具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法
2023-04-26 15:23:36
專利名稱：具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種製備具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的方法。
背景技術：
目前，在全世界範圍內，心血管疾病,腦血管疾病及周圍動脈疾病仍是弓I起人類死亡的主要原因。當病變血管需要被替換時，臨床上最常用的是自體血管，如隱靜脈，乳內動脈等，每年大約需要實施600000例血管移植手術，但接近三分之一的病患者因為血管老化，血管病變、損傷或之前手術使用等原因而無法使用自體血管，且此方法往往需要二次手術，對病人機體造成較大損傷。在這種情況下，人工血管成為很好的選擇。目前臨床上使用的人工血管如ePTFE (GORE )及Dacron (Invista )替代大口徑血管(6—IOmm)已經非常成熟，但對於口徑小於6mm的血管或者血流速度慢的區域，例如冠狀動脈或膝下動脈，人工血管移植的失敗率很高。造成人工血管移植失敗的主要原因是血液-材料界面血栓形成，因此很有必要研發新型具有較好血液相容性的材料或者提高原有材料的血液相容性來製備小口徑人工血管天然血管一般由三層結構組成:外膜層，中膜層和內膜層。原子力顯微鏡觀察結果表明，大鼠血管的內膜層表面分布著沿血管長軸方向的亞微米尺度溝槽，以及溝槽表面納米級的包狀突起。靜電紡絲技術(電紡)是近幾年興起的一種製備納米至微米級纖維的十分有效的方法，因為其設備簡易，費用低廉，製備出的材料具有較高的比表面積，可控纖維的直徑及孔隙率，以及可製備出接近天然細胞外基質尺度範圍的纖維等優點，被廣泛用於組織工程支架的製備。大多數情況下，利用靜態收集器，靜電紡絲製備出的材料是絮狀或網狀的纖維聚集體，但很多人體組織例血管，骨，神經管，韌帶等，具有典型的定向排列微結構，因而利用靜電紡絲技術製備取向纖維微結構組織工程支架成為一個熱點。很多研究證實具仿生血管中膜周向分布微結構的組織工程血管支架可以調節人工血管的宏觀力學特性，並能引導組織再生。目前較少有製備沿血管長軸方向取向微結構的人工血管的報導。專利CN201010117485.4中只公開了使用靜電紡絲技術製備無規則內膜結構的人工血管，專利CN200610144252.7中提出了具微納仿內膜結構的二維材料，所以具微納仿生內膜結構的三維人工血管的製備是急需解決的問題。
發明內容
針對現有人工血管制備技術存在的問題，本發明的主要目的在於提供一種具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，以提高人工血管的血液相容性，避免因血栓形成造成人工血管腔狹窄。本發明是這樣實現的，一種具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，該製備方法按如下步驟進行:(I)高分子聚合物靜電 紡絲原液的配製:將高分子聚合物配製成紡絲效果良好地溶劑，用合適的無機溶劑(水)和/或有機溶劑(如甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲醯胺、四氫呋喃或它們的任意混合物等)配製高分子聚合物溶液。(2)將步驟(I)中製備的溶液移入注射器中，然後將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，以高速旋轉轉鼓作為收集裝置，轉鼓外周覆蓋鋁箔，並通過導線連接地線或者負高壓電源。開啟高壓電源，電紡製備取向納米纖維組成的薄膜；(3)將步驟(2)中製備取向納米纖維膜沿纖維長軸方向拉伸(如圖1c所示)，置於高溫烘箱中，保持拉伸狀態並烘乾；(4)具有取向微結構的人工血管的製備；(5)人工血管體外血小板粘附的測定；在本發明的上述技術方案中，所述步驟(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、滌綸、聚己內酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烴，矽橡膠，醫用聚氯乙烯以及它們之間的共聚物等合成高分子聚合物，膠原，殼聚糖，纖維素，明膠，纖維蛋白原，絲素蛋白等天然高分子聚合物；進一步所述步驟(2)中取向電紡纖維膜的製備過程是將該溶液針頭與轉鼓上端間的距離是25-30cm,開動轉鼓,設定速度為3000-6000rpm用於製備取向電紡纖維膜,然後施加10-30KV高壓，啟動30-60分鐘後，獲得具取向纖維結構的膜；進一步所述步驟(4)中人工血管的製備，包括:①將具取向微結構的纖維 