全缺乏，或者其部分不足。血友病A是影響血液凝固的最常見的功能不全在法國，5000人中1名男性是患 病的，其代表了患有血友病的患者的80 %。另一種類型的血友病，血友病B，影響患血友病 的20%的患者它起因於其他凝結因子，稱為因子IX中的缺乏。血友病(A或B型)的當前的治療包括靜脈內施用缺乏的或缺失的凝結因 子。在法國，用於治療血友病患者的因子VIII可以以分級和生物技術法國實驗室 (Laboratoire Fran9&lS du Fractionnement et desBiotechnologies) (LFB)或國際藥 物實驗室提供的血液衍生的藥物的形式，或以通過遺傳工程方法製備的重組藥物的形式 來獲得。編碼因子VIII的ADN已經被有效地分離並在哺乳動物細胞中表達(Wood等， Nature (1984) 312 330-337)，它的胺基酸序列從ADNc推導出。分泌的因子VIII (FVIII)是分子量300KDa(2332個胺基酸)的糖蛋白，在內部凝 結途徑的活化中起到關鍵作用。無活性的FVIII由六個區域組成A1 (殘基1-372)、A2(殘 基 373-740)、B (殘基 741-1648)、A3 (殘基 1649-2019)、Cl (殘基 2020-2172)和 C2 (殘 基2173-2332)，從N-末端到C-末端。在被分泌之後，FVIII作用於von Willebrand因子 (vffF)，其保護FVI11對抗血漿蛋白酶。FVIII在被凝血酶裂解時從vWF上解離。這種裂解 引起了 B結構域的消除和異二聚體的形成。FVIII以這種形式在血漿中循環。這種異二聚 體由重鏈(A1、A2)和輕鏈(A3、C1、C2)組成。當FVIII注入到血友病患者中時，它與患者的血液循環中的vonWillebrand因子 結合。活化的因子VIII作為活化的因子IX的輔助因子起作用，加速因子X向活化的因子 X的轉變。活化的因子X將凝血酶原轉變成凝血酶。然後凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維 蛋白，發生凝結。因子VIII施用遭遇的主要問題是在患者中針對因子VIII的抗體的出現，稱為「抑 制性抗體」。這些抗體中和了因子VIII的促凝血活性，其在注入時就失活了。因而，施用的 凝結因子在可以停止出血之前被破壞了，其導致嚴重的併發症，因而引起治療失效。進一步 的，某些遺傳學的非血友病患者可能發展出針對內源因子VIII的抑制物這稱為獲得性血 友病。研究顯示了抗因子VIII免疫反應是多克隆IgG型的，主要屬於IgG4和IgGl亞 類，更罕見地屬於IgG2。IgG3亞類從不出現。輕鏈通常是Kappa型的。IgG4的過量呈遞對於具有長期的建立的抑制物的血友病患者是更顯著的。FVIII分子的C2和A2結構域是免 疫反應的有幫助的目標，儘管在某些情況下，檢測到針對A3結構域的抗體。當血友病患者 的血漿穿過具有固定的FVIII的免疫吸附柱時，有可能純化總抗FVIII抗體。回收的數量 通常高於 100 μ g/10mg 總 IgG(Gilles JG 等(1993)Blood ;82 :2452_2461)。已經開發了動 物模型來研究因子VIII的抑制物的形成；用人類重組因子VIII免疫的大鼠顯示了多克隆 型的快速免疫反應(Jarvis 等，Thromb Haemost. 1996 Feb ；75 (2) :318_25)。抗因子 VIII 抗體幹擾因子VIII的功能的機制有很多，包括幹擾因子VIII的蛋白水解裂解、幹擾因子 VIII與不同配體例如von Willebrand因子(vWF)、磷脂(PL)、因子IX、活化的因子X(FXa) 或APC (活化的蛋白C)的相互作用。容許減弱這種免疫反應的後果的幾種治療是可用的，治療的實例例如，涉及去氨 加壓素(desmopressin)，去氨加壓素是刺激因子VIII的產生的合成激素，凝結促進劑，例 如凝血酶原複合物的濃縮物或活化的凝血酶原複合物的濃縮物，重組因子Vila，血漿取出 法和大量或中間數量的因子VIII的輸注。儘管如此，這些方法是非常昂貴和低效力的。由於這種免疫多克隆反應的體內分析的複雜性，針對因子VIII的某些結構域的 單克隆抗體已經被某些科研小組分離。就此，已經分離了 IgG4kappa型的人類單克隆抗體 LE2E9。這種抗體針對因子VIII的Cl結構域，並且抑制因子VIII的輔助因子活性和它與 von Willebrand 因子的結合(Jacquemin 等，(2000)Blood 95 156-163)。以同樣的方法，分 離了針對因子VIII的C2結構域的人類單克隆抗體，稱為B02C11 (IgG4kappa)，從患有血友 病A、具有抑制物的患者的記憶B細胞的庫產生(Jacquemin等，Bloodl998 Jul 15 ；92 (2) 496-506)。B02C11識別因子VIII的C2結構域，抑制它與von Willebrand因子和與磷脂的 結合。它完全地抑制天然的和活化的因子VIII的促凝結活性。單克隆抗體的進一步的實 例是針對因子VIII的A2結構域的B0IIB2抗體。B0IIB2抗體抑制99%的因子VIII活性。 通過與A2結構域結合，它可以幹擾並抑制FIXa的結合，它在FVIII的這個區域內含有低親 和性結合位點，因而抑制FIXa的酶活性。作用的第二種設想的途徑是幹擾FVIII的異二聚 形式(A2:A1和A3:C1:C2)與FVIII的異三聚形式(A2和Al和A3 Cl C2)之間的平衡，通 過加速這些複合物的A2結構域的解離，使得它們無功能。(Ananyeva匪等，(2004)Blood Coagul Fibrinolysis. Mar. 15(2) 109-24. Review)。藉助於這些新的工具，進一步的、更新近的針對因子VIII抑制物抗體的策略考 慮施用中和抑制物抗體的抗獨特型抗體(具有與其他抗體的可變區相互作用的能力的抗 # ) (Saint-Remy JM 等，(1999) Vox Sang ;77 (suppl 1) :21_24)。小鼠抗獨特型抗體，稱為 14C12，在文獻W02004/014955中公開，在體內以劑量依賴性方式中和抗因子VIII目標抗 體(單克隆抗體B02C11)的抑制性質，所述抗因子VIII目標抗體針對因子VIII的C2結構 域。抗因子VIII免疫反應是多克隆的，還開發了針對因子VIII的A2結構域的小鼠抗獨特 型抗體(在專利申請FR 05 08320中描述)。A2結構域是43kD的結構域，它的功能不是公 知的，但已經表明了，針對因子VIII的A2結構域的抑制性抗體通過抑制過渡狀態中複合物 FXase/FX 的轉化來抑制因子 VIIIa 的功能(Lollar 等，J Clin Invest. 1994 Jun ；93 (6) 2497-504，Fay 等，J Biol Chem. 1996 ；271 (11) :6027_6032)。然而，針對因子VIII的免疫反應是多克隆的，因而，意味著抑制性抗體是針對不 同於A2和C2結構域的結構域的。實際上，即使抗因子VIII抗體的表位特異性的研究顯示大部分抑制物識別因子VIII分子的有限的區域，位於重鏈的A2結構域和/或輕鏈的C2結 構域上，其他表位有時也被識別。實際上，來自患者的某些血漿含有能夠結合因子VIII的 輕鏈的 Cl 結構域的抗體(Moreau 等，2000 ；95(11) :3435_441 Jacquemin et al, · 2000 ； 95(1) 156-162)。因而，總是需要進一步的工具，容許中和針對因子VIII的其他結構域的其他因子 VIII抑制性抗體，以更完整地中和血友病患者的抗因子VIII多克隆反應。因而，申請人試圖開發用於治療血友病A的新的工具，其允許中和針對因子VIII 的Cl結構域的抑制性抗體。發明的詳細說明因而，本發明的第一個目標涉及針對因子VIII人類抑制性抗體的單克隆抗獨特 型抗體，所述抑制性抗體是針對因子VIII的Cl結構域，這種抗獨特型抗體具有所述抗體的 每條輕鏈的至少一個⑶R區域(互補決定區)，其中肽序列與選自序列SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :14的序列具有至少70%的同一性，並具有所述抗體的每條重鏈的至 少一個CDR區域，其中肽序列與選自序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11的序 列具有至少70%的同一性。