優化的脫氮假單胞菌發酵生產維生素b12方法與合成培養基的製作方法

2023-04-30 02:14:31

專利名稱：：優化的脫氮假單胞菌發酵生產維生素b12方法與合成培養基的製作方法
技術領域：
：本發明涉及發酵領域，更具體地涉及一種優化的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B12方法以及相關的合成培養基。
背景技術：
：維生素B^是一種結構非常複雜的分子，根據與其中心鈷離子結合配基基團的不同可形成羥鈷胺素、甲基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和氰鈷胺素[1]。維生素B12的化學結構如圖9所示。維生素B12是一種生物催化活性物質，是哺乳動物不可缺少的維生素，能夠預防和治療惡性貧血症，維護神經系統的健康，促進碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝[2];現在國內和國外商品化的維生素B^幾乎都是通過微生物發酵來生產的。能夠合成維生素B^的微生物根據其耗氧情況分為兩類(l)厭氧菌或間性厭氧菌如費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)[3]、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)[4]和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuri咖)等。(2)好氧菌比如脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)[5]，鈷胺素根瘤菌[6](Rhizobiumcobalaminoge皿mFERMBP-4429)等。在這些微生物進行發酵生產時一般都是以麥芽糖、玉米漿和糖蜜為主要原料，未見有在合成培養基中研究維生素B12發酵的報導。為了能夠最大限度的提高生產菌的合成能力，降低發酵生產成本，就必須從代謝工程的角度來研究菌種在不同條件下的物質流走向，來優化代謝網絡，使更多的底物流向產物的合成[7]。為了能夠對菌體的代謝網絡模型了解和分析的更清楚,C同位素標記試驗來用於微生物代謝通量的研究日趨成熟，能夠更準確地分析代謝通量的分布[8]。而這種開展同位素示蹤標記試驗就必須要求人們對培養基中的碳源和氮源要特別清楚，只有這樣才能減少外圍碳氮源對代謝同位素分布豐度的影響，減少實驗誤差。目前，維生素B12需求量較大，因此提高維生素B12的表達水平成為當務之急，本領域迫切需要開發高效的生產維生素B12的方法，尤其是能夠在使用合成培養基下大幅度提高維生素B12的方法。
發明內容本發明的目的就是提供一種高效的生產維生素B12的方法。本發明的另一目的是提供可用於本發明高效的生產維生素B12的方法的合成培養基。在本發明的第一方面，提供了一種生產維生素B12的方法，它包括步驟(a)在適合發酵的且鉀離子濃度為0.7-1.3g/L發酵液的條件下下，培養生產維生素B12的工程菌，從而產生維生素B12，其中所述的鉀離子濃度以氯化鉀計；禾口(b)從發酵液中分離純化出維生素B12。在另一優選例中，在步驟(a)中，按氯化鉀計，鉀離子的濃度為0.8-1.lg/L，更佳地0.9-1.05g/L。在另一優選例中，在步驟(a)中還包括控制培養基中葡萄糖濃度，使得葡萄糖濃度為60-90g/L培養基。在另一優選例中，葡萄糖的濃度為65-80g/L，更佳地70-75g/L。在另一優選例中，在步驟(a)中還包括控制磷酸氫二銨的濃度，使得磷酸氫二銨濃度為4.0-8.Og/L發酵液。在另一優選例中，磷酸氫二銨的濃度為5.0-7.Og/L，更佳地5.5_6.Og/L。在另一優選例中，在步驟(a)中，還包括-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計算)葡萄糖重量比為(0.71.3):(6090);或-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計算)磷酸氫二銨二者的重量比宜為(0.71.3):(4.08.0);或-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計)葡萄糖磷酸氫二銨三者的重量比為(0.71.3):(6090):(4.08.0)。