抗-cd40抗體的製作方法

2023-04-26 11:21:06

專利名稱：抗-cd40抗體的製作方法
技術領域：
概言之，本發明涉及用於診斷及治療應用的人源化抗-CD40抗體。更具體而言，本發明公開了人源化抗-CD40抗體及用於治療特徵在於表達CD40的細胞的各種疾病或病症的方法。本發明還公開了包含人源化抗-CD40抗體的藥物組合物及試劑盒。
背景技術：
⑶40為48kDa I型膜內在糖蛋白，且為腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員。多種類型的細胞上表達CD40，包括正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、癌瘤細胞、上皮細胞(例如角質化細胞)、成纖維細胞(例如滑膜細胞)及血小板。CD40亦存在於單核細胞、巨噬細胞、一些內皮細胞及濾泡樹突細胞上。⑶40在B細胞個體發育的早期表達，其在⑶10及⑶19出現後、且在表達⑶21、⑶23、⑶24及出現表面免疫球蛋白M(sIgM)之前出現在B細胞前體上(Uckun等人，1990，Blood 15:2449)。亦已在扁桃體及來自骨髓的漿細胞上檢測到 CD40 (Pellat-Decounynck 等人，1994, Blood 84:2597)。CD40的配體為CD40L(亦稱作CD154、gp39及TRAP)，其為TNF超家族成員。CD40L為主要在活化⑶4+T細胞及一小亞群⑶8+T細胞上表達的跨膜蛋白(Van Kooten C.及Banchereau,2000)。⑶40與⑶40L的相互作用誘導體液及細胞介導的免疫應答。⑶40調節此配體-受體對以活化B細胞及其他抗原呈遞細胞(APC)，包括樹突細胞(DC)(由Toubi及Shoenfeld，2004 ；Kiener等人，1995綜述)。業內已廣泛研究了⑶40對B細胞的功能。在次級淋巴樣器官的生發中心中，CD40對B細胞的活化誘導增殖、分化為抗體分泌細胞及同種型(isotype)轉換。體外研究已顯示，⑶40活化對細胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α ,LTa)的產生、黏著分子及共刺激受體(ICAM、⑶23、CD80及⑶86)的表達、以及B淋巴細胞表達MHC I類、MHCII類及TAP轉運蛋白的提高具有直接效應(Liu等人，1996)。在大多數所述過程中，⑶40與細胞因子或其他受體-配體相互作用發生協同作用。⑶40在單核細胞及DC上的信號傳導導致存活延長以及細胞因子(IL-1、IL_6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-a及MIP-1 a )的分泌。CD40在所述APC上的配基化亦導致共刺激分子(例如ICAM-I、LFA-3、⑶80及⑶86)上調。⑶40受體的活化為使得DC可完全成熟為有效APC、從而驅動T細胞活化的一個關鍵信號(Banchereau及Steinman, 1998) (VanKooten C.及 Banchereau,2000)。在小鼠模型中的最新研究顯示，CD40在樹突細胞上的信號傳導在TH17細胞產生中亦具有重要作用，TH17細胞被視為例如關節炎及多發性硬化等疾病中的自身免疫介導物(Iezzi 等人，2009) (Perona-ffright 等人，2009)。CD40及CD40L剔除小鼠以及激動性及拮抗性抗小鼠抗體的可用性使得可研究若干種疾病模型中CD40-CD40L的相互作用。已證實，給予阻斷性抗-CD40L在若干種自身免疫模型中有益，包括自發性疾病(例如SNFl小鼠中的狼瘡性腎炎或NOD小鼠中的糖尿病)或疾病的實驗誘導形式(例如膠原誘導性關節炎(CIA)或實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE))(Toubi及Shoenfeld，2004)。抗-CD40L mAb可抑制小鼠中的CIA，其阻斷關節炎症的發生、針對膠原的血清抗體滴度、炎症細胞浸潤至滑液下組織中以及軟骨及骨的侵蝕(Durie等人，1993)。對於狼瘡性腎炎及EAE 二者，已證實抗-CD40L亦可減輕進行性疾病，從而確認了 CD40-CD40L在疾病效應期中的作用(Kalled等人，1998) ; (Howard等人，1999)。亦在⑶40L缺陷型小鼠中研究⑶40-⑶40L相互作用在EAE發展中的作用，所述小鼠攜帶對髓磷脂鹼性蛋白具有特異性的轉基因T細胞受體。所述小鼠在經抗原初免後不會發展EAE，且⑶4+T細胞保持休眠且不產生INF- y (Grewal等人，1996)。此外，針對CD40的抑制性抗體在例如EAE等炎性疾病模型中顯示有益效應。Lamann及合作者證實,拮抗性小鼠抗人⑶40mAb muroi2及此mAb的嵌合形式可在遠親雜交狨猴中有效防止慢性脫髓鞘性EAE的臨床表達(Laman等人，2002) ； (Boon等人，2001)。隨訪研究顯示，在狨猴EAE模型中，使用嵌合抗人CD40抗體的治療性治療降低MRI可檢測炎·症並延遲已存在腦部損傷的擴大(Hart等人，2005)。