所涉及的⑶R區域是⑶Rl和/或⑶R2和/或⑶R3區域。SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID N0:13禾口 SEQ ID NO :14 的序列根據Kabat 來定義[Kabat 等，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，NIH Publication，91-3242(1991)]。在特別有益的實施方式中，與每種上述序列的同一性是至少80%，優選的至少 90%、95%、99%，更優選的100%。同一性的百分比通過排列要比較的兩個序列並通過計算 具有相同胺基酸的位置的數目，用這個數目除以序列的胺基酸的總數來計算。在任何情況 下，這些序列差異完全不影響單克隆抗體對其目標的親和性，或者它的功能。因子VIII 「抑制性抗體」或「抑制物」是指抑制因子VIII的全部或部分促凝血活 性的抗體，即，通過與之結合，特別是其表位位於因子VIII上的抗因子VIII抗體。有益地， 本發明的抗體具有中和針對因子VIII的Cl結構域的抑制性抗體的至少20%、有益地至少 30 %、有益地至少40 %、有益地至少50 %、有益地至少60 %、在更有益的方法中，至少70 %、 80%、90%、99%或100%的凝結抑制活性，所述抑制性抗體是本發明的抗獨特型單克隆抗 體的目標。中和抑制性抗體的凝結抑制活性的這種能力通過在例如「因子VIII發色團測 試」 (Jacquemin等(1998) Blood 92. 494-506)的分析中測量存在抑制性抗體和抗獨特型抗 體的情況下因子VIII的活性來測定。「抗獨特型抗體」的表述是指針對目標抑制性抗體的可變區的抗體。在本發明的特 定的方面，本發明的抗獨特型抗體針對抑制性抗體，其中所述抗體的重鏈的可變區涉及種 系DP-10。這種抑制性抗體可以通過用因子VIII或來自因子VIII的的片段，更特別地用 包含Cl結構域的全部或部分的片段來免疫，從人類(例如，來自含有抑制性抗體的患者血 清)或其他動物物種，例如，來自非限制性的列表的小鼠、馬、山羊、非人靈長類獲得。有益地，本發明的抗獨特型抗體的目標抑制性抗體識別處於天然結構中的Cl結 構域。有益地，本發明的抗獨特型抗體的目標抑制性抗體不識別作為R2150H突變的相同的 結構域。
本發明的單克隆抗獨特型抗體是人類或動物來源的。此外，它可以使用多種不同 的方法獲得。例如，產生抗獨特型抗體的細胞可以從具有抗因子VIII抑制性抗體的患者的 外周血淋巴細胞、或從健康人獲得。這些細胞可以通過本領域技術人員公知的技術永生化， 並根據生產抗獨特型抗體的能力來選擇，以中和針對因子VIII的抑制性抗體。生產本發明 的單克隆抗獨特型抗體的進一步的方法是通過動物、有益地為小鼠，的免疫，通過注射針對 因子VIII的Cl結構域的因子VIII抑制性抗體、然後通過融合脾臟淋巴細胞和骨髓瘤細胞 系，有益地為小鼠骨髓瘤，隨後鑑定和克隆產生針對因子VIII抑制性抗體的抗獨特型抗體 的細胞培養物。在本發明的優選的實施方式中，本發明的抗獨特型抗體的輕鏈的每個CDR區域含 有與分別確定為SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ IDNO 14的序列至少70%同一性的 肽序列，所述抗體的每條重鏈的每個⑶R區域含有與分別確定為SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10和SEQ IDNO 11的序列至少70%同一性的肽序列。因而，本發明的抗體的每條輕鏈的⑶Rl區域含有與SEQ ID NO 12的序列具有至 少70%同一性的肽序列，其中後者具有胺基酸序列ArgAla Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn，本發明的抗體的每條輕鏈的⑶R2區域含有與SEQ ID NO 13的序列具有至少70%同一 性的肽序列，其中後者具有胺基酸序列Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser，本發明的抗體的每 條輕鏈的⑶R3區域含有與SEQ ID NO :14的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中後者 具有胺基酸序列Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met LeuThr，本發明的抗體的每條重 鏈的⑶Rl區域含有與SEQ ID NO 9的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中後者具有 胺基酸序列Gly Tyr ThrPhe Thr Thr Tyr Trp Met His，本發明的抗體的每條重鏈的CDR2 區域含有與SEQ ID NO :10的序列具有至少70%同一性的肽序列，其中後者具有胺基酸序 列 Tyr lie Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn PheLys Asp,本發明的 抗體的每條重鏈的⑶R3區域含有與SEQ ID NO 11的序列具有至少70%同一性的肽序列， 其中後者具有胺基酸序列 Ser GlyAla Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser。在特 別有益的方式中，與每種上述序列的同一性是至少80 %，優選的至少90 %、95 %、99 %，更 優選的100%。有益地，本發明的單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可變區由與核酸序列SEQ ID NO 16具有至少70%同一性的核酸序列編碼，其中後者具有下列胺基酸序列caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcacaatgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaagccaggatcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggcagtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactgccagcagtgg agtagtaacc cacccatgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaac，所述單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區由與核酸序列SEQ IDNO 15具有至 少70%同一性的核酸序列編碼，其中後者具有下列胺基酸序列caggtccagc t tcagcagtc tggggctgaa c tggcaaaac ctggggcctc agtgaagatgtcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagaggcctggacagg atctggaatg gattggatac attaatccta cctctggtta tactgagtac aatcagaacttcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctacatgcaactgaacagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgggg gcctactataggtacgacga tgctatggac tcctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcag。對於本發明來說，信號肽可以添加到序列SEQ ID N0:15和SEQ IDN0:16來分別產 生例如序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，其中本發明的抗體的活性或特異性都不受這種 信號肽的影響。