膜繞不同規格金屬模具捲成管狀作為人工血管的內膜，其中取向纖維膜的絕大部分纖維方向和磨具長軸方向相同；②將模具連接到可以高速旋轉的電機上，通過導線連接地線或負高壓電源；③設定電紡裝置的工作電壓為25_35kv，工作距離25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml電紡同種或不同的高分子聚合物溶液製備人工血管外層；④電紡過程結束後，將帶有人工血管的模具放入高溫烘箱烘乾；⑤乾燥去除殘餘溶劑後，將人工血管從模具上取下後得到具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管；⑥將人工血管截成長度1.4cm的片段，用於測試體外血小板粘附特性，人工血管的內膜微結構通過掃描電鏡表徵。進一步所述步驟(5)中人工血管體外血小板粘附的測定是通過一個自製的血小板體外循環系統來完成，包括:①用PBS溶液灌注，然後將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個注射器加入血小板體外循環系統中，將整個系統置於37°C的水浴下恆溫靜置I小時；②取下三種不同內膜結構的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小時，隨後用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脫水，臨界乾燥儀乾燥後用環境掃描電鏡的低真空模式進行觀察。與現有的小口徑人工血管相比，本發明的優點在於:(I)該發明製備的靜電紡絲人工血管具有仿血管內膜取向排列微結構，使得該人工血管的血液相容性達到臨床抗凝血性能的要求，提供了製備新型人工血管的一個新途徑。(2)本發明不採用抗凝劑，只是通過表面微結構效應提高人工血管的血液相容性，因此不存在抗凝劑會帶來的副作用。
圖1為具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管制備方法流程圖。圖2為具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管內膜掃描電鏡圖(5000X)。圖3為具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管內膜掃描電鏡圖(1000X )。圖4為血小板體外循環系統示意圖(圖4中箭頭表示血液循環方向)。圖5為體外血小板粘附實驗後，人工血管的環境掃描電鏡的低真空模式圖。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，並參照附圖，對本發明進一步詳細說明。實驗材料SD大鼠(400±20g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準)，聚醚型聚氨酯(PU，Sigma-Aldrich),四氫呋喃(THF，分析純，北京化工廠)，N，N- 二甲基甲醯胺(DMF,分析純,北京益利精細化工廠),氯化鈉(北京化工廠，分析純)去離子水(Mill1-Q, Millipore0.22 y m超純水),磷酸氫二鈉(北京化工廠，分析純)，磷酸二氫鈉(北京化工廠，分析純)，水合氯醛(北京化工廠，分析純)，檸檬酸三鈉(北京化工廠，分析純)，戊二醛(北京化工廠，分析純)，矽片(Grinm半導體材料公司，中國)，⑶62P單抗、FITC標記羊抗鼠多抗(Abcom公司)，大鼠組織型纖溶酶原激活劑(t_PA) ELISA檢測試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)，大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA檢測試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)，鋁箔(市售)，醫用注射器(5ml )，針頭(7 12號)。儀器直流高壓電源(DW-P303-1AC，(T+30KV，天津東文高壓電廠)，微量注射泵(TC1-1I型，北京思路高高科技發展有限公司)，微電子天平(德國Dataphysics公司DCATll動態接觸角儀)，離心機(湖南長沙湘儀有限公司H-1650)，恆溫水浴槽，場發射掃描電子顯微鏡(日本電子JEOL JSM-6700)，環境掃描電子顯微鏡(FEI Corp.Quanta 200FEG)，螢光顯微鏡(TC-XDS-500C倒置螢光顯微鏡)，酶標儀(Multiskan FC酶標儀)，1.2mm金屬磨具。