在關節炎小鼠模型中測試具有激動活性的抗-CD40抗體，且獲得一些矛盾性結果。如對免疫刺激劑所預期，顯示激動性抗小鼠CD40mAb FGK45在CIA的DBA/1小鼠模型中可加重疾病(Tellander等人，2000)。然而，在另一慢性CIA模型FGK45中，以及另一激動性抗小鼠⑶40mAb (3/23)中，二者皆表現出積極治療效應(Mauri等人，2000)。此治療組假定，此治療性治療方案中的激動性抗體通過誘導朝向Th2反應的免疫偏離及降低IFN-Y含量且升高IL-4和IL-10的含量來產生有益效應(Mauri等人，2000)。亦已記錄可通過阻斷⑶40/⑶154相互作用來防止移植排斥。嵌合抗-⑶40拮抗劑ch 12在恆河猴腎異體移植研究中的應用表明，CD40的拮抗作用足以達成疾病緩解並將平均存活時間延長超過100天。在將ch 12與抗⑶86抗體組合且僅在開始異體移植研究時給予，之後使用環孢菌素(cyclosporine)進行延長治療時，獲得超過4年的平均存活時間，從而表明此組合可有效誘導耐受性(Haanstra等人,2005)。因此，有眾多臨床前研究證實，⑶40-⑶40L 二聯體在有效的T細胞依賴性免疫應答的驅動中具有決定性作用。因此，業內公認阻斷CD40信號傳導為在例如RA、多發性硬化或牛皮癬等疾病中抑制致病性自身免疫應答的適宜且必需的治療策略。然而，迄今為止，由於先前在研發中顯示抗-CD40抗體具有顯著副作用，故尚無CD40抗體獲批用於所述病症的治療性幹預。因此，業內仍非常需要可用於幹預⑶40-⑶40L的作用並阻斷⑶40信號傳導的治療藥物。可通過新穎人源化抗-CD40抗體來滿足此需要，所述抗體特異性結合CD40，且其所顯示的抗原結合特異性、親和性及藥物代謝動力學及藥效學特性使得其可用於治療性幹預基於CD40的病症。發明概述本發明提供人源化單克隆抗體，其中該抗體特異性結合人CD40，其在B細胞增殖中具有IC50小於InM的拮抗活性且在高達100 μ g/ml的濃度不具有激動作用，且其中該抗體的特徵還在於，該抗體在非人靈長類中的活體內半衰期為至少10天。人源化單克隆抗體的特徵還在於，在小於30mg/kg的劑量下，抗體在短尾猴(cynomolgus monkeys)中的半衰期大於8天。在示例性實施方案中，本發明的抗體包含選自SEQ ID N0:1至SEQ IDN0:4中任一者的重鏈序列及選自SEQ ID N0:5至SEQ ID NO:8中任一者的輕鏈序列。
在其他實施方案中，該抗體為人源化抗體或抗體的抗原結合片段，其具有以下中的任一者的重鏈可變區胺基酸序列SEQ ID NO: I至4、SEQ IDNO:27, SEQ ID NO:28, SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQIDNO:46, SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:57, SEQID NO:58, SEQID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID N0:61、SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67, SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70,SEQID NO:71、SEQID NO:72 或 SEQ ID NO:73。在其他實施方案中，該抗體為人源 化抗體或抗體的抗原結合片段，其包含以下輕鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQIDNO:74、SEQ ID NO:75 或 SEQ ID NO:76。在具體實施方案中，本文所述單克隆抗體的特徵在於，其包含重鏈及輕鏈，其中重鏈 CDRl 序列選自 SEQ ID NO: 9 至 SEQ ID NO: 11，重鏈 CDR2 序列選自 SEQ ID NO: 12 至 SEQID NO: 15，且重鏈CDR3序列選自SEQ IDNO: 16至SEQ ID NO: 17 ;且其中輕鏈CDRl序列選自 SEQ ID NO: 18 至 SEQID NO: 21，輕鏈 CDR2 序列為 SEQ ID NO: 22 至 SEQ ID NO: 23，且輕鏈 CDR3 序列選自 SEQ ID NO:24 至 SEQ ID NO:25。在具體實施方案中，本文所述單克隆抗體的特徵在於，其包含重鏈⑶Rl序列SEQID NO: 10、重鏈CDR2序列SEQ ID NO: 13及重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 16，且其中該抗體包含輕鏈CDRl序列SEQ ID NO: 19、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22及輕鏈CDR3序列SEQ IDNO:24。