在另一優選例中，所述的工程菌是費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或鈷胺素根瘤菌。一種優選的工程菌是脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)。在本發明的第二方面，提供了一種可用於本發明上述方法的培養基，所述的培養基中鉀離子(按氯化鉀計)葡萄糖磷酸氫二銨三者的重量比為(o.7i.3):(6090):(4.08.0)。在另一優選例中，所述的培養基的重量配方如下葡萄糖71.2±10%;甜菜鹼9.7±2%;磷酸氫二銨5.6±1%;硫酸銨5.9±1%;尿素1.97±0.5%;硫酸鎂1.38±0.1%;氯化鉀0.97±0.1%;DMBI(5，6-二甲基苯並咪唑):0.077±0.007%;硫酸亞鐵0.030±0.01%;氯化鈷0.025±0.01%;鉬酸鈉0.020±0.01%;和硫酸鋅0.020±0.01%。在本發明的第三方面，還提供了可溶性無機鉀鹽(包括氯化鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鉀、硫酸鉀)等的用途，它們被用作發酵生產維生素B12的促進劑。應理解，上述的以及本文下文中所詳述的任二個或多個技術特徵都可相互組合，以構成新的技術方案。在此申請中，為了節省篇幅，不再一一列出。圖1當葡萄糖濃度為70g/L時，磷酸氫二銨和氯化鉀含量的變化對VB12效價影響的曲曲面圖。圖2當磷酸氫二銨濃度為4g/L時，葡萄糖和氯化鉀含量的變化對VB12效價影響的曲曲面圖。圖3當氯化鉀濃度為0.7g/L時，葡萄糖和磷酸氫二銨含量的變化對VB12效價影響的曲曲面圖。圖4顯示了在5L罐中的發酵過程參數相關變化曲線。圖5顯示了發酵過程的菌體形態(19小時)。圖6顯示了發酵過程的菌體形態(39小時)。圖7顯示了發酵過程的菌體形態(76小時)。圖8顯示了發酵過程的菌體形態(110小時)。具體實施例方式本發明人通過深入而廣泛的研究，意外地發現在維生素B12的發酵生產過程中，通過控制鉀離子濃度，可以大幅提高維生素B12的產量。在此基礎上完成了本發明。適用於本發明方法的表達維生素B12的菌株沒有特別限制，可以是現有的生產維生素B12的工程菌，也可用常規方法改造或誘變的工程菌。代表性的工程菌包括(但並不限於)厭氧菌或間性厭氧菌如費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、話:[氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)禾口鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium);以及好氧的脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，鈷胺素根瘤菌[6](Rhizobiumcobalaminoge皿mFERMBP-4429)等。一種優選的工程菌是脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)。在獲得了表達維生素B12的工程菌後，便可在常規的適合表達維生素B12的條件下培養，以表達維生素B12。鉀離子濃度在本發明中，通過控制發酵過程中的鉀離子濃度，便可大幅提高維生素B12的產在本發明中，鉀離子可以來自鉀鹽，例如KC1，K^(V乙酸鉀等鉀鹽，還可來自其他含鉀離子的物質，或它們的混合物。一種優選的鉀鹽是氯化鉀。在本發明方法中，按氯化鉀濃度計，將鉀離子的濃度控制在0.7-1.3g/L，較佳地0.8-1.lg/L，更佳地0.9-1.05g/L。或者，將氯化鉀的用量換算成mM濃度，則鉀離子的濃度通常為約9-18mM(如9.39-17.4頓)或更高，較佳地為約10-15mM(如10.73-14.75mM)，更佳地為約12-14mM(如12.07-14.08mM)。葡萄糖濃度在另一優選實施例中，本發明人還在發酵生產過程中，通過控制葡萄糖濃度，從而進一步提高維生素B12的產量。