實施例1:具微納仿生內膜結構的聚氨酯人工血管的製備1.聚氨酯溶液的配製 將聚氨酯顆粒溶入體積比為7:3的四氫呋喃與N，N- 二甲基甲醯胺混合溶液中，攪拌約3h使之形成一澄清、穩定、均一的溶液。2.取向電紡纖維膜的製備將該溶液移入5ml注射器中，然後將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，針頭與轉鼓上端間的距離是25cm,開動轉鼓，設定速度為3000rpm,然後施加10-30KV高壓，啟動30分鐘後，即可獲得具取向纖維結構的膜。3.取向電紡纖維膜的拉伸為了獲得更好的取向度， 將取向纖維膜沿纖維長軸方向拉伸120%，保持拉伸狀態放置於60°C烘箱半小時。4.具有取向微結構的人工血管的製備將具取向微結構的纖維膜繞金屬磨具捲成管狀(具取向微結構的膜保持其纖維方向與磨具長軸方向一致)作為人工血管的內膜，然後將模具連接到可以高速旋轉的電機上，以接地的模具為收集裝置，保持工作電壓25-35kv，工作距離25cm，電紡製備人工血管外層，每根人工血管使用聚氨酯溶液3ml。電紡過程結束後，將獲得的人工血管取下即可得到本發明的具微納仿生內膜結構的聚氨酯人工血管。通過掃描電鏡表徵人工血管內膜微結構。從掃描電鏡表徵結果可見，組成人工血管內膜的取向電紡纖維的直徑為298±60iim，纖維間距為390± 170nm，與人工血管長軸夾角在10°以內的纖維數量佔總纖維數量的91.7%。5.體外血小板粘附測定血小板體外粘附的測定是通過一個自製的血小板體外循環系統來完成，如圖3所示。該系統主要包括:蠕動泵，三通管，醫用矽膠管，注射器，待測人工血管，其中蠕動泵用來提供循環動力，流速採用50ml/min，接近大鼠腹主動脈的正常流速。整個系統的管路按照細胞培養的水平清洗、處理。①用PBS溶液灌注，然後將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個注射器加入血小板體外循環系統中，將整個系統置於37°C的水浴下恆溫靜置I小時；②取下三種不同內膜結構的人工血 管，置入4°C戊二醛中固定4小時，隨後用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脫水，臨界乾燥儀乾燥後用環境掃描電鏡的低真空模式進行觀察；③人工血管內膜表面粘附的血小板數量很少，且絕多數血小板呈現出未激活的圓球形形態，如圖4所示實施例2:具微納仿生內膜結構的聚己內酯人工血管的製備1.聚己內酯溶液的配製將聚己內酯顆粒溶入體積比為5:5的二氯甲烷與N，N-二甲基甲醯胺混合溶液中，攪拌約3h使之形成一澄清、穩定、均一的溶液。2.取向電紡纖維膜的製備將該溶液移入5ml注射器中，然後將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，針頭與轉鼓上端間的距離是27cm,開動轉鼓，設定速度為4000rpm,然後施加10-30KV高壓，啟動30分鐘後，即可獲得具取向纖維結構的膜。3.取向電紡纖維膜的拉伸為了獲得更好的取向度，將取向纖維膜沿纖維長軸方向拉伸150%，保持拉伸狀態放置於60°C烘箱半小時。4.具有取向微結構的人工血管的製備將具取向微結構的纖維膜繞金屬磨具捲成管狀(具取向微結構的膜保持其纖維方向與磨具長軸方向一致)作為人工血管的內膜，然後將模具連接到可以高速旋轉的電機上，以接地的模具為收集裝置，保持工作電壓25-35kv，工作距離27cm，電紡製備人工血管外層，每根人工血管使用聚己內酯溶液2.5ml。電紡過程結束後，將獲得的人工血管取下即可得到本發明的具微納仿生內膜結構的聚己內酯人工血管。通過掃描電鏡表徵人工血管內膜微結構。5.體外血小板粘附測定血小板體外粘附的測定是通過一個自製的血小板體外循環系統來完成，環境掃描電鏡的低真空模式的觀察結果顯示人工血管內膜表面粘附的血小板數量很少，且絕多數血小板呈現出未激活的圓球形形態除非特殊定義，本發明描述所用的術語是在有關技術領域中公知的術語。標準的化學符號及縮寫符號可以與其全名互換使用。
除非特殊指明，本發明所用到但未明確闡述或簡單闡述的技術和方法是指本技術領域通常使用的技術和方法，可按照本領域公知的技術和方法進行。試劑盒的使用是根據製造商或供應商提供的說明書進行。
權利要求