在其他具體實施方案中，本文所述單克隆抗體的特徵在於，其包含重鏈CDRl序列SEQ ID N0:9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO: 14及重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 16，且其中該抗體包含輕鏈CDRl序列SEQ ID NO: 20、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO: 22及輕鏈CDR3序列SEQ IDN0:24。在另一具體實施方案中，本文所述單克隆抗體的特徵在於，其包含重鏈CDRl序列SEQ ID N0:9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO: 14及重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 16，且其中該抗體包含輕鏈CDRl序列SEQ ID NO: 20、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO: 22及輕鏈CDR3序列SEQ IDN0:24。在另一具體實施方案中，本文所述單克隆抗體的特徵在於，其包含重鏈CDRl序列SEQ ID N0:11、重鏈CDR2序列SEQ ID NO: 15及重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 17，且其中該抗體包含輕鏈CDRl序列SEQ ID NO: 21、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO: 23及輕鏈CDR3序列SEQID N0:25。本文亦闡述本發明優選抗體中重鏈的個別序列。例如，本發明涉及抗-CD40抗體，其包含SEQ ID N0:1至4中任一者的重鏈可變域序列。該抗-⑶40抗體的特徵還在於，其包含SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:8中任一者的輕鏈可變域序列。還包括人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:27及SEQ ID NO:26 ；SEQ ID N0:28及SEQID NO:26 ；SEQ ID NO:29及 SEQ ID NO: 26 ；SEQ ID NO: 30 及 SEQ ID NO: 26 ；SEQ ID NO: 32 及 SEQ ID NO: 31 ；SEQ IDNO:33及SEQ ID NO:31 ；SEQ IDNO:34及SEQ ID NO:31 ；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31 ；SEQID NO:37及SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:39及SEQ IDNO:36 ；SEQ ID NO:40 及 SEQ ID NO:36。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可 變區SEQ ID N0:27及SEQ ID N0:26。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:28及SEQ IDNO:26 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:29及SEQ IDNO:26 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:30及SEQ IDNO:26 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:32及SEQ ID N0:31。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:33及SEQ IDN0:31。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:34及SEQ IDN0:31。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:35及SEQ IDN0:31。在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:37及SEQ IDNO:36 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:38及SEQ IDNO:36 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:39及SEQ IDNO:36 在另一實施方案中，本發明涉及人源化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變區SEQ ID N0:40及SEQ IDNO:36 另一實施方案涉及特異性結合人CD40的分離的抗體或抗原結合片段，其包含人源化重鏈可變域，該人源化重鏈可變域包含框架區，該框架區的胺基酸序列與人可變域重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ IDN0:29 或 SEQ ID N0:30 中的框架區的胺基酸序列至少90%—致；且包含與相應的SEQ ID NO: 26的輕鏈可變域至少90% —致的輕鏈胺基酸序列。