冬蟲夏草的鑑別及檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-04-30 03:23:36 1

專利名稱：冬蟲夏草的鑑別及檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種定性及定量檢測冬蟲夏草的方法以及用於該方法的試劑盒。
背景技術：
冬蟲夏草是麥角菌科中華蟲草菌(Cordyc印s sinensis (Berk.) Saccardo (1878)) 寄生在鱗翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾屬(Hepialus)昆蟲幼蟲體產生的子座及幼蟲屍體的複合 體。在中藥材市場上，利用其人工發酵培養的無性型菌絲體以及與冬蟲夏草形態相似的近 緣種(如亞香棒蟲草(又名霍克斯蟲草)C.hawkesii Gray、戴氏蟲草C. taii Z.Q.Liang & A. Y. Liu、古尼蟲草 C. gunnii (Berk.)Berk.、涼山蟲草 C. Iiangshanensis Zhang & Liu)等 假冒偽劣品充斥市場，甚至出現地蠶、白僵蠶、壓模「蟲草」等偽劣產品，造成冬蟲夏草藥材 及其加工成藥市場混亂，嚴重損害消費者、產地及加工企業的利益。另一方面，全世界目前已報導發現由蟲草屬真菌(Cordyc印s)寄生於昆蟲、蜘 蛛和其他生物長出子實體的蟲草種類達400多種，其中我國已記錄68種。在國內外一 些人和學者的概念中，把凡是由蟲草屬真菌寄生並能產生子實體的菌物結合體都通稱為 冬蟲夏草。然而，中國傳統的中醫藥學和我國絕大部分學者和人們所指的冬蟲夏草，是 特指僅分布於我國青藏高原及邊緣地區高寒草甸中的、具有特殊藥用功效的中華蟲草菌 (C. sinensis)，其他類群僅稱為蟲草，不是正宗的冬蟲夏草。為解決上述問題，2000年11月12日公開的中國專利申請公開第CN 1274010號公 開了一種鑑別冬蟲夏草的特徵性核苷酸序列和方法，該發明以冬蟲夏草rDNA及其間隔區 (非編碼區)特異性序列為鑑別特徵，並以此為基礎設計專一性擴增鑑定引物，建立以普通 PCR為技術基礎的鑑定方法。然而，該方法具有以下局限性(1)通過PCR擴增之後，必須進 一步經過DNA測序(需要2-3天)，或者經過凝膠電泳(1.5小時左右)才能判別結果，不能 在PCR擴增的同時即能實現結果的判斷，因此，檢測速度和效率上受到一定的制約；(2)該 方法是一種定性的檢測方法，即只能檢測冬蟲夏草「有」還是「無」，不能在技術上進一步定 量檢測其含量；(3)由於冬蟲夏草rDNA的間隔區序列較短並且引物設計困難，普通PCR擴 增鑑定序列長度一般在300bp左右，對於以冬蟲夏草為原料的加工處理過的產品，其核酸 可能嚴重降解至300bp以下，此時，採用普通PCR技術無法實現DNA鏈的擴增，導致檢測結 果不準確；(4)該方法需對常規PCR產物進一步實施凝膠電泳，其過程涉及核酸染料等有毒 物質的操作工序，容易造成汙染，對人體具有一定的危害性。現實需求表明，在冬蟲夏草流通和加工過程中，迫切需要建立快速、準確地既能鑑 別冬蟲夏草真偽，又能明確其含量的分子鑑定技術，這對於對保障消費者利益，保護我國傳 統中藥材的產權利益並促進其市場化發展具有至關重要的意義。

發明內容
本發明的目的是解決現有技術中存在的問題，提供一種能快速、準確地鑑別和檢 測冬蟲夏草的方法、以及鑑別和檢測冬蟲夏草用的試劑盒。
為實現上述本發明的目的，一方面，本發明提供了一種冬蟲夏草的鑑別和檢測方 法，該非法包括如下步驟(a)從待測樣品中提取出核糖體DNA ；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引 物對和SEQ ID NO. 3所示的探針進行實時螢光PCR反應，得到擴增產物；(C)根據擴增產物的螢光的有無和強度來判斷是否為冬蟲夏草及其含量。