SEQ ID NO 1的序列對應於下列核酸序列atgggatgga gctggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccaggtccagcttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcctgcaaggctt ctggctacac ctttactacc tactggatgc actggataaa acagaggcctggacaggatc tggaatggat tggatacatt aatcctacct ctggttatac tgagtacaat cagaacttcaaggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg caactgaacagcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgggggcc tactataggtacgacgatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagoSEQ ID NO 2的序列對應於下列核酸序列atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctattca gtgcctcagt cataatgtccagaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaaggtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagaagccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttcagtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatgctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccacc catgctcacg ttcggtgctgggaccaagct ggagctgaaa C0在特別有益的方式中，所述序列同一性是至少80%，優選的至少95到99%。同一 性的百分比通過排列要比較的2條序列並通過計算含有相同核苷酸的位置的數目，用這個 數目除以序列的核苷酸的總數來計算。遺傳密碼簡併性產生了相同的胺基酸可以由不同的 核苷酸的幾種三聯體來編碼的事實。在任何情況下，單克隆抗體對其目標的親和性以及它 中和目標抑制性抗體的抑制活性的能力都完全不受這些序列差異的影響。在本發明的優選的方面，所述單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可變區由核酸序 列SEQ ID NO :16編碼，所述單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區由核酸序列SEQ ID NO 15編碼。在有益的方式中，本發明的抗體的每條輕鏈可變區的肽序列是與序列SEQ ID NO 18具有至少70%同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%同一性的序列。其 中後者具有下列胺基酸序列Gln lie Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro Gly GluLys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser Asn LeuAla Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr SerLeu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTrp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys0對於本發明來說，信號肽可以添加到例如序列SEQ ID N0:17和SEQID N0:18來分別產生例如，序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，其中本發明的抗體的活性或特異性都不受 這種信號肽的影響。在有益的方式中，本發明的抗體的每條重鏈可變區的肽序列是與序列SEQ ID NO 3具有至少70%同一性、有益地至少80%或90%、再更有益地至少99%同一性的序列。其 中後者具有下列胺基酸序列Met Gly Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly ValHis Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly AlaSer Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp MetHis Trp lie Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie AsnPro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr LeuThr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr SerGlu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr AspAsp Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser0在特別有益的方式中，本發明的抗體的每條輕鏈的肽序列是與序列SEQ ID NO 4 具有至少70 %的同一性、有益地至少80 %或90%、再更有益地至少99%的同一性的序列， 本發明的抗體的每條重鏈的肽序列是與序列SEQ ID NO :3具有至少70%的同一性、有益地 至少80 %或90 %、再更有益地至少99 %的同一性的序列，優選的，本發明的抗體的每條輕鏈的肽序列是序列SEQ ID NO :4。其中後者具有 下列胺基酸序列MetAspPheGlnValGlnliePheSer Phe Leu Leu Phe Ser Ala Ser.ValIleMet SerArgGlyGlnlieValLeuSerGlnSer Pro Ala lie Leu Ser Ala SerPro GlyGlu LysValThrMetThrCysArgAlaSerSer Ser Val Ser Tyr MetAsn TrpTyr GlnGln LysProGlySerSerProLysProTrplie Tyr Ala ThrSer Asn Leu AlaSer GlyVal ProAlaArgPheSerGlySerGlySerGly ThrSer Tyr Ser Leu Thr lieSer ArgVal GluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCys Gln Gln Trp Ser Ser Asn ProPro MetLeu ThrPheGlyAla Gly Thr LysLeu Glu Leu Lys. 優選的，本發明的抗體的每條輕鏈的肽序列是序列SEQ ID NO :3。從序歹Ij SEQ ID NO 16推出的肽序列是序列SEQ ID NO 18，從序列SEQ ID NO 15 推出的肽序列是SEQ ID N0:17。