另一實施方案涉及特異性結合人CD40的分離的抗體或抗原結合片段，其包含人源化重鏈可變域，該人源化重鏈可變域包含框架區，該框架區的胺基酸序列與人可變域重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34 或 SEQ ID NO: 35 中的框架區的胺基酸序列至少90%—致；且包含與相應的SEQ ID N0:31的輕鏈可變域至少90% —致的輕鏈胺基酸序列。另一方面中，本發明涉及上一段的實施方案中所述的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 32 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQID NO:33 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:34 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:35。還包括特異性結合人CD40的分離的抗體或抗原結合片段，其包含人源化重鏈可變域，該人源化重鏈可變域包含框架區，該框架區的胺基酸序列與人可變域重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39 或 SEQ ID NO:40 中的框架區的胺基酸序列至少90%—致；且包含與相應的SEQ ID NO: 36的對應輕鏈至少90%—致的輕鏈胺基酸序列。另ー方面中，本發明涉及上一段的實施方案中所述的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 37 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQID NO:38 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:39 ;另ー實施方案中所述重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:40。本發明的抗體的特徵還在於，所述抗體在不存在CD40L時不能刺激B細胞產生細胞因子。本發明的抗體的特徵還在於，所述抗體在50%人血清存在下與人CD40結合，且結合速率(on rate)降低二倍以下。本發明的抗體的特徵還在於，該抗體在哺乳動物中在lmg/kg的濃度抑制IgM及IgG產生。本發明的抗體可用於各種治療性方法、預防性方法、診斷性方法及其他方法中。舉例而言，本發明闡述在哺乳動物中阻斷人CD40的功能的方法，其包括向該哺乳動物給予包含本發明的抗體的組合物，該抗體的量足以在該哺乳動物中阻斷CD40介導的免疫應答。本文還包括一種治療或改善哺乳動物的移植物抗宿主病的方法，其包括向該哺乳動物給予包含本發明的抗體的組合物，該抗體的量足以在該動物中減少移植物抗宿主病的一或多個症狀。例如，自身免疫性或炎性疾病可包括(但不限於)類風溼性關節炎、多發性硬化、增生性狼瘡性腎小球腎炎、炎性腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、節段性迴腸炎(Crohn’s Disease)及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病(Graves disease)、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性心炎、艾迪生氏病(Addison’s disease)、過早絕經、I型糖尿病、古德帕斯丘氏(Good pastures』 s)症候群、重症肌無力、自身免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、Sjogren氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。在示例性實施方案中，哺乳動物患有類風溼性關節炎。本發明方法還可包括給予選自以下的第二治療藥物TNF拮抗劑、疾病緩解抗風溼藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗CD20mAb。在具體實施方案中，炎性疾病或自身免疫性疾病為與表達CD40及CD20 二者的細胞有關的炎性疾病或自身免疫性疾病。 在具體實施方案中，治療涉及通過腸胃外給予途徑給予抗體組合物。在具體實施方案中，治療涉及以靜脈內或皮下方式給予抗體組合物。
本發明其他方法包括在人患者中抑制B細胞產生抗體,其包括向該人患者給予有效量的本發明的抗-CD40抗體。更具體而言，人患者患有與表達CD40的細胞有關的炎性疾病或自身免疫性疾病。·
