一種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒及其製備方法
2023-04-26 13:11:51 1
一種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明屬於體外免疫檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測樣本中髓過氧化物酶（MPO）濃度的試劑盒及其製備方法。所述試劑盒包括包被有抗髓過氧化物酶單克隆抗體的微孔板、髓過氧化物酶系列標準品和質控品、辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體、樣本緩衝液、過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液、四甲基聯苯胺的檸檬酸鹽緩衝溶液、1-2M的硫酸溶液、含有表面活性劑的磷酸鹽緩衝液。本發明由於所用的檢測儀器較為簡單，均為通常所用儀器，故檢測成本較低，利於推廣；並且該試劑盒容易操作，不需要專業的人員即可實現；同時試劑盒內獨特的標準品稀釋液和樣本緩衝液配方，大大提高了檢測結果的可靠性和準確性。
【專利說明】一種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於體外免疫檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測樣本中髓過氧化物酶 (ΜΡ0)濃度的試劑盒及其製備方法。
【背景技術】
[0002] 髓過氧化物酶（ΜΡ0)是一種相對分子質量為150KD的白細胞酶，是糖基化的血紅 素蛋白。ΜΡ0來源於多形核中性粒細胞、單核細胞及巨噬細胞，貯存在嗜天青顆粒中，當白 細胞被激活及脫顆粒時，ΜΡ0被釋放到吞噬泡和血漿中。在特定條件下，它能誘導氧化應 激和組織損傷，作為系統炎症和氧化應激的標誌物，ΜΡ0通過多種機制參與冠心病的發生、 發展。大量流行病學研究顯示ΜΡ0濃度的增高與冠心病密切相關，因此檢測病人血漿中ΜΡ0 的濃度對於冠心病患者具有十分重要的參考價值。
[0003] 目前，在市面上檢測ΜΡ0濃度常用的試劑種類需要配套昂貴的大型儀器，檢測成 本高，操作繁瑣，對實驗操作人員的技能要求高，不利於該項目檢測的大範圍推廣。
【發明內容】
[0004] 針對上述技術的不足之處，本發明提供一種操作簡便、便於實驗人員掌握、涉及實 驗儀器單一、普及率高、檢測成本低、檢測結果準確，非常利於大範圍推廣的髓過氧化物酶 (ΜΡ0)定量檢測試劑盒。
[0005] -種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒，包括包被有抗髓過氧化物酶單克隆 抗體的微孔板、髓過氧化物酶系列標準品和質控品、辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物 酶單克隆抗體、樣本緩衝液、過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液(稱為底物A)、四甲基聯苯胺的檸 檬酸鹽緩衝溶液(稱為底物B)、1-2M的硫酸溶液(稱為終止液)、含有表面活性劑的磷酸鹽緩 衝液(稱為濃縮洗液)。
[0006] 進一步的，所述微孔板為96孔聚苯乙烯微孔板，裡面包被有1-50 μ g/孔的抗髓過 氧化物酶單克隆抗體。
[0007] 進一步的，所述的髓過氧化物酶系列標準品和質控品都是用髓過氧化物酶純品與 自製的標準品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋而成，所述標準品不少於2個，所述質控 品和所述標準品的區別只是濃度不同，所述質控品的作用是在試劑盒使用過程中起到核准 校對的作用，即通過質控品測值是否在質控範圍內來對標準品擬合出來的曲線進行核准校 對，若質控品測值合格，則可以利用標準曲線來擬合出樣本中的髓過氧化物酶濃度值。
[0008] 進一步的，所述的標準品稀釋液，是在PH7. 0-8. 0、濃度為10-100mM磷酸鹽緩衝液 中，分別加入1-10%質量分數的動物血清、〇. 01-0. 5%質量分數的防腐劑、1-10%質量分數的 蛋白保護劑、0.05-1%質量分數的表面活性劑混合而成。
[0009] 進一步的，所述樣本緩衝液是在PH4. 0-5. 0、濃度為10-100mM的檸檬酸鹽緩衝液 中，分別加入〇. l_3mM的金屬離子絡合劑、1-10%質量分數的蛋白保護劑、0.01-1%質量分數 的表面活性劑、〇. 01-0. 5%質量分數的防腐劑混合而成。
[0010] 優選的，所述的表面活性劑為曲達通X-100、吐溫20、布裡傑-35、吐溫40、吐溫60、 吐溫80、十二烷基磺酸鈉、斯盤20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。 [0011] 優選的，所述的防腐劑為Proclin300、疊氮鈉、硫柳汞、硫酸慶大黴素。
[0012] 優選的，所述的金屬離子絡合劑為乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸四鈉。
[0013] 優選的，所述的蛋白保護劑為牛血清白蛋白、牛Y蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
[0014] 製備所述試劑盒的方法，包括以下製備過程，所述製備過程不分先後：