在上述本發明的方法中，其所採用的用於實時螢光PCR擴增的引物對及探針序列 如下所示SEQ ID NO. 1 (正義引物)5，-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3，SEQ ID NO. 2 (反義引物)5，-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3，SEQ ID NO. 3 (螢光探針)5』 -Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3，上述引物可在冬蟲夏草核糖體DNA上特異性地擴增出SObp的產物，利用上述探針 可判斷待測樣品的真偽以及檢測樣品中冬蟲夏草的含量。在本發明的一個實施方式中，步驟(a)中提取出的核糖體DNA的濃度至少為 0. OOOlng/μ L·在本發明的一個實施方式中，所述引物對位於核糖體DNA的18S rDNA和 5.8S rDNA之間的間隔區內。在本發明的一個實施方式中，步驟(b)中得到的擴增產物的核 苷酸長度為80bp。利用本發明提供的引物對擴增出的核苷酸序列來源於冬蟲夏草的rDNA間隔區 (即冬蟲夏草核糖體rRNA基因轉錄間隔區)序列。研究表明冬蟲夏草在rDNA間隔區(非編 碼區)具有與其它蟲草和相關真菌完全不同的核苷酸序列，可以作為冬蟲夏草特徵性標記 序列，用於鑑別冬蟲夏草的真偽。依據該核苷酸標記序列可以設計並製備出冬蟲夏草rDNA 間隔區的專一性核酸分子引物和探針，從而建立起快速、準確鑑別冬蟲夏草的實時螢光檢 測方法。本發明提供的冬蟲夏草專一性核酸分子探針，具有極高的冬蟲夏草專一性，只能 與正宗冬蟲夏草種C. sinensis產生專一性標記反應，而不與其它蟲草或相關真菌的DNA產 生螢光指示反應。其螢光信號的強弱可以反應被測本底冬蟲夏草的含量。因此，利用本發 明提供的核酸螢光探針，通過實時螢光PCR不但可以快速、準確地鑑別冬蟲夏草的真偽，而 且可以定量檢測冬蟲夏草的含量。另一方面，為實現上述本發明的目的，本發明還提供了一種鑑別及檢測冬蟲夏草 用的試劑盒，該試劑盒包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的引物對和SEQ ID N0. 3所 示的探針，其中，所採用的引物對及探針序列為SEQ ID NO. 1 (正義引物)5，-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3，SEQ ID NO. 2 (反義引物)5，-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3，SEQ ID NO. 3 (螢光探針)5』 -Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3，本發明提供的鑑別及檢測方法具有如下優點(1)在冬蟲夏草的基因鑑別過程 中，所需樣品量少，通過PCR擴增即能評判其真偽，毋需進一步凝膠電泳，比現有技術更簡 便、快捷；( 本發明除了能定性鑑別冬蟲夏草的真偽外，還能檢測樣品中冬蟲夏草的含量，其檢測限量可低至0. OOOlng/μ 1,比現有技術更加靈敏；(3)本發明能有效檢測冬蟲夏 草加工後核酸降解嚴重的樣品，檢測結果比現有技術更加準確有效；(4)本發明由於未涉 及使用凝膠電泳工序，比現有鑑別技術更環保安全。下面結合附圖，通過具體實施方式
來進一步詳細描述本發明，但本發明不局限於 這些實施方式，任何在本發明基本精神上的改進或替代，仍屬於本發明權利要求書中所要 求保護的範圍。


圖1顯示利用本發明的引物對和探針對天然冬蟲夏草樣本和非冬蟲夏草樣本的 實時螢光PCR的擴增結果；圖2顯示利用本發明的引物對和探針對不同濃度梯度的天然冬蟲夏草核糖體DNA 模板的實時螢光PCR的擴增結果。
具體實施例方式ι.鮮^[商白·尉牛牛「曾試驗步驟採用本領域技術人員熟知的方法分別提取天然冬蟲夏草(本實驗中 使用從西藏林芝地區不同鄉鎮採集的7個天然冬蟲夏草樣品)、蛹蟲草、古尼蟲草、雲南 蟲草1和2(c0rdyc印s spp.)的核糖體DNA(rDNA)，再以本發明提供的引物對及螢光探 針(正義引物為 SEQ ID NO. 1 :5』 -CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3，、反義引物為 SEQ ID NO. 2 5，-AACTGCTGTGGTGTTC C-3，、螢光探針為 SEQ ID NO. 3 :5，-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYA CCACT-Tamra-3')進行實時螢光PCR，得到如圖1所示的結果圖。