其中後者具有下列胺基酸序列Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala SerVal Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met HisTrp lie Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn ProThr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu ThrAla Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser GluAsp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp AspAla Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser。優選的，本發明的單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可變區具有肽序列 SEQ IDNO :18，本發明的單克隆抗獨特型抗體的每條重鏈的可變區具有肽序列SEQ ID NO 17。在優選的方式中，本發明的抗獨特型抗體的目標抑制性抗體是以登記號LMBP6165CB、由Collen研究基金會於2004年8月保藏在比利時微生物/質粒保藏協作保藏 所(BCCM/LMBP), Laboratorium voorMoleculaire Biologie, University of Ghent, Technologiepark 297，B_9052Zwi jnaarede的抗體RHD5。這種抗體，以及它的核苷酸和肽 序列在專利申請W02005/106455中描述。抗體RHD5是針對因子VIII的Cl結構域的人類 單克隆IgGl抗體，最初從患有血友病A、即具有高水平抑制物的獲得性嚴重血友病A的患者 的淋巴細胞產生。這個抗體屬於IgGl亞類，來源於種系DP-10。在因子VIII上所述抗體識 別的表位是處於其天然結構的Cl結構域，而不是與R2150H突變相同的結構域。抗體RHD5 可以抑制高達98%的因子VIII活性。本發明的抗體還涉及具有本發明的特徵的任何修飾的抗體，其中一個或多個氨基 酸被替換或刪除。這種替換或刪除可以位於分子中的任何位置。在幾個胺基酸被替換或刪 除的情況下，可以考慮替換或刪除的任何組合。可以進行本發明的抗體的可變區的這種序 列修飾以提高可能與本發明的抗獨特型抗體或與目標抑制性抗體接觸的殘基的數目。在本發明的一個實施方式中，所述抗獨特型抗體是小鼠抗體(anticorps murin)。有益地，這種小鼠單克隆抗獨特型抗體是IgGlkappa。優選的，本發明的單克隆抗體是嵌合抗體。「嵌合抗體」的表述，要理解為它是指一 種抗體，其中輕鏈和重鏈的可變區屬於與輕鏈和重鏈的恆定區不同的物種。因而，本發明的 抗體還含有屬於非鼠物種的輕鏈和重鏈的恆定區。就此來說，能夠使用所有的非鼠哺乳動 物科和種，特別是，例如，人、猴、鼠科(除了小鼠)、豬科、牛科、馬科、貓科、犬科以及禽類。本發明的嵌合抗體可以使用本領域技術人員公知的重組ADN的標準技術來構建， 更特別地通過使用例如 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,81. pp. 6851-55 (1984) 所描述的「嵌合」抗體構建技術，其中利用重組ADN技術來使用人類免疫球蛋白的相應區域 替換來自非人哺乳動物的抗體的重鏈的恆定區和/或輕鏈的恆定區。在本發明的特定的方面，本發明的抗體是人類雜交抗體，也就是說嵌合抗體，它的 恆定部分是人類的。本發明的這個實施方式允許降低抗體在人類中的免疫原性，從而改善 它在向人治療性施用時的效力。有益地，本發明的抗體是人源化的抗體。這種抗體可以通過將非人物種的單克隆 抗體的一個或多個CDR區域(互補決定區)與人類框架區域(可變區的高度保守區域，稱 為框架)相連來獲得，這種製造過程在本領域中已經討論了(Jones等，Nature (1986) 321 522 ；Riechmann等，Nature (1988) 332 323)。這種針對識別FVIII的Cl結構域的抑制性抗 體的可變區的人源化抗體可以含有人類框架區域和序列SEQ ID N0:9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ IDNO 14 的一個或多個 CDR 區域。一種本發 明的特定人源化的抗體是針對識別FVIII的Cl結構域的抑制性抗體的可變區的人源化抗 體，其 CDR 區域是序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO 14 的區域。在有益的方式中，本發明的單克隆抗獨特型抗體是2006年1月24日以登記號 碼CNCM 1-3559保藏在微生物培養物國家保藏所(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes) (CNCM,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)18B6 產生的抗體18B6。單克隆抗獨特型抗體18B6的每條輕鏈的可變區由核酸序列SEQ ID N0 16編碼，單克隆抗獨特型抗體18B6的每條重鏈的可變區由核酸序列SEQ ID NO 15編碼。獲得雜交瘤18B6的方法在本文件的「實施例」部分中描述。本發明的單克隆抗獨特型抗體還涉及包含抗體18B6的片段的任何抗體，更特別 地，包含抗體18B6的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的任何抗體，或抗體18B6的輕鏈可變區 和/或重鏈可變區的任何片段。「片段」的表述，是指F(ab' )2片段或Fab'片段或Fab片 段或CDR區域、或任何這些片段或區域的任何修飾的形式。在本發明的特定的實施方式中，本發明的單克隆抗獨特型抗體是F(ab' )2片段 或Fab'片段或Fab片段或CDR區域，或任何這些片段或區域的任何修飾的形式。使用木瓜 蛋白酶的免疫球蛋白酶消化產生2個相同的稱為「Fab片段」(抗原結合的片段)的片段和 Fc片段(可結晶部分)。Fc片段是免疫球蛋白的效應物功能的支持。使用胃蛋白酶消化，產生F(ab' )2片段，其中兩個Fab片段保持被兩個二硫鍵連 接，Fc片段被分成幾個肽。F(ab' )2片段由兩個Fab'片段形成(一個Fab'片段由Fab 和絞鏈區組成)，由相互連結的二硫鍵連接來形成F(ab' )2。含有抗體的結合位點的這些片段，也可能喪失產生它們的完整抗體的某些性質， 例如，活化補體、或結合Fcgamma受體的能力。然而，這些片段沒有喪失完整抗體中和抑制 性抗體的能力。因而，本發明還涉及抗體18B6的F(ab' )2、Fab'、Fab片段，或涉及⑶R區 域，或任何這些片段或區域的任何修飾的形式。特別地，這些片段保持了完整抗體中和RHD5 抗體的能力。本發明的進一步的目的是產生例如如上所述的抗體的穩定的細胞系。本發明的穩 定的細胞系可以是人類或動物來源的。本發明的穩定的細胞系可以來源於人類永生細胞。 在本發明的進一步的實施方式中，這種細胞系可以來源於動物來源，例如小鼠的永生細胞。 在本發明的這個實施方式中獲得的細胞系的優選的實例是以編號1-3559保藏在CNCM的細 胞系18B6。在進一步的實施方式中，本發明的穩定的細胞系是一種細胞系，其在基因組的 期望的位點整合了容許本發明的抗體的表達的遺傳構建體。獲得這種細胞的步驟是穩定轉 染。這種步驟可以應用於任何類型的細胞，只要它們能夠維持在體外培養中。穩定的轉染 需要遺傳構建體的整合，其可以通過同源重組或隨機地進行。例如，在包含為細胞賦予抗生 素抗性的感興趣的基因的遺傳構建體中的陽性選擇盒的存在，證明了轉基因向細胞基因組 中的插入。作為亞克隆步驟的結果，從本發明的抗體獲得長期的生產細胞系，例如18B6，其 可以在體外培養中維持。表達本發明的抗體的穩定的細胞系可以選自由人類細胞系、齧齒動物細胞系，例 如小鼠細胞系、SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa，或任何人類來源的其他細 胞例如 PERC6、CHO 細胞系，特別地 CHO-K-U CHO-LeclO, CHO-LecU CHO-Lec 13, CHOPro-5、 CHO dhfr-(CHO DX Bl 1，CHO DG44)構成的組，或是選自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、 C0S-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的進一步的細胞系。