[0015] 包被有抗髓過氧化物酶單克隆抗體的微孔板的製備：將特異性的抗髓過氧化物酶 單克隆抗體用磷酸鹽緩衝液稀釋到濃度為1-50 μ g/ml，分別加入到96孔聚苯乙烯微孔板 的凹孔中進行包被；然後用洗板機將微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋 白的封閉液進行封閉；甩去凹孔中的封閉液，烤乾，真空袋封裝，4°C存放；
[0016] 髓過氧化物酶系列標準品和質控品的製備：用含有動物血清、防腐劑、蛋白保護 齊IJ、表面活性劑的磷酸鹽緩衝液將髓過氧化物酶純品配製成標示濃度為〇-l〇〇〇ng/ml的一 系列標準品以及8〇-500ng/ml的質控品；
[0017] 辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的製備：將被過碘酸鈉氧化 好的辣根過氧化物酶與特異性的抗髓過氧化物酶單克隆抗體混合交聯，然後用硼氫化鈉還 原，再透析後即得髓過氧化物酶的酶標抗體；將酶標記物與甘油等體積混合，-20°c保存備 用；
[0018] 樣本緩衝液的製備：將金屬離子絡合劑、蛋白保護劑、表面活性劑和防腐劑分別加 入到檸檬酸鹽緩衝液中，攪拌均勻；
[0019] 底物A的製備：將過氧化氫加入到檸檬酸鹽緩衝液中，配製成過氧化氫終濃度為 20-50%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0020] 底物B的製備：將四甲基聯苯胺加入到檸檬酸鹽緩衝液中，配製成四甲基聯苯胺 最終濃度為5-20%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0021] 終止液的製備：將濃硫酸加水稀釋；
[0022] 濃縮洗液的製備：把表面活性劑加到磷酸鹽緩衝液中，然後混勻。
[0023] 本發明由於所用的檢測儀器較為簡單，均為通常所用儀器，故檢測成本較低，利於 推廣；並且該試劑盒容易操作，不需要專業的人員即可實現；同時試劑盒內獨特的標準品 稀釋液和樣本緩衝液配方，大大提高了檢測結果的可靠性和準確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1為實施例2標準曲線圖。
[0025] 圖2為實施例3標準曲線圖。
[0026] 圖3為實施例4標準曲線圖。
[0027] 圖4為實施例5標準曲線圖。
[0028] 圖5為實施例6標準曲線圖。
[0029] 圖6為實施例7標準曲線圖。
[0030] 圖7為實施例8標準曲線圖。
[0031] 圖8為實施例9標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0033] 實施例1:
[0034] 一種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒，包括包被有抗髓過氧化物酶單克隆 抗體的微孔板、髓過氧化物酶系列標準品和質控品、辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物 酶單克隆抗體、樣本緩衝液、過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液(稱為底物A)、四甲基聯苯胺的檸 檬酸鹽緩衝溶液(稱為底物B)、1-2M的硫酸溶液(稱為終止液)、含有表面活性劑的磷酸鹽緩 衝液(稱為濃縮洗液)。
[0035] 進一步的，所述微孔板為96孔聚苯乙烯微孔板，裡面包被有1-50 μ g/孔的抗髓過 氧化物酶單克隆抗體。
[0036] 進一步的，所述的髓過氧化物酶系列標準品和質控品都是用髓過氧化物酶純品與 自製的標準品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋而成，所述標準品不少於2個，所述質控 品和所述標準品的區別只是濃度不同，所述質控品的作用是在試劑盒使用過程中起到核准 校對的作用，即通過質控品測值是否在質控範圍內來對標準品擬合出來的曲線進行核准校 對，若質控品測值合格，則可以利用標準曲線來擬合出樣本中的髓過氧化物酶濃度值。
[0037] 進一步的，所述的標準品稀釋液，是在PH7. 0-8. 0、濃度為10-100mM磷酸鹽緩衝液 中，分別加入1-10%質量分數的動物血清、〇. 01-0. 5%質量分數的防腐劑、1-10%質量分數的 蛋白保護劑、0.05-1%質量分數的表面活性劑混合而成。
[0038] 進一步的，所述樣本緩衝液是在PH4. 0-5. 0、10-100mM濃度的檸檬酸緩衝液中，分 別加入0. l-3mM的金屬離子絡合劑、1-10%質量分數的蛋白保護劑、0. 01-1%質量分數的表 面活性劑、0. 01-0. 5%質量分數的防腐劑混合而成。
[0039] 優選的，所述的表面活性劑為曲達通X-100、吐溫20、布裡傑-35、吐溫40、吐溫60、 吐溫80、十二烷基磺酸鈉、斯盤20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
[0040] 優選的，所述的防腐劑為Proclin300、疊氮鈉、硫柳汞、硫酸慶大黴素。
[0041] 優選的，所述的金屬離子絡合劑為乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸四鈉。