在本發明方法中，通常，葡萄糖濃度可控制在60-90g/L，較佳地65-80g/L，更佳地70-75g/L。在優選例中，在發酵過程中，鉀離子濃度(按氯化鉀計算)葡萄糖重量比宜為(0.71.3):(6090)，較佳地為(0.81.1):(6580)，更佳地為(0.91.05):(70-75)或為1.21.4:100。磷酸氫二銨濃度在另一優選實施例中，本發明人還在發酵過程中或在發酵培養基中，通過控制磷酸氫二銨的濃度，從而進一步提高維生素B12的產量。磷酸氫二銨濃度控制在4.0-8.0g/L，較佳地5.0_7.0g/L，更佳地5.5_6.0g/L。在優選例中，在發酵過程中，鉀離子濃度(按氯化鉀計算)磷酸氫二銨二者的重量比宜為(0.71.3):(4.08.O)，較佳地為(0.81.1):(5.07.O)，更佳地為(0.91.05):(5.56.0)或為(0.160.17):1。在本發明的優選例中，在發酵過程中，鉀離子濃度(按氯化鉀計算)葡萄糖磷酸氫二銨三者的重量比宜為(0.71.3):(6090):(4.08.0)，較佳地為(0.81.1):(6580):(5.07.0)，更佳地為(0.91.05):(7075):(5.56.0)或為(0.160.17):(11.512.5):1。培養基用於本發明的培養基沒有特別限制，可以是各種常規的培養基。例如對於脫氮假單胞菌而已，可以選用(但並不限於)培養基l(g/U:蔗糖80，玉米漿45，甜菜鹼14，(NH4)2S04l，CoCL*6H200.075，MgO0.5，DMBIO.05，ZnS047H200.08，CaC03l，pH7.2—7.4;培養基2(g/L):葡萄糖55g，玉米漿35g(乾物)，硫酸銨5g，磷酸二氫鈉8g，氯化鑽0.Olg，調pH6.8-7.0;或低鹽發酵培養基等。當然，為了用於本發明的發酵方法，應當在培養基中添加一定濃度的鉀鹽，以便使得使用時鉀離子的濃度處於合適的範圍。當然，也可使用一般的培養基，然後在發酵過程中添加或補加鉀離子源，從而將發酵體系中的鉀離子濃度控制在合適的範圍。另外，還在培養基中添加一定濃度的葡萄糖和/或磷酸氫二銨，以便使得使用時葡萄糖和/或磷酸氫二銨的濃度處於合適的範圍。當然，也可使用一般的培養基，然後在發酵過程中補加或添加葡萄糖和/或磷酸氫二銨，從而將發酵體系中的葡萄糖和/或磷酸氫二銨濃度控制在合適的範圍。—種特別優選的培養基是全合成的培養基，其乾重配比的培養基組分及含量(%)如下tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7在本發明中，對於發酵生產的維生素B12，可以用常規方法進行純化，隨後製成藥劑。一種優選方法是對發酵樣品用常規方法酸化後進行離心、過濾等方式去除菌體，獲得含維生素B12的發酵清液。然後，對發酵清液通過鹽析、超濾等方法進行初步純化後再進行層析純化，也可直接進行離子層析純化。在本發明的一個實例中，通過用Plackett-Burman(P-B)試驗設計對培養基中相關影響因素進行篩選，得到葡萄糖、磷酸氫二銨和氯化鉀為顯著影響因子，並通過CentralCompositeDesign(CCD)響應面分析確定了主要影響因素的最佳濃度。在優化的培養基中，維生素B12產量達到64.6mg/L，菌濃達到了29g幹菌體每升發酵液，在5L發酵罐中進行pH自動控制發酵試驗，VB12發酵產量大幅度提高了300%以上，達77mg/L。本發明的主要優點在於(a)通過簡單有效的控制方法(控制鉀離子濃度)，極其有效地提高維生素B12的(b)建立了用於維生素B12發酵生產的全合成培養基，有利於發酵液中維生素B12的提取，降低提取成本。(c)建立的合成培養基能夠很好的用於13C同位素標記研究維生素B12合成代謝流通量，更好地指導生產控制工藝。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例11材料與方法1.1菌種和培養基菌種脫氮假單胞菌(購自石家莊華榮製藥集團)種子培養基(g/L):葡萄糖20.O，硫酸銨8.0，MgS047H201.5，KC10.2，微量元素混合液I10ml/100ml，pH7.0。葡萄糖液單獨滅菌後加到發酵培養基中。