本發明的進一步特別的主題是以登記號碼CNCM 1-3559保藏在微生物培養物國家 保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6。由雜交瘤18B6產生的單克隆抗獨特型抗體的每條輕鏈的可 變區由核酸序列SEQ ID NO :16編碼，由雜交瘤18B6產生的單克隆抗獨特型抗體的每條重 鏈的可變區由核酸序列SEQ ID NO 15編碼。雜交瘤18B6產生的抗體是抗體18B6，在本文 件的「實施例」部分中描述了獲得雜交瘤18B6的方法。本發明的進一步的主題是編碼本發明的抗體的重鏈可變區的序列SEQ ID NO 15的ADN片段，例如早先所描述的。這種ADN片段可以插入到允許多肽、優選抗體的表達的 載體中，所述抗體的重鏈可變區由核酸序列SEQ ID NO: 15編碼，其推出的序列是序列SEQ ID NO :17，以導入和維持在宿主細胞中。這種載體允許這種外源核酸片段在宿主細胞表達， 因為它含有這種表達所必需的序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。這種載體是本 領域技術人員公知的，可以是腺病毒、逆轉錄病毒、質粒或噬菌體，這個列表不是限制性的。 此外，可以使用任何哺乳動物，例如宿主細胞，其是表達本發明的多肽或抗體的細胞，例如 SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa，或人類來源的任何其他細胞例如PERC6、 CHO 細胞系，特別地 CH0-K-1、CH0-Lecl0、CHO-Lecl、CH0-Lecl3、CHO Pro_5、CH0 dhfr-(CHO DX BlUCHO DG44)，或選自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK、K6H6、NSO、 SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的其他細胞系。本發明的進一步的目標是編碼本發明的抗體的輕鏈可變區的序列SEQ ID NO 16 的ADN片段，例如早先所描述的。這種ADN片段可以插入到允許多肽、優選抗體的表達的 載體中，所述抗體的輕鏈可變區由核酸序列SEQ ID NO :16編碼，其推出的肽序列是序列 SEQ ID NO :18，以導入和維持在宿主細胞中。這種載體允許這種外源核酸片段在宿主細胞 表達，因為它含有這種表達所必需的序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。這種載 體是本領域技術人員公知的，可以是腺病毒、逆轉錄病毒、質粒或噬菌體，這個列表不是限 制性的。此外，可以使用任何哺乳動物細胞作為宿主細胞，其是表達本發明的多肽或抗體的 細胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤例如Namalwa，或人類來源的任何其他細胞例 如 PERC6、CHO 細胞系，特別是 CH0-K-1、CHO-LeclO, CHO-LecU CHO-Lec 13, CHO Pro_5、CHO dhfr- (CHO DX Bll、CH0DG44)，或選自 Wil_2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK、 K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的其他細胞系。本發明的進一步的目標是藥物組合物，其包含本發明的抗體和至少一種賦形劑和 /或至少一種藥學上可接受的載體。優選的，本發明的藥物組合物中含有的單克隆抗獨特型 抗體是抗體18B6、來自18B6的片段或區域、或包含18B6的可變區或CDR的嵌合抗體或人 源化抗體，以及在本文件中早先描述的那些。本發明的藥物組合物可以被配製入可以被要 治療的患者耐受任何賦形劑。這種賦形劑的實例包括水、鹽水溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶 液，以及任何其他適合的水性生理溶液。賦形劑也可以含有少量的添加劑，例如，提高等滲 性和組合物的穩定性的物質。這種賦形劑包括磷酸鹽緩衝液、碳酸氫鹽緩衝劑和Tris緩衝 液。這種賦形劑是本領域技術人員公知的。標準製劑可以是用於注射的液體形式，或固體 製劑，其可以在施用之前重懸浮在適合的液體中。用於製備本發明的藥物組合物的有用的 載體有益地具有提高治療組合物在動物或患者中的半衰期的功能，或允許活性成分的控制 釋放的功能。這種載體可以是能夠以正常速度散布藥物的、或僅在某些環境中散布藥物的 有機和合成的聚合物、以及進一步的化合物，也可以是脂質體，這個列表不是限制性的。有益地，本發明的藥物組合物，此外至少包含針對抑制性抗體的抗獨特型抗體，所 述抑制性抗體結合因子VIII的不同於Cl結構域的結構域。這種其他的抗體可以是針對抑 制性抗體的抗獨特型抗體，所述抑制性抗體結合因子VIII的Al、或A3、或B、A2或C2結構 域。實際上，發展出抑制性抗體的、患有血友病A的患者最經常地展現幾種類型的抑制性抗 體。此外，不同類型的抑制性抗體的數量和性質是不固定的，在患者的生命期中可以改變。 因而，同一患者的不同的抑制性抗體針對因子VIII的不同結構域，特別有益的不是使用一種、而是使用針對不同抑制性抗體的幾種類型的抗獨特型抗體來治療患者。優選的，所述藥物組合物包含針對結合因子VIII的C2結構域的抑制性抗體、和/ 或結合因子VIII的A2結構域的抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，以及本發明的單克隆 抗體。實際上，A2和C2結構域是抗因子VIII免疫反應的主要目標。因而，包含針對結合 因子VIII的Cl結構域的抑制性抗體的抗獨特型抗體以及針對結合C2結構域的抑制性抗 體的抗獨特型抗體的混合物的藥物組合物，允許中和患者中存在的至少70%、有益地至少 80%或90%的全部抑制性抗體。在本發明的優選的實施方式中，本發明的藥物組合物包含 抗體14C12 (在比利時協作微生物保藏所以編號LMBP 5878CB保存)和/或抗體30D1 (在 CNCM以編號1-3450保藏)。在本發明的進一步優選的實施方式中，所述藥物組合物包含以 編號1-3510在CNCM保藏的嵌合抗體14C12，和/或衍生自抗體30D1的嵌合的或人源化的 抗體，其是包含抗體30D1的可變區的抗體。本發明的進一步的目的是本發明的抗體作為藥物的用途。本發明的進一步的目的是本發明的抗體用於製造藥物的用途。有益地，這種藥物 被用於在患有血友病、包含針對因子VIII的Cl結構域的抑制性抗體的患者中降低和/或 防止和/或治療出血。本發明的進一步的目的是本發明的抗體用於製造用於治療A型血友病的藥物的 用途。有益地，這樣治療的A型血友病是具有抑制物的血友病。用本發明的抗體治療的 這種類型的血友病可以是先天的或獲得性的。通過中和抑制性抗體，本發明的抗體使得通 過向患者注射因子VIII的治療是有效的，因為因子VIII的活性不再被抑制性抗體抑制。本發明的進一步的目標是本發明的抗體用於中和針對因子VIII的Cl結構域的抑 制性抗體的體外或體內抑制活性的用途。可以進行這種過程來從患者的血液中耗盡針對因 子VIII的Cl結構域的抑制性抗體，然後向所述患者重新注射處理過的血液。本發明的進一步的目標涉及包含本發明的抗體、優選的抗體18B6的藥物。本發明的進一步的目的是所述抗體用於吸附抑制性抗體的用途，例如，用以純化 因子VIII抑制性抗體。最後，本發明的進一步的目標是本發明的抗體用於檢測和/或純化因子VIII抑制 性抗體的用途。進行這種檢測方法和純化的一般過程是本領域技術人員公知的。舉例來說， 可以提及的是使用含有珠子的免疫純化柱，所述珠子具有嫁接到它們表面上的本發明的抗 體。僅被抗體識別的分子將自身吸附到所述珠子上。其他的將穿過所述柱。為了回收所述 分子，提高的溶劑離子強度是足夠的。本發明的進一步的方面和益處將在以下實施例中描述，其將被認為是例示而不是 限制本發明的範圍。