在示例性實施方案中，人患者患有選自自身免疫性或炎性疾病的自身免疫性疾病，該自身免疫性或炎性疾病選自類風溼性關節炎、多發性硬化、增生性狼瘡性腎小球腎炎、炎性腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、節段性迴腸炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、I型糖尿病、古德帕斯丘氏症候群、重症肌無力、自身免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、Sjogren氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。本發明另一方法涉及抑制表達人⑶40抗原的細胞的生長，其包括向所述細胞給予本發明的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原的結合抑制所述細胞的生長或分化。還包括一種治療患有CD40相關的病症的個體的方法，其包括向該個體給予本發明的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人CD40特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與CD40的結合抑制CD40相關的病症細胞的生長或分化。所述細胞可為(但不限於)B淋巴樣幹細胞(lymphoblastoid cells)、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。抑制細胞生長或分化的治療方法可用於治療慢性淋巴細胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma)、霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血怔(Waldenstrom’s macroglobul inemia)或卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma； 還包括一種誘導清除外周B細胞的方法，其包括向所述細胞給予本發明的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原的結合誘導清除所述細胞。在具體實施方案中，將抗體或抗原結合片段給予患有免疫病症的個體。舉例而言，該免疫病症為類風溼性關節炎或全身性紅斑狼瘡。還包括ー種治療個體的類風溼性關節炎的方法，其包括向該個體給予本發明的抗體，其中該抗體為在該個體中阻斷CD40功能的拮抗性抗體。優選地，以在個體中有效抑制B細胞分化及抗體同種型轉換的量給予該抗體。在其他實施方案中，以在該個體的T細胞及巨噬細胞中有效抑制細胞因子和趨化因子的產生以及黏著分子的上調的量給予該抗體。優選地，以在該個體中有效抑制樹突細胞活化的量給予該個體。在其他實施方案中，該方法的特徵還在幹，以在該個體的非免疫細胞中可有效抑制促炎症細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素的產生及黏著分子的下調的量給予該抗體。在具體實施方案中，該抗體與包含給予甲氨喋呤和/或給予Enbrel/Humira的方
案組合給予。
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接受該療法的個體是患有類風溼性關節炎且對單獨的甲氨喋呤治療無反應者。在具體實施方案中，該方法包括用包含給予甲氨喋呤和/或給予Enbrel/Humira的方案治療該個體。本發明方法的特徵還在於，用該拮抗性抗-CD40抗體治療該個體的功效優於使用單獨的甲氨喋呤、單獨的Enbrel、Enbrel+甲氨喋呤的組合來治療。本發明方法的特徵還在於，用該拮抗性抗-CD40抗體治療該個體的功效在對甲氨喋呤無充分反應的患者中優於使用Enbrel+MTX的治療。在具體實施方案中，該抗體與包含抗TNF藥物的方案組合給予。在具體實施方案中，可將個體描述為患有類風溼性關節炎且對使用単獨的抗TNF藥物的治療無反應者。在所述實施方案中，該方法可包含用包含以抗TNF藥物以及該拮抗性抗-CD40抗體治療的方案治療該個體。在具體實施方案中，用該拮抗性抗-CD40抗體治療該個體的功效優於用抗TNF藥物治療。在其他實施方案中，該方法的特徵在於，用該拮抗性抗-CD40抗體治療該個體的功效在對單獨的抗TNF藥物無充分反應的患者中優於用Orencia或Rituxan治療。本發明還包括藥物組合物，其包含(i)本文所述抗體或抗原結合片段 '及(ii)藥學上可接受的賦形劑。在所述組合物中，抗體或其抗原結合片段可有利地與第二藥物(例如細胞毒性劑、PEG載體、酶或標記物)綴合。