微量元素混液I(g/L):FeS047H200.03，CoCl26H200.016，MnS04H200.02Na2Mo042H200.02，ZnS046H200.02初始發酵合成培養基組成(g/L):葡萄糖30.0，甜菜鹼10.0，(NH4)2HP042.0，硫酸銨4.0，尿素2.0，MgS047H201.0，KC10.2，DMBIO.025，微量元素混合液II:三10ml/100ml，pH7.0。葡萄糖液單獨滅菌後加到發酵培養基中。微量元素混合液II(g/L):FeS047H200.03，CoCl26H200.016，Na2Mo042H200.02，ZnS046H200.02補料培養基甜菜鹼30g/l，氯化鈷0.3g/l，DMBI0.3g/l，葡萄糖50g/lpH6.2-6.5，葡萄糖液單獨滅菌後與其它補料溶液混合。1.2試劑和儀器試劑玉米漿(華北製藥康欣有限公司)，甜菜鹼(華榮製藥有限公司)，葡萄糖(上海糖業有限公司)，其他試劑均為國產分析純。儀器722型紫外一可見分光光度計；HPLC1100(Agilent公司)；5L發酵罐上海國強生化裝備有限責任公司；發酵控制系統國佳生化工程中心NCBbiostar發酵控制系統。旋轉式搖床1.3培養方法菌懸液製備用無菌水洗滌培養了48-54小時的斜面，稀釋成菌濃為108個細胞每毫升的菌懸液。母瓶種子培養將制好的菌懸液接種2ml到母瓶培養基中，裝量100ml/500ml，培養溫度32。C，轉速260rpm，培養18-22小時，菌濃在700nm下的OD值為9-11之間。發酵培養將培養好的母瓶種子接種5ml到裝有100ml培養基的500ml無菌發酵搖瓶中，培養溫度32°C，轉速260rpm，每隔20小時取樣測定並用NaOH調節pH到7.2左右，72小時和96小時分別補加補料培養基3.5ml和3.Oml，144小時放瓶。5L發酵罐培養將培養好後鏡檢無菌的母瓶種子液100ml火焰保護接種到裝有2.5L培養基的發酵罐中，32t:，通氣量2.5L/min，發酵過程中根據菌體生長情況當殘糖濃度為20g/L時開始連續補加葡萄糖並維持在這個糖濃度，菌濃在700nm下的OD達到30以上時開始補加甜菜鹼料液培養基，PH用氫氧化鈉進行流加自控在6.8-7.0之間。1.4測定方法總糖和還原糖測定採用改進了的DNS法。生物量(DCW)測定取發酵液25ml，4000rpm離心15分鐘，將菌體沉澱用超純水洗滌並加稀鹽酸除去沉澱的碳酸鈣，離心後將菌體洗滌2次後，於115度烘箱內烤乾稱重，計算菌體含量。銨離子測定利用苯酚一次氯酸鹽反應測定[9]維生素B12含量測定[5]:將發酵液用亞硝酸鈉溶液和冰醋酸水解後用氰化鈉溶液進行氰化，使發酵液中不同形式的維生素B12轉化為氰鈷胺素，用高壓液相譜進行含量分析，高效液相色譜條件流動相為250mmol/L磷酸水溶液-乙腈(30:70，v/v);色譜柱為大連依利特HypersilNH2柱(4.6mmX250mm，5iim);檢測波長為361nm;進樣量是20iiL;流速為1.7mL/min。pH在線測定採用MettlerToledo耐高溫電機進行在線測定。溶氧測定採用MettlerToledo耐高溫電機進行在線測定。8P-B試驗設計為了建立鈷胺素根瘤菌發酵生產維生素B12的最佳全合成培養基，以葡萄糖為唯一碳源，選用無機銨鹽作為氮源，考察合成培養基中更多因素對發酵菌濃和B12發酵的影響。鑑於合成培養基發酵過程中產生大量酸性物質使得發酵液pH值較低，影響了菌的生長和產物合成，加入了磷酸氫二鈉緩衝鹽，來對發酵過程的pH進行適當的穩定調節。在P-B試驗設計中，選擇的因素為八個，分別是葡萄糖(Xl)、氯化鉀(X2)、磷酸氫二鈉(X3)、硫酸鎂(X4)、尿素(X5)、硫酸銨(X6)、磷酸氫二銨(X7)、微量元素(X8)，每個因素的水平均為三個(-l，O，l)。試驗結果分別以菌體濃度和VB12的產量為響應值，利用SAS統計軟體進行統計分析。試驗因素和水平設計如表1所示。表1P-B試驗設計各因素變量和水平表單位(g/L)tableseeoriginaldocumentpage9中心組合試驗設計根據P-B因子篩選試驗的結果所確定的顯著性因素，用中心組合響應面設計進一步優化其最適添加水平。對中心組合響應面試驗結果運用SAS和Design-E鄧ert軟體進行統計分析，分別以菌濃和VB12發酵單位為響應值，應用二多項式方程對試驗結果進行響應面回歸分析。