附圖1 對於4隻小鼠的抗獨特型抗體與RHD5結合的提高(平均值)。附圖2 抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結合。附圖3 抗體RHD5與不溶的重組FVIII (recFVIII)的結合的抑制作用。附圖4 用18B6對RHD5的中和。實施例t施例 ι 針對因子 Yin 的 Ci(「杭 ci 杭體」)根據在文件Jacquemin 等(1998)，Blood 92，496-506 和專利申請 W02005/016455 中描述的操作，以下在此描述的人類淋巴樣幹細胞系通過患有獲得性血友病A、發展了對因 子VIII的免疫反應的患者的B淋巴細胞的永生化來獲得。產生單克隆抗Cl RHD5抗體的細胞系以登記號LMBP 6165CB、由Collen研究基金 會於2004年8月保藏在比利時微生物/質粒保藏協作保藏所(BCCM/LMBP) ,Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University ofGhent, Technologiepark 297，B-9052 Zwijnaarede, Belgium。RHD5抗體的重鏈可變區的核苷酸序列是序列SEQ ID NO :5，其中後者具有下列氨 基酸序列atggactgga cctggaggtt cctctttgtg ccagtcccaggtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg
gatggtctcctgcaaggctt acaggcccctggacaagggc aaacaccgcacggaacttcc agcctacatacgactgagga
ctggaggcac ttgagtgggt agaatagagt gcctgagatc
cttcagcagc gggagggatc caccattacc tgaagatacg
gtggcagcag aagaagcccg tttggtatca atccctatct gcggacgaat gccgtgtatt
ctgcaggtgt ggtcgtcggt gctgggtgcg ttggtacagc tcacgagcac actgtgtcgg
cggtcgagatgcctacagct ttgatggttt tgatgtctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca g,RHD5抗體的輕鏈可變區的核苷酸序列是序列SEQ ID NO :6，其中後者具有下列氨 基酸序列atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact gcacaggatc cgtggcctcctctgggctga ctcagccaca ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caacatcacctgctctagag ataagttggg tcataaattt gcttcctggt atcaacagaa gccaggccag tcccctgctcttctcatcta tcaagacagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctccaactctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat gaggctgactattactgtca ggcgtgggac aacaccactg ccgtattcgg cggagggacc aagttgacagtcctaagtca gccc&0相應於序列SEQ ID NO :5的肽序列是序列SEQ ID NO :7，其中後者具有下列氨基 酸序列Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Ala GlyVal Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe GlyIle Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Gly IleIle Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Thr Ala Arg Asn Phe Gln Asn Arg Val ThrIle Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr lie Arg Leu Arg Ser Leu ArgSer Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gly Gly Arg Asp Ala Tyr Ser PheAsp Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser，相應於序列SEQ ID NO :6的肽序列是序列SEQ ID NO :8，其中後者具有下列氨基 酸序列
Met Ala Trp lie Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Val Tyr Cys Thr Gly SerVal Ala Ser Ser Gly Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Val Ser Pro Gly GlnThr Ala Asn lie Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly His Lys Phe Ala Ser TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ala Leu Leu lie Tyr Gln Asp Ser LysArg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr AlaThr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys GlnAla Trp Asp Asn Thr Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr ValLeu Ser Gln Pro。或者，具有需要的性質的抗體可以通過免疫動物來產生。在這種情況下，人類因子 VIII與佐劑注射到小鼠中。通過融合脾臟淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞系來獲得單克隆抗人 類抗體。鑑定產生抗因子VIII抗體的細胞上清液，並通過限制稀釋來克隆。這種方法的一 般性說明可以在 Current Protocols in Immunology, Chapter 2，John Wiley&Sons, Inc， 1994中找到。以下描述了具有期望的性質的抑制物的進一步選擇。實施例2 抗獨特型抗體18B6的產牛I.小鼠免疫四隻6周齡Balb/c雌性小鼠用懸浮在完全弗氏佐劑(ACF)(第一次免疫)中的、 然後懸浮在弗氏不完全佐劑(AIF)中的IOyg FVIII RHD5抗體的人類抗Cl結構域在爪墊 中皮下地注射(SC)三次。第一次放血(放血0)在免疫之前(在第0天(JO)放血)進行，然後如下進行注 射和放血Jl 注射N° 1 (存在完全弗氏佐劑的情況下10 μ g RHD5抗體)J15 放血 N。1J16 注射N。2 (在存在弗氏不完全佐劑的情況下10 μ g RHD5抗體)J28:放血 N。2J29:注射N° 3 (在存在弗氏不完全佐劑的情況下IOyg RHD5抗體)J44:放血 N。3II.小鼠的免疫反應的評估為了評估不同的放血中抗RHD5抗體的存在，進行直接結合的ELISA分析。為此， 3 μ g/ml的RHD5抗體或對照IgGl進行不溶解化，50 μ g/孔，un甘氨酸緩衝液，在4°C過夜 (甘氨酸緩衝液=0. IM甘氨酸、0. 17M NaCl，pH 9. 2)。用PBS/Tween進行三次洗滌(PBS =140. OmM NaCl, 2. 6mM KCl, 1. 