本文還包括編碼以下中的任一者的重鏈可變區胺基酸序列的分離的多核苷酸SEQ ID NO: I 至 4、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60,SEQ IDN0:61、SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72 或 SEQID N0:73。本文還包括編碼以下中的任一者的輕鏈可變區胺基酸序列的分離的多核苷酸SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:36,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或 SEQ IDNO:76。本發明另外涉及本文所述抗體在製備在哺乳動物中阻斷人CD40功能的藥物中的用途，其中該藥物在該哺乳動物中阻斷CD40介導的免疫應答。在一實施方案中，本發明涉及製備用於治療或改善哺乳動物的移植物抗宿主病的藥物。在示例性實施方案中，製備該藥物用於治療選自以下的自身免疫性或炎性疾病類風溼性關節炎、多發性硬化、增生性狼瘡性腎小球腎炎、炎性腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、節段性迴腸炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、I型糖尿病、古德帕斯丘氏症候群、重症肌無力、自身免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、Sjogren氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。在一些實施方案中，該藥物還可包含選自以下的第二治療藥物TNF拮抗劑、疾病緩解抗風溼藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗⑶20mAb。 可製備該藥物以供用於腸胃外給予途徑。可製備該藥物以供靜脈內或皮下使用。另ー實施方案涵蓋本文所述抗體在製備在人患者中抑制B細胞產生抗體的藥物中的用途。另ー實施方案涵蓋本文所述抗體在製備抑制表達人⑶40抗原的細胞的生長和/或分化的藥物中的用途。另ー實施方案涵蓋本文所述抗體在製備治療患有CD40相關的病症的個體的藥物中的用途，其中該藥物中抗體或抗原結合片段與CD40的結合抑制CD40相關的病症細胞的生長或分化。可製備該藥物以供用於治療CD40相關的病症中選自以下的細胞B淋巴樣幹細胞、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。可製備該藥物以供用於治療慢性淋巴細胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或卡波西氏肉瘤。另ー實施方案包括本發明的抗體在製備誘導清除外周B細胞的藥物中的用途，其中該藥物中的抗體或抗原結合片段與人細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原的結合誘導清除所述細胞。可製備該藥物以供用於治療患有免疫病症的個體。可製備該藥物以供用於治療類風溼性關節炎或全身性紅斑狼瘡。另ー實施方案包括本發明的抗體在製備治療個體的類風溼性關節炎的藥物中的用途。可製備該藥物以供用於在該個體中抑制B細胞分化及抗體同種型轉換。可製備該藥物以供用於在該個體的T細胞及巨噬細胞中抑制細胞因子及趨化因子的產生及黏著分子的上調。可製備該藥物以供用於在該個體中抑制樹突細胞活化。可製備該藥物以供用於在該個體的非免疫細胞中抑制促炎症細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素的產生及黏著分子的下調。在某些實施方案中，將該藥物製備為組合藥物，以與包含給予甲氨喋呤和/或給予Enbrel/Humira的方案組合給予。在其他實施方案中，將該藥物製備為組合藥物，且該藥物除包含本發明的抗體外還包含抗TNF藥物。


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圖I :A :人源化抗體對經CD40轉染的HEK-293細胞的結合曲線及相應的EC50值，通過流式細胞計數法所測量。B :抗體A、抗體B及抗體C與經⑶40轉染的HEK細胞的結合的比較，通過流式細胞計數法所測量。顯示的為ー個實驗的代表性數據。圖2 :人源化抗體對RAMOS細胞的結合曲線及相應的EC50值，通過流式細胞計數法所測量。顯示的為ー個實驗的代表性數據。圖3 :小鼠及人源化抗體的拮抗活性在人原代B細胞増殖分析中的測試。㈧顯示的為對於每種小鼠前體抗體的代表性抗體滴定曲線及所得的IC50值。顯示的為ー個供體的代表性數據。(B)顯示的為多種人源化抗-CD40抗體與4D11相比的拮抗作用的抑制曲線的疊加。圖4 :在人原代B細胞増殖分析中人源化抗體的拮抗性(IC50)及激動性(SI=刺激指數)活性的測試結果的總結。顯示多種抗-⑶40抗體、4D11、G28. 5及OT12以供比較。圖5 :在人全血分析中測試抗體B、抗體A及抗體C對⑶40誘導的⑶86上調的抑制。顯示4D11抗-⑶40抗體以供比較。IgGl同種型對照在此分析中顯示無效應。