r=&++hp〃《2+2x不AY是預測相應值，Xi是自變量，Pi為自變量一次性係數，Pii為變量的平方相係數，Pu為自變量交叉相乘積的係數，Xu為兩個自變量的交叉乘積。2結果與討論2.1P-B試驗因素考察根據P-B試驗設計，對選擇的八個因素葡萄糖、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸氫二銨、尿素、磷酸氫二鈉、硫酸銨、微量元素，進行考察，每組安排3個平行，其結果為三個平行的平均值。得到的試驗結果見表2。表2Plackett-Burman設計得到的各因素對菌體生長和VB12發酵合成的結果tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10通過SAS軟體對P-B試驗結果進行統計分析，以不同時間發酵液中菌濃、Vbl2的含量為響應值，分別建立模型分析各個因素對Vbl2產量的影響，分析結果見表3。表3模型相關度擬合分析結果tableseeoriginaldocumentpage11從表3可以看出，分別以菌濃和Vbl2產量為指標的模型擬和度都較好，相關度都達到95%以上，所以參考這兩個模型考察其中各個因素的不同影響，包括顯著性與否、正相關還是負相關。表4各參數對發酵菌濃和VB12合成的模型參數估計tableseeoriginaldocumentpage11由表4結果可知，以菌體和發酵液效價為響應值的模型參數分析結果是一致的，而且模型的擬和參數幾乎完全相同因素的影響顯著順序為XI>X7>X2>X3>X6>X5>X4>X8;葡萄糖、磷酸氫二銨和氯化鉀影響是最為顯著的。葡萄糖與Vbl2產量、菌濃是正相關的，磷酸氫二銨與Vbl2產量、菌濃是負相關的；氯化鉀與Vbl2產量、菌濃是負相關的，磷酸氫二鈉與Vbl2產量、菌濃是正相關的，可能較多的磷酸氫二鈉能更好的維持發酵體系的pH值，有利於VB12的合成；硫酸鎂與Vbl2產量、菌濃是正相關的，尿素與Vbl2產量、菌濃是負相關的，硫酸銨與Vbl2產量、菌濃是正相關的，微量元素與Vbl2產量、菌濃是負相關的，對VB12的合成影響最小。對顯著因素葡萄糖、氯化鉀和磷酸氫二銨作進一步的試驗優化，其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值，最佳濃度為(g/U:磷酸氫二鈉3，硫酸鎂1.4，尿素2，硫酸銨6，微量元素混合溶液II為80ml發酵液。實施例2中心組合試驗進一步優化根據P-B因子篩選試驗的結果，確定了合成培養基中的三個顯著性因素——葡萄糖、氯化鉀和磷酸氫二銨。在此基礎上，本實施例通過中心組合試驗進一步來考察這三個因素的最適添加水平，試驗設計水平表選取和安排如表5和表6所示。表5試驗因素設計水平表水平-1.68-l_2_11.6836.450.070.090.0103.60.50.71.01.31.52.64.06.08.09.4表6中心組合設計結果及模型的預測值系列號葡萄糖氯化鉀磷酸氫二銨Vbl2(mg/L)Vbl2預測值(mg/L)1-l_1-l49.550.121-l-l53.353.63-l1-l45.246.6411-l47.348.05-l-1142.442.861-l,148.247.97-11146.547.3811150.050.59—1.680041.940.5葡萄糖氯化鉀磷酸氫二銨12tableseeoriginaldocumentpage13每組三個平行，16-20為中心點水平試驗表7以VB12發酵液效價為響應值的統計分析結果tableseeoriginaldocumentpage13對中心組合響應面試驗結果運用SAS和Design-E鄧ert軟體進行統計分析，從統計分析的結果來看，葡萄糖的影響最為顯著。模型的F值為46.08，LackofFit值為0.5145，較高的F值和不顯著的LackofFit參數(0.5145>0.05)說明所選擇的模型能夠對數據進行很好的擬合，同時模型的Prob值<0.0001和影響不顯著的LackofFit值說明試驗得到的數據結果與模型吻合度較好。方程的回歸分析參數顯示，多元相關係數R2為0.976(—般大於0.75就認為能很好擬合)，矯正R2為0.955可以認為該擬合方法和建立的模型對於效價的統計分析是有效的。