4mM KH2PO4,8. InM Na2HPO4. 2H20, pH 7.4)。系統在室溫下 (RT)使用 100 μ 1/孔的 Magic 緩衝液(Magic 緩衝液=50mM Tris,0. 17M NaCl,l% BSA,pH 7. 2)保持飽和30分鐘。後來，放出的血液在Magic緩衝液中稀釋到1/10、1/100、1/1000和 1/10000，在室溫下孵育2小時(50μ1/孔)。然後，在PBS/Tween中進行3次洗滌。隨後， 系統與HRP (辣根過氧化酶)(Bio-Rad)標記的1 μ g/ml山羊多克隆小鼠抗IgG抗體在室溫 系孵育2小時(50 μ 1/孔)(在Magic緩衝液中稀釋)。然後，系統用PBS/Tween洗滌3次， 用發色團(鄰-苯基二胺)進行顯示，獲得的顏色的強度使用具有相應于波長490/650nm 的濾光器的讀出器讀取(讀出器Emax Molecular Devithese，Sunnyvale，CA)。使用對照IgGl獲得的光密度的結果 表1使用RHD5獲得的光密度的結果 表2獲得的結果在附圖1中描繪。結論每隻小鼠正確地應答並與RHD5 Fab片段的注射類似地起反應。在任意的方 式中，選擇小鼠n° 4來進行融合。III.融合和篩詵進行小鼠n° 4的脾臟淋巴細胞與骨髓瘤SP2/0的細胞的融合。以對於本領域技 術人員常規的途徑進行融合(J. G. Gilles 等，Blood(2004) 103 :2617_23 ；P. Cornells,((Les anticorps monoclonaux》，Revue IRE, vol.7, N° 4,1983)。根據有限稀釋的原則將細胞在含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的DMEM培養基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)中連續地擴增，在直接結合ELISA分析中檢測測試 為陽性的克隆，例如早先在II點中描述的那樣。結合的特異性通過不溶解的具有非相關特異性、在實驗室中生產的人類IgGl抗 體來確認。為了確定雜交瘤穩定性，以從200μ 1到5ml的不同培養基體積在克隆擴增期間重 復表位篩選測試(測試1到3)。測試1 =在200 μ 1的孔中測量測試2 =在Iml的孔中測量測試3 =在5mL的瓶中測量在不同的表位篩選期間獲得的結果在以下表格中概述 表3IV.使用培養物上清液的抑制作用分析如在表3中所示，使用培養物上清液進行抑制作用的測試。進行這種分析來從克 隆中選擇抗獨特型抗體，其精確地識別定位於Ac RHD5的抗體決定簇水平上的表位決定簇。 在ELISA分析中測試所述抗獨特型抗體對RHD5與不溶性FVIII的結合的抑制作用。在甘氨酸緩衝液中2 μ g/ml的重組因子VIII(recFVIII) (Baxter)，50 μ 1/孔進 行不溶解化，在室溫下保持2小時。0. 6 μ g/ml終濃度的RHD5抗體(或不相關的IgGl)與 Magic緩衝液中稀釋度1/1、1/2和1/4的培養物上清液預孵育2小時。反應孔用PBS/Tween 緩衝液洗滌3次，然後用100 μ 1/孔的Magic緩衝液飽和(在室溫下30分鐘)。以後，培養物上清液與50 μ 1的RHD5 (或不相關的IgGl)(在室溫下2小時，Magic緩衝液)孵育， 然後，進行3次洗滌。通過添加50 μ 1/孔的Magic緩衝液中1 μ g/ml的小鼠多複製人類抗 IgG HRP標記的(Southern Biotechnology)抗體的溶液，檢測與不溶的recFVIII結合的 RHD5抗體。用PBS/Tween進行三次連續的洗滌，然後用發色團(0PD鄰-苯基二胺)進行顯 示，獲得的顏色的強度使具有相應于波長490/650nm的濾光器的讀出器讀取(讀出器Emax Molecular Devithese, Sunnyvale, CA)。結論如表3所示，11個克隆能夠特異性地抑制與不溶解的recFVIII結合的RHD5抗體。 (N. B.陰性值，表示結合抗體決定簇的外部區域的可能性，或者反映培養物上清液中不足 的Ac濃度。然而，對於陽性的數目，根據以下的測試淘汰陰性孔)。V.式RHD5 秘··棚牛(_〒VIII)白術_
測量 在Magic緩衝液中，在37°C，以1 μ g/ml的濃度將RHD5抗體與在抑制作用測試期 間選擇的不同克隆的上清液孵育(稀釋3倍、6倍、12倍和24倍)。在30分鐘之後，添加 0. 5U/mL終濃度的FVIII Kogenate (Bayer)，在37°C進行互補孵育30分鐘。樣品在Magic 緩衝液中稀釋30X，然後根據廠家的說明書添加產色DADE測試的試劑(因子VIII產色的， Dade BehringGmbh, Marburg, Germany)。如在表3中所示，10個克隆能夠中和Ac RHD5的抑制性活性。選擇抗體18B6來按 以下過程使用，作為結果和中和曲線的函數。VI.選擇的18B6抗RHD5克隆的擴大生產在DMEM培養基中生產抗獨特型抗體18B6。這種生產繼之以在蛋白G親和柱上純 化(其允許抗體的純化、然後濃縮，因而進一步確定獲得的抗獨特型抗體特異性)。純化18B6以 8. 48mg/ml 產生 8mlVII.特異性評估根據與II和IV點中描述的相同方案使用ELISA評估各個製品。1. ELISA分析抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結合抗獨特型抗體18B6與不溶的抗體RHD5的直接結合在附圖2中說明。曲線顯示了， 抗體18B6與RHD5的結合是劑量依賴性的。2. ELISA分析抗體RHD5結合不溶的重組FVIII的抑制作用。根據IV點中描述的方案測量RHD5抗體結合不溶的重組FVIII的抑制作用。使用 的RHD5的濃度等於2 μ g/ml。
20 表 4結果在附圖3中示出。在2. 5的RHD5/18B6摩爾比下獲得了 RHD5結合FVIII的 50%抑制，而等摩爾的比例抑制92%的這種結合。3.功能測試RHD5抗體抑制性活性(抗FVIII)的中和的測量方案與V點中描述的相同，最終的RHD5濃度0. 4 μ g/ml，純化的抗獨特型抗體的曲 線從4到0. 002 μ g/ml終濃度。結果在以下的表5中給出 表 5結果在附圖4中說明。以等摩爾的RHD5/18B6比例獲得了 RHD5抑制活性的50% 中和。4.使用「表面胞質團共振Biacor」方法的抗獨特型抗體18B6的結合動力學測量利用 Pharmacia Biosensor BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suede) 通過使用「表面胞質團共振Biacore」方法評估了抗獨特型抗體18B6對抑制物RHD5抗體的 結合動力學。RHD5抗體固定在CM5探針的活化的表面上。抗獨特型抗體18B6浸入固定在 探針表面的不同的RHD5濃度中。測定締合和解離常數
Ka(M-IS-I) = 4. 26xl03Kd(S-I) = 1. 45xl(T5Kd :Μ. 3. 4xl(T95.抗獨特型抗體18Β6亞類的表徵為了確定抗體18Β6的子集，使用Roche的IsoStrip系統(比色條帶)。抗體18B6 被鑑定為IgGl Kappa。VIII.抗體18B6的序列為了進行測序，使用 Quick Prep Micro ARNm 純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suede)分離產生抗獨特型抗體18B6的雜交瘤的ARNm。使用第一鏈ADNc 合成試劑盒(AmershamPharmacia Biotech)合成ADNc。編碼重鏈(VH)和輕鏈(VL)的ADNc 使用與小鼠中潛在存在的不同基因家族相應的特異性引物通過PCR(聚合酶鏈式反應)來 擴增。通過QIA quick Gel提取試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)從1.5%的瓊脂糖凝膠 分離PCR產物，用pGEM-T Easy載體系統(Promega, Madison, WI)克隆。