[0042] 優選的，所述的蛋白保護劑為牛血清白蛋白、牛Y蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
[0043] 製備所述試劑盒的方法，包括以下製備過程，所述製備過程不分先後：
[0044] 包被有抗髓過氧化物酶單克隆抗體的微孔板的製備：將特異性的抗髓過氧化物酶 單克隆抗體用磷酸鹽緩衝液稀釋到濃度為1-50 μ g/ml，分別加入到96孔聚苯乙烯微孔板 的凹孔中進行包被；然後用洗板機將微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋 白的封閉液進行封閉；甩去凹孔中的封閉液，烤乾，真空袋封裝，4°C存放；
[0045] 髓過氧化物酶系列標準品和質控品的製備：用含有動物血清、防腐劑、蛋白保護 齊IJ、表面活性劑的磷酸鹽緩衝液將髓過氧化物酶純品配製成標示濃度為0、50、100、200、 400、800ng/ml的一系列標準品以及80、300ng/ml的質控品；
[0046] 辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的製備：將被過碘酸鈉氧化 好的辣根過氧化物酶與特異性的抗髓過氧化物酶單克隆抗體混合交聯，然後用硼氫化鈉還 原，再透析後即得髓過氧化物酶的酶標抗體；將酶標記物與甘油等體積混合，-20°C保存備 用；
[0047] 樣本緩衝液的配製：將金屬離子絡合劑、蛋白保護劑、表面活性劑和防腐劑分別加 入到檸檬酸鹽緩衝液中，攪拌均勻；
[0048] 底物A的製備：將過氧化氫加入到檸檬酸鹽緩衝液中，配製成過氧化氫終濃度為 20-50%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0049] 底物B的製備：將四甲基聯苯胺加入到檸檬酸鹽緩衝液中，配製成四甲基聯苯胺 最終濃度為5-20%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0050] 終止液的製備：將濃硫酸加水稀釋；
[0051] 濃縮洗液的製備：把表面活性劑加到磷酸鹽緩衝液中，然後混勻。
[0052] 實施例2 :
[0053] 通過以下方法製備該試劑盒：
[0054] 包被有抗髓過氧化物酶單克隆抗體的微孔板的製備：將特異性的抗髓過氧化物酶 單克隆抗體用PH值為7. 4的20mM磷酸鈉緩衝液稀釋到濃度為1 μ g/ml，加入到96孔聚苯 乙烯微孔板的凹孔中，l〇〇ul/孔，4°C包被過夜；移去包被液，然後用洗板機將微孔板洗三 次；再向微孔板凹孔中加入含1%牛血清白蛋白的PH7. 4的10mM磷酸鈉緩衝液：300ul/孔， 37°C封閉2小時；甩去凹孔中的封閉液，37°C烤乾4小時，真空袋封裝，4°C存放；
[0055] 髓過氧化物酶系列標準品和質控品的製備：用含有1%新生牛血清、 0. 05%Proclin300、3%牛血清白蛋白、0. l%Triton X-100的20mM磷酸鈉緩衝溶液（PH7. 4)將 髓過氧化物酶純品配製成標示濃度為0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列標準品以及 80、300ng/ml的質控品；然後用凍幹機凍幹成粉末狀，4°C保存；
[0056] 辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的製備：
[0057] (1)先稱取5mg辣根過氧化物酶溶解於1ml蒸餾水中。
[0058] (2)於上液中加入0· 2ml新配的0· 1M NaI04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0059] (3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM PH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜。
[0060] (4)加20 μ 10. 2M PH9. 5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化好的辣根過氧化物酶PH升高 到9. 0?9. 5,然後立即加入10mg特異性的抗髓過氧化物酶抗體，室溫避光輕輕攪拌2小 時。
[0061] (5)向反應體系加入0· 1ml新配的4mg / ml NaBH4溶液，置4°C混勻2小時。
[0062] (6)將上述反應體系裝入透析袋中，對0· 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜。
[0063] (7)將透析袋中的酶標記物與甘油等體積混勻，_20°C保存備用；
[0064] (8)將酶標抗體按照1:2000的比例進行稀釋。
[0065] 樣本緩衝液的製備：向10mM檸檬酸鈉緩衝液（PH4. 0)中分別添加 ：lmM EDTA二鈉、 1% 牛血清白蛋白、0· l%Tween20、0. 1%BRIJ_35 和 0· 05%Proclin300,充分混勻。
[0066] 底物A、底物B、終止液和濃縮洗液的製備
[0067] 底物A :向10mM檸檬酸鈉緩衝液（PH4. 0)中添加20%的過氧化氫，充分混勻；
[0068] 底物B :向10mM檸檬酸鈉緩衝液（PH4. 0)中添加5%的TMB，充分混勻；
[0069] 終止液：1M的硫酸溶液；
[0070] 濃縮洗液：向0. 2M磷酸鈉鹽緩衝液（PH7. 4)中加入1%吐溫20,充分混勻；