通過統計回歸分析，獲得了該多元二次方程表達如下y=63.88+1.66《曙0.27%2-1.23;^-7.27《2-4.091224.17義32[oi23]-0.5^72+JT3+2.03Z2Z3式中XI:葡萄糖、X2:氯化鉀、X3:磷酸氫二銨為了找到發酵生產VB12最大量時三個因素的最優水平，以VB12的效價為響應值Z軸，以其他兩個獨立的因素為橫坐標進行三維響應面分析，保持另一個因素在其最佳值。從圖1、圖2和圖3的響應曲面圖中可以看出，磷酸二氫銨、氯化鉀和葡萄糖這三個關鍵影響因素彼此之間都有很強的交互作用，最佳添加量的點都落在實驗考察的區域內，該試驗設計和方案選取是很成功的。具體而言，從圖13可以看出(a)鉀離子濃度(以氯化鉀計)宜控制在O.7-1.3g/L，較佳地0.8_1.lg/L，更佳地0.9-1.05g/L發酵液；(b)葡萄糖濃度控制在60-90g/L，較佳地65-80g/L，更佳地70_75g/L發酵液。(c)磷酸氫二銨濃度控制在4.0-8.Og/L，較佳地5.0-7.Og/L，更佳地5.5-6.Og/L發酵液。此外，可以對鉀離子濃度、葡萄糖濃度、磷酸氫二銨濃度中的三者或任何二者同時進行控制，即分別將鉀離子濃度、葡萄糖濃度和/或磷酸氫二銨濃度控制在上述的範圍內。—種特別優選葡萄糖、氯化鉀和磷酸氫二銨的濃度分別為72.2±7g/L、0.98±0.lg/L和5.7±0.5g/L;更佳地葡萄糖、氯化鉀和磷酸氫二銨的優選濃度分別為72.2g/L、0.98g/L和5.7g/L。實施例3發酵驗證實驗根據P-B因子篩查試驗和顯著影響因子的繼續考察研究，得到的最優化培養基配方為(g/U:葡萄糖72.2，氯化鉀0.98，磷酸氫二銨5.7，磷酸氫二鈉3，硫酸鎂1.4，尿素2，硫酸銨6，微量元素混合溶液為8ml/100ml發酵液，甜菜鹼10，DMBI0.08消毒前pH值為7.2-7.4。根據以上得到的最優化的培養基濃度配比，進行了3批發酵試驗驗證，每批5個平行，得到的平均維生素B12產量為66.6mg/L，菌濃達到了29g幹菌體每升發酵液，分別比優化前的高出212%和246%，與模型的預測最大值67.2mg/L的維生素B12產量非常接近。這表明，本發明優化方法得到的實驗結果可信度是很高的，建立的全合成發酵培養基能夠很好地用於維生素B12的發酵生產及進一步開展代謝途徑通量的研究。實施例4鉀離子濃度對發酵的影響(驗證實驗)同實施例3，在以配方如下的培養基配方為基礎，其中各組分(g/L):葡萄糖72.2，磷酸氫二銨5.7，磷酸氫二鈉3，硫酸鎂1.4，尿素2，硫酸銨6，微量元素混合溶液為8ml/100ml發酵液，甜菜鹼10，DMBI0.08消毒前pH值為7.2-7.4。不同點在於，在該培養基中添加不同濃度的氯化鉀(表8)。14根據各種鉀離子濃度的培養基濃度，各進行了1批發酵試驗驗證，每批3個平行，結果如表8所示，其中以0.98g/L濃度下的維生素B12產量為100%。表8不同鉀離子濃度對維生素B12產量的影響tableseeoriginaldocumentpage15這表明，本發明通過控制培養基中鉀離子濃度(以氯化鉀計)在0.7-1.3g/L範圍內，非常有利於維生素B12的發酵生產。實施例5在5L發酵罐中合成培養基發酵過程參數優化配製一合成培養基，其乾重配比的培養基組分及含量(％)如下葡萄糖71.2，甜菜鹼9.7，磷酸氫二銨5.6，硫酸銨5.9，尿素1.97，硫酸鎂1.38，氯化鉀0.97，DMBI(5，6二甲基苯並咪唑)0.077，硫酸亞鐵0.030，氯化鈷0.025，鉬酸鈉0.020，硫酸鋅0.020。採用該優化後的合成培養基配方，在5L全自動發酵罐中進行發酵試驗考察，在初始培養基中不再添加匿BI和甜菜鹼，等菌體生長進入穩定期後開始流加，24小時開始流加氨水和lmol/L氫氧化鈉進行pH值自控，以維持銨離子濃度在400-450mg/L，pH值控制在6.8-7.0，33小時開始葡萄糖和甜菜鹼的補加。發酵過程各相關參數的變化如圖4所示。從發酵的過程曲線圖4中可以看出，隨著菌體的生長，溶氧在14小時開始迅速下降，19小時左右，溶氧降到3%，這時不斷提高轉速以增加供氧，轉速從19小時的280轉/min調到21小時的400轉/min，但隨著菌體的不斷增長，溶氧於21小時降到0.5%左右，這時發酵處於氧限制階段，直到發酵後期菌體開始老化，溶氧開始回升。