1.一種具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，其特徵在於該製備方法按如下步驟進行: (1)高分子聚合物靜電紡絲原液的配製:將高分子聚合物配製成紡絲效果良好地溶劑，用無機溶劑和/或有機溶劑配製高分子聚合物溶液。
(2)將步驟(I)中製備的溶液移入注射器中，然後將注射器固定到垂直支架上，通過針頭與高壓電源相連，以高速旋轉轉鼓作為收集裝置，轉鼓外周覆蓋鋁箔，並通過導線連接地線或者負高壓電源。開啟高壓電源，電紡製備取向納米纖維組成的薄膜； (3)將步驟(2)中製備取向納米纖維膜沿纖維長軸方向拉伸，置於高溫烘箱中，保持拉伸狀態並烘乾； (4)具有取向微結構的人工血管的製備:①將具取向微結構的纖維膜繞不同規格金屬模具捲成管狀作為人工血管的內膜，其中取向纖維膜的絕大部分纖維方向和磨具長軸方向相同；②將模具連接到可以高速旋轉的電機上，通過導線連接地線或負高壓電源；③設定電紡裝置的工作電壓為25-35kv，工作距離25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml電紡同種或不同的高分子聚合物溶液製備人工血管外層；④電紡過程結束後，將帶有人工血管的模具放入高溫烘箱烘乾乾燥去除殘餘溶劑後，將人工血管從模具上取下後得到具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管將人工血管截成長度1.4cm的片段，用於測試體外血小板粘附特性，人工血管的內膜微結構通過掃描電鏡表徵。
(5)人工血管體外血小板粘附的測定:其通過一個自製的血小板體外循環系統來完成，包括:①用PBS溶液灌注，然後將富血小板懸液平均分為三份，分別通過三個注射器加入血小板體外循環系統中，將整個系統置於37°C的水浴下恆溫靜置I小時；②取下三種不同內膜結構的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小時，隨後用30 %，50 %，70 %，85 %，95 %和100%乙醇梯度脫水，臨界乾燥儀乾燥後用環境掃描電鏡的低真空模式進行觀察。
2.根據權利要求1所述 的具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，其特徵在於步驟(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、滌綸、聚己內酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烴，矽橡膠，醫用聚氯乙烯以及它們之間的共聚物等合成高分子聚合物，膠原，殼聚糖，纖維素，明膠，纖維蛋白原，絲素蛋白等天然高分子聚合物。
3.根據權利要求1所述的具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，其特徵在於步驟(2)中取向電紡纖維膜的製備過程是將該溶液針頭與轉鼓上端間的距離是25-30cm,開動轉鼓,設定速度為3000-6000rpm用於製備取向電紡纖維膜,然後施加10-30KV高壓，啟動30-60分鐘後，獲得具取向纖維結構的膜。
4.根據權利要求1所述的具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，其特徵在於無機溶劑為水。
5.根據權利要求1所述的具微納仿生內膜結構的靜電紡絲人工血管的製備方法，其特徵在於有機溶劑為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲醯胺、四氫呋喃或它們的任意混合物。
全文摘要
本發明公開了一種利用靜電紡絲技術製備的具微納仿生內膜結構的人工血管的製備方法，其主要步驟包括高分子聚合物溶液的配製；取向電紡纖維膜的製備；拉伸；人工血管的製備；掃描電鏡表徵；血液相容性的測定。該方法製備的人工血管具有仿血管內膜取向排列微結構，使得該人工血管的血液相容性達到臨床抗凝血性能的要求，提供了製備新型人工血管的一個新途徑，同時由於不採用抗凝劑，只是通過表面微結構效應提高人工血管的血液相容性，因此減少了抗凝劑會帶來的副作用，在醫學臨床血管移植領域具有良好的應用前景。
文檔編號A61F2/06GK103211663SQ201210287469
公開日2013年7月24日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者王深明, 劉瑞明, 趙勇, 胡作軍, 秦原森 申請人:王深明, 劉瑞明, 趙勇, 胡作軍, 秦原森