[0071] 如附圖1所示為本實施例的標準曲線圖，表1為本實施例質控品、樣本檢測結果。
[0072] 表1質控品、樣本檢測結果
[0073]
【權利要求】
1. 一種檢測樣本中髓過氧化物酶濃度的試劑盒，其特徵在於：包括包被有抗髓過氧化 物酶單克隆抗體的微孔板、髓過氧化物酶系列標準品和質控品、辣根過氧化物酶標記的抗 髓過氧化物酶單克隆抗體、樣本緩衝液、過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液、四甲基聯苯胺的檸檬 酸鹽緩衝溶液、1-2M的硫酸溶液、含有表面活性劑的磷酸鹽緩衝液。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於：所述微孔板為96孔聚苯乙烯微孔板， 裡面包被有1-50 y g/孔的抗髓過氧化物酶單克隆抗體。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於：所述的髓過氧化物酶系列標準品和質 控品都是用髓過氧化物酶純品與自製的標準品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋而成。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於：所述的標準品稀釋液，是在PH7. 0-8.0、 濃度為l〇-l〇〇mM磷酸鹽緩衝液中，分別加入1-10%質量分數的動物血清、〇. 01-0. 5%質量分 數的防腐劑、1-10%質量分數的蛋白保護劑、〇. 05-1%質量分數的表面活性劑混合而成。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於：所述樣本緩衝液是在PH4. 0-5. 0、濃度 為10-100mM的檸檬酸緩衝液中，分別加入0. l-3mM的金屬離子絡合劑、1-10%質量分數的蛋 白保護劑、〇. 01-1%質量分數的表面活性劑、〇. 01-0. 5%質量分數的防腐劑混合而成。
6. 根據上述任意一項權利要求所述的試劑盒，其特徵在於：所述的表面活性劑為曲達 通X-100、吐溫20、布裡傑-35、吐溫40、吐溫60、吐溫80、十二烷基磺酸鈉、斯盤20、烷基酚 聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
7. 根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於：所述的防腐劑為Pr〇clin300、疊氮 鈉、硫柳汞、硫酸慶大黴素。
8. 根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於：所述的金屬離子絡合劑為乙二胺 四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸四鈉。
9. 根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於：所述的蛋白保護劑為牛血清白蛋 白、牛Y蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
10. 製備如權利要求1所述的試劑盒的方法，其特徵在於：包括以下步驟： 包被有抗髓過氧化物酶單克隆抗體的微孔板的製備：將特異性的抗髓過氧化物酶單克 隆抗體用磷酸鹽緩衝液稀釋到濃度為1-50 μ g/ml，分別加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹 孔中進行包被；然後用洗板機將微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋白的 封閉液進行封閉；甩去凹孔中的封閉液，烤乾，真空袋封裝，4°C存放； 髓過氧化物酶系列標準品和質控品的製備：用含有動物血清、防腐劑、蛋白保護劑、表 面活性劑的磷酸鹽緩衝液將髓過氧化物酶純品配製成標示濃度為〇-l〇〇〇ng/ml的一系列 標準品以及80-500ng/ml的質控品； 辣根過氧化物酶標記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的製備：將被過碘酸鈉氧化好的辣 根過氧化物酶與特異性的抗髓過氧化物酶單克隆抗體混合交聯，然後用硼氫化鈉還原，再 透析後即得髓過氧化物酶的酶標抗體；將酶標記物與甘油等體積混合，_20°C保存備用； 樣本緩衝液的配製：將金屬離子絡合劑、蛋白保護劑、表面活性劑和防腐劑分別加入到 檸檬酸鹽緩衝液中，攪拌均勻； 過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液的製備：將過氧化氫加入到檸檬酸鹽緩衝液中，配製成過 氧化氫終濃度為20-50%的檸檬酸鹽混合溶液； 四甲基聯苯胺的檸檬酸鹽緩衝溶液的製備：將四甲基聯苯胺加入到檸檬酸鹽緩衝液 中，配製成四甲基聯苯胺最終濃度為5-20%的檸檬酸鹽混合溶液； 1-2M的硫酸溶液的製備：將濃硫酸加水稀釋； 含有表面活性劑的磷酸鹽緩衝液的製備：把表面活性劑加到磷酸鹽緩衝液中，然後混 勻。
【文檔編號】G01N33/577GK104122395SQ201310156280
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優先權日:2013年4月28日
【發明者】鄭樂民, 王曉華, 吳建榕 申請人:北京協和洛克生物技術有限責任公司