菌體10小時後進入對數增長期，最大比生長速率Um為0.081,30小時菌體生長進入穩定期，開始補加甜菜鹼和葡萄糖，在穩定期維生素B12開始合成，60到110小時之間合成速率最大，110小時後菌體的合成速率減緩，130小時放罐時的維生素B12的含量為77mg/L，比對照提高了305%。從發酵過程的菌體形態觀察中，發現菌體的形態變化很大，19小時的形態(圖5)較短小，染色很深，均一，菌體活力較強，不發生粘連，菌體一般呈現獨立存在。隨著菌體進入穩定期，糖迅速被消耗降到2%以下，溶氧降到最低，這時菌體開始了維生素B12的合成，如圖6所示菌體形態上發生了較大的變化，菌體變長、膨脹產生粘連，並逐漸形成了染色空泡，這個階段的菌體合成速率最大。發酵後期隨著染色空泡的逐漸增多，菌體開始老化生產速率明顯下降(見圖7和圖8)。此外，在發酵過程中，還發現當糖濃度降到2.5g/l和銨離子降到400mg/1以下時，菌體的形態變得異常的膨大，不再呈現短杆狀，染色很淺，不利於維生素B12的合成。討論1通過P-B試驗設計，篩選出了影響維生素B12發酵菌體生長和合成最為顯著的關鍵因素，葡萄糖、磷酸氫二銨和氯化鉀，確定了其它因素的最佳添加水平為磷酸氫二鈉0.15%，硫酸鎂0.14%，尿素0.2%，硫酸銨0.6%，微量元素混合溶液為8ml/100ml發酵液。2通過用中心組合響應面設計對篩選得到的顯著因素的進一步優化，確立了葡萄糖、磷酸氫二銨和氯化鉀的最優化添加濃度，使得在此最佳合成培養基中，VB12的發酵單位達到了64.6mg/L。3在5L的發酵罐中，對得到的最優化合成培養基進行了過程pH值用氨水和NaOH進行自控，維持銨離子濃度為400mg/L，發酵過程中進行糖和甜菜鹼的連續補加，發酵130小時的VB12的發酵單位達到了77mg/L，可見，建立的合成培養基能夠很好的用於VB12的代謝研究和發酵生產試驗，能夠改善生產中VB12發酵液提取工藝，降低提取成本，有非常重要的應用潛力。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。參考文獻[1]J._H.MartensH.BargM.J.WarrenD.JahnMicrobialproductionofvitaminB12A卯lMicrobiolBiotechnol(2002)58:275-285[2]BattersHownaturebuildsthepigmentsoflife:theconquestofvitaminB12.Science264:1551-1557[3]KAZUYUKISH皿ZU，EfficientproductionofvitaminB12frompropionicacidbacteriaunderperiodicvariationofdissolvedoxygencorncentration，JOURNALOFFERMENTATIONANDBIOENGWEERINGVol.82，No.5，484-491.1996[4]A.Quesada-ChantoEffectofoxygensupplyonbiomass，organicacidsandvitaminB12prouctionbyPropionibacteri咖shermaniiWorldJournalofMicrobiology&Biotechnology14，843_846d[5]Kim_TaiLiSi-LiangZhangImprovedlarge-sca]印roductionofvitaminB12byPseudomonasdenitrificanswithbetainefeedingBioresourceTechnology2008[6]Asahi，Satoru(Takatsuki，JP)MethodofproducingvitaminB12usingrhizobiumcobal咖inoge皿mfermBP—4429UnitedStatesPatent5545538July23，1996[7]J.NielsenMetabolicengineeringApplMicrobiolBiotechnol(2001)55:263-283[8]MaciekR.AntoniewiczMetabolicfluxanalysisinanonstationarysystem:Fed_batchfermentationofahighyieldingstrainofE.coliproducing1，3_propanediolMetabolicEngineering9(2007)277-292[9]程先超，劉新泳.5—氟胞嘧啶核苷的合成[J].