陽性菌落的質粒 ADNfflil High PurePlasmid ^^i^^O^ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)分離』 M Seqenase (US Biochemical, Cleveland, OH)雙向jftiil·。IX. 18B6抗體的特別的件質抗體1886完全地抑制1^05抗體結合它的抗原，因子￥111。RHD5抗體帶有與18B6 的互補的獨特型。抗體與抗原的結合涉及與多個胺基酸相應的6到12個埃2 (angstriims2)的相互 識別的對接，其通過氫鍵、疏水性或極性引力和範德華(VanderWals)橋相互締合。在功能水平上，當抗體完全地抑制抗體與抗原的結合時，這意味著抑制性抗體帶 有抗原的「內部圖像」，也就是說，模擬抗原的3-D結構的三維結構。雖然18B6抗體的一級結構(胺基酸序列)顯示了與因子VIII的Cl結構域的低 同一性，18B6抗體的二級結構與FVIII的Cl結構域的二級結構的比較、RHD5抗體的抗原性 目標、18B6的三維建模表明，通過與Cl結構域的3-D結果重疊，18B6的輕鏈(VL)的可變部 分呈現了 Cl結構域的內部圖像。這種觀察賦予了 18B6抗體特別的、新的和不可預見的性質。換句話說，通過用抗 體例如RHD5的免疫產生類似於18B6的抗體的任何努力事實上沒有產生與18B6相同的抗 體。
權利要求
針對因子VIII人類抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述抑制性抗體針對因子VIII的C1結構域，其特徵在於所述抗體的每條輕鏈的至少一個CDR區域(互補決定區)含有與選自序列SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14的序列具有至少70％同一性的肽序列，以及其中所述抗體的每條重鏈的至少一個CDR區域具有與選自序列SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11的序列具有至少70％同一性的肽序列。
2.根據權利要求1的抗體，其特徵在於所述抗體的每條輕鏈的每個CDR區域含有分別 與序列SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13和SEQID NO :14具有至少70%同一性的肽序列，以及 其中所述抗體的每條重鏈的每個⑶R區域具有分別與序列SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10和 SEQ ID NO 11具有至少70%同一性的肽序列。
3.根據權利要求1或2的任一項的抗體，其特徵在於所述抗體的每條輕鏈的可變區由 與核酸序列SEQ ID NO :16具有至少70%同一性的核酸序列編碼，以及其中所述抗體的每 條重鏈的可變區由與核酸序列SEQ ID NO :15具有至少70%同一性的核酸序列編碼。
4.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於所述抗體的每條輕鏈的可變區由核 酸序列SEQ ID NO: 16編碼，以及其特徵在於所述抗體的每條重鏈的可變區由核酸序列SEQ ID NO 15 編碼。
5.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於其每條輕鏈的可變區的肽序列是具 有與序列SEQ ID NO :18至少70%的同一性的序列，以及其每條重鏈的可變區的肽序列是 具有與序列SEQ ID NO 17的至少70%的同一性的序列。
6.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於從序列SEQIDNO :16推出的肽序列 是序列SEQ ID NO :18，以及其特徵在於從序列SEQ ID NO 15推出的肽序列是序列SEQ ID NO :17ο
7.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於所述抑制性抗體是抗體RHD5(以編 號LMBP 6165CB保藏在保藏所BCCM/LMBP)。
8.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於所述抗獨特型抗體是小鼠抗體。
9.根據權利要求8的抗體，其特徵在於所述抗獨特型抗體是IgGlkappa。
10.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於所述抗體是嵌合抗體。
11.根據權利要求10的抗體，其特徵在於所述抗體是人類雜交抗體。
12.根據權利要求1到9的任一項的抗體，其特徵在於所述抗體是人源化的抗體。
13.根據前述權利要求的任一項的抗體，其特徵在於它為F(ab')2片段、Fab'片段、 Fab片段、CDR區域和這些片段或區域的任一個的任何修飾的形式。
14.根據前述權利要求1到9的任一項的抗體，其特徵在於它能夠由以登記號碼CNCM 1-3559保藏在微生物培養物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6產生。
15.產生根據權利要求1到13的任一項的抗體的穩定細胞系。
16.根據權利要求15的穩定細胞系，選自由SP2/0、YB2/0、IR983F、人類骨髓瘤 Namalwa,PERC6、細胞系 CH0，特別是CH0-K-1、CHO-Lec 10、CHO-Lec 1、CHO-Lec 13、CHO Pro-5、 CHOdhfr-, Wil_2、Jurkat, Vero, Molt-4、C0S-7、293_HEK、BHK, K6H6、NSO, SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 構成的組。
17.以登記號碼CNCM1-3559保藏在微生物培養物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6。
18.—種針對因子VIII人類抑制性抗體的單克隆抗獨特型抗體，所述抑制性抗體針對由以登記號碼CNCM 1-3559保藏在微生物培養物國家保藏所(CNCM)的雜交瘤18B6產生的 因子VIII的Cl結構域。
19.具有序列SEQID NO 15的ADN片段，所述序列SEQ ID NO 15編碼根據權利要求 1到14的任一項的抗體的重鏈可變區。
20.具有序列SEQID NO 16的ADN片段，所述序列SEQ ID NO 16編碼根據權利要求 1到14的任一項的抗體的輕鏈可變區。
21.藥物組合物，包含根據權利要求1到14的任一項的抗體，和至少一種賦形劑和/或 至少一種藥學上可接受的載體。
22.根據權利要求21的組合物，特徵在於它包含針對抗FVIII抗體的至少一種抗獨特 型抗體，所述抗FVIII抗體針對因子VIII的不同於Cl結構域的結構域。
23.根據權利要求21或22的任一項的組合物，特徵在於它包含針對抗FVIII抗體和/ 或針對因子VIII的A2結構域的抗體的抗獨特型抗體，所述抗FVIII抗體針對因子VIII的 C2結構域。
24.根據權利要求1到14的任一項的抗體的用途，用於製造藥物。
25.根據權利要求1到14的任一項的抗體的用途，用於製造用於治療A型血友病的藥物。
26.根據權利要求25的用途，其中所述A型血友病是具有抑制物的血友病。
27.根據權利要求1到14的任一項的抗體的用途，用於體外中和針對因子VIII的Cl 結構域的抑制性抗體的抑制活性。
28.根據權利要求1到14的任一項的抗體的用途，用於因子VIII抑制性抗體的體外檢 測和/或純化。
29.一種包含根據權利要求1到14的任一項的抗體的藥物。
全文摘要
本發明涉及針對結合因子VIII的C1結構域的因子VIII抑制性抗體的抗獨特型單克隆抗體，還涉及產生這種抗獨特型單克隆抗體的細胞系，涉及所述抗獨特型單克隆抗體作為藥物的用途，以及更特別地涉及它用於製造用於治療血友病A的藥物的用途。
文檔編號C12N15/13GK101883793SQ200780101219
公開日2010年11月10日 申請日期2007年8月23日 優先權日2007年8月23日
發明者C·貝倫斯, J·-G·吉爾斯, J·-M·聖-雷米, M·G·傑奎明 申請人:Lfb生物科技公司