1.待測樣品核糖體DNA的提取作為舉例，本發明提取核糖體DNA的方法如下採用!Iomega試劑盒(貨號 A1120)，按照說明書，取一段雙蒸水洗淨的蟲草子實體，幹樣5-10mg，鮮樣10_30mg置於 1. 5ml離心管中，加100 μ 1核酸裂解液用研杵棒將蟲草組織磨碎，補加500 μ 1核酸裂解液， 振蕩1-3秒鐘混勻，置65°C水浴中溫浴40-90分鐘；溫浴後往離心管中加入3 μ 1 RNA酶顛 倒離心管2-5次，然後置37°C水浴上15-30分鐘；溫浴後取出離心管加入200 μ 1蛋白質沉 澱液，劇烈振蕩20秒，13800rpm離心5分鐘；離心後小心吸取上清液(約600 μ 1)置於一 只乾淨1. 5ml離心管中，加等量異丙醇輕輕顛倒3-5次，置-20°C冰箱中放置40分鐘；然後 取出離心5分鐘，棄上清液，保留管底沉澱，再加600 μ 1 70%乙醇輕輕顛倒幾次後，離心1 分鐘，棄上清液，用乾淨吸水紙巾吸乾流出的殘留液；將離心管真空乾燥15分鐘；乾燥後的 離心管往管底加入50 μ 1 TE (4號液)，置65°C水浴40分鐘充分溶解管底DNA，室溫下測定 DNA含量。純化後的DNA溶液稀釋為IOOng/ μ 1，作為PCR工作液濃度。2.實時螢光PCR反應體系的建立及反應條件(1)反應體系採用大連寶生物(TaKaRa Ex Taq)提供的試劑，按下表建立反應體 系
權利要求
1.一種冬蟲夏草的鑑別及檢測方法，其包括以下步驟(a)從待測樣品中提取出核糖體DNA;(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物對 和SEQ ID NO. 3所示的探針進行實時螢光PCR反應，得到擴增產物；(c)根據擴增產物的螢光的有無和強度來判斷是否為冬蟲夏草及其含量。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中提取出的核糖體DNA的濃度至少 為 0.OOOlng/μ 1。
3 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述引物對位於核糖體DNA的18SrDNA和 5. 8S rDNA之間的間隔區內。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(b)中得到的擴增產物的核苷酸長度為 80bpo
5.一種用於冬蟲夏草鑑別及檢測的試劑盒，其包括SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0.2所示的 引物對和SEQ ID NO. 3所示的探針。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒進一步包括ExTaq酶和/或 dNTPs。
全文摘要
本發明公開了一種冬蟲夏草的鑑別及檢測方法，其包括以下步驟(a)從待測樣品中提取出核糖體DNA；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物對和SEQ ID NO.3所示的探針進行實時螢光PCR反應，得到擴增產物；(c)根據擴增產物的螢光的有無和強度來判斷是否為冬蟲夏草及其含量。本發明另一方面提供包括所述引物對和探針的試劑盒。本發明除了能定性鑑別冬蟲夏草的真偽外，還能檢測樣品中冬蟲夏草的含量，其檢測限量可低至0.0001ng/μl，比現有技術更加靈敏，並且本發明能有效檢測冬蟲夏草加工後核酸降解嚴重的樣品，檢測結果比現有技術更加準確有效。
文檔編號C12Q1/06GK102086471SQ20091021361
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月7日 優先權日2009年12月7日
發明者劉海軍, 區衛民, 張雋, 胡學難, 謝力, 鍾國強, 陳源樹, 顧渝娟, 馬駿, 高東微, 高軍 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 廣州市振燁生物科技有限公司