中國醫藥工業雜誌，2005，36(11):669.權利要求一種生產維生素B12的發酵方法，其特徵在於，它包括步驟(a)在適合發酵且鉀離子濃度為0.7-1.3g/L發酵液的條件下，培養生產維生素B12的工程菌，從而產生維生素B12，其中所述的鉀離子濃度以氯化鉀計；和(b)從發酵液中分離純化出維生素B12。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中，按氯化鉀計，鉀離子的濃度為0.8-1.lg/L，更佳地0.9-1.05g/L。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中還包括控制培養基中葡萄糖濃度，使得葡萄糖濃度為60-90g/L培養基。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，葡萄糖的濃度為65-80g/L，更佳地70-75g/L。5.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中還包括控制磷酸氫二銨的濃度，使得磷酸氫二銨濃度為4.0-8.0g/L發酵液。6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，磷酸氫二銨的濃度為5.0-7.0g/L，更佳地5.5-6.0g/L。7.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中，還包括-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計算)葡萄糖重量比為(0.71.3):(6090);或-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計算)磷酸氫二銨二者的重量比宜為(o.71.3):(4.08.0);或-控制發酵液中鉀離子(按氯化鉀計)葡萄糖磷酸氫二銨三者的重量比為(o.71.3):(6090):(4.08.0)。8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的工程菌是費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或鈷胺素根瘤菌。一種優選的工程菌是脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)。9.一種用於權利要求l所述方法的培養基，其特徵在於，所述的培養基中鉀離子(按氯化鉀計)葡萄糖磷酸氫二銨三者的重量比為(o.71.3):(eo90):(4.o8.0)。10.如權利要求l所述的培養基，其特徵在於，所述的培養基的重量配方如下葡萄糖71.2±10%;甜菜鹼9.7±2%;磷酸氫二銨5.6±1%;硫酸銨5.9±1%;尿素1.97±0.5%;硫酸鎂1.38±0.1%;氯化鉀0.97±0.1%;DMBI(5，6-二甲基苯並咪唑)0.077±0.007%;硫酸亞鐵0.030±0.01%;氯化鈷0.025±0.01%;鉬酸鈉0.020±0.01%;和硫酸鋅0.020±0.01%。全文摘要本發明提供了一種優化的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B12方法與合成培養基。所述的方法包括步驟在適合發酵的且鉀離子濃度為0.7-1.3g/L發酵液下，培養生產維生素B12的工程菌，發酵生產維生素B12，其中所述的鉀離子濃度以氯化鉀計。本發明方法可大幅提高維生素B12的產量，能更好地用於維生素B12合成過程代謝流的通量分析。本發明還提供了相應的全合成培養基以及用所述全合成培養基生產維生素B12的方法。文檔編號C12P19/00GK101748177SQ20081020426公開日2010年6月23日申請日期2008年12月9日優先權日2008年12月9日發明者儲炬,莊英萍,張一鳴,張嗣良,王慧媛,王澤建申請人:華東理工大學