顯示的為ー個供體的代表性數據。圖6 :在人純化B細胞上及人全血中測試抗體B對⑶40誘導的⑶86上調的抑制的結果的總結。顯示的為在(A)IC50及(B)IC90兩點的數據。IgGl同種型對照在任一分析中皆顯示無效應。表中總結了多個供體(n=4-5)的數據。圖7 :在短尾猴全血分析中測試抗體B、抗體A及抗體C對⑶40誘導的⑶86上調的抑制。IgGl同種型對照在此分析中顯示無效應。顯示的為ー個供體的代表性數據。圖8 :在給予lmg/kg及IOmg/kg的每種抗體後，抗體A(左圖)及抗體B(右圖)在短尾猴中的血漿濃度時間曲線。數據為每種抗體給予3個動物的歸納。圖9 :來自短尾猴的CD86陽性B細胞在給予(抗體B)及(抗體A)之前及在用每種抗體處理後的3個時間點的百分比變化。抗體B(上圖)及抗體A為各自以lmg/kg (左圖)或10mg/kg(右圖)給予3個動物。圖10 :在注射I. 25x IO6人PBMC後2周NSG小鼠中的(A)人IgG及(B)人IgM的含量。在轉移人PBMC之前一天以lmg/kg的劑量用載體、同種型對照及抗體(抗體A、抗體B及抗體C)處理小鼠。圖11 :各種小鼠抗人⑶40抗體與人血小板的結合。圖12 :抗體B與抗-⑶40mAb 4D11在全血中的人B細胞及血小板上進行結合對比
的結果總結。圖13 :野生型及剔除IgGl構建體的ADCC活性。發明詳述現已公認CD40介導的信號傳導參與多種目標病症。儘管可獲得許多臨床前數據顯示在所述病症中的幹預將在治療上有益，但業內仍需要可用於治療自身免疫性疾病的拮抗性抗-CD40抗體。本發明的優選實施方案涉及識別CD40的人源化抗體。在具體實施方案中，己基於某些主要小鼠抗體的序列確定了所述人源化抗體的序列。術語「⑶40」及「⑶40表面抗原」是指在正常及腫瘤性B細胞表面上表達的約48kD糖蛋白，其用作參與細胞增埴及分化的信號的受體(Ledbetter等人，1987,J. Immunol. 138:788-785)。已自文庫分離編碼⑶40的cDNA分子,該文庫自伯基特淋巴瘤細胞系 Raji 製備(Stamenkovic 等人，1989, EMB0J. 8:1403)。本文所用內源性表達⑶40的細胞系特徵為表面表達⑶40的任何細胞，包括(但不限於)正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌瘤細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞及來自骨髓的漿細胞。在一些實施方案中，CD40分子為人CD40分子。本發明的抗體與人重組及天然⑶40特異性結合。人源化單克隆抗體(其中該抗體與人CD40特異性結合)，其在B細胞增殖中具有IC50小於InM的拮抗活性且在高達100yg/ml的濃度不具有激動作用，且其中該抗體的特徵還在於，該抗體在非人靈長類中的活體內半衰期為至少10天。優選地，抗體與⑶40在⑶40-Fc綴合物中以小於InM的EC50特異性結合，且與CD40在表達CD40的細胞中以小於2. 5nM的EC50特異性結合。抗體的拮抗性特性定義為其B細胞或樹突細胞拮抗活性IC50小於InM。抗體還具有較優藥物代謝動力學特性，其活體內半衰期相比於其他抗-CD40抗體(例如，抗-CD40抗體4D11)有所延長。本文所用表達⑶40的細胞系特徵為表面表達⑶40的任何細胞，包括(但不限於)正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌瘤細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞及來自骨髓的漿細胞。在一些實施方案中，CD40分子為人CD40分子。本發明的抗體識別特異性「⑶40抗原表位」及「⑶40表位」。這些本文所用所述術語是指能與抗-CD40抗體具有免疫反應性的分子(例如，肽)或分子片段，且包括(例如)可由具有以下重鏈/輕鏈序列組合的任一抗體識別的CD40抗原決定簇輕鏈SEQ IDNO: 26與重鏈SEQ ID NO: 27、28、29或30中的任一者；或輕鏈SEQ ID NO: 31與重鏈SEQ IDN0:32、33、34 或 35 中的任一者；或輕鏈 SEQ ID NO: 36 與重鏈 SEQ ID NO: 37、38、39 或 40 中的任一者。CD40抗原表位可包括在蛋白、蛋白片段、肽或類似物中。最常見表位為蛋白、短寡肽、寡肽模擬物(即，模擬CD40抗原的抗體結合特性的有機化合物)或其組合。抗體或免疫球蛋白的一般化結構為本領域技術人員所熟知，所述分子為通常為約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成。每個輕鏈通過ー個ニ硫鍵與重鏈共價連接而形成異ニ聚體，且異四聚分子為經由異ニ聚體中兩個相同重鏈之間的共價ニ硫鍵來形成。儘管輕鏈及重鏈通過一個ニ硫鍵連接在一起，但兩個重鏈之間的ニ硫鍵數可隨免疫球蛋白同種型而變。每一重鏈及輕鏈亦具有規則間隔的鏈內ニ硫鍵。每一重鏈在氨基末端具有可變域(Vh)，之後為三個或四個恆定域(CH1、CH2、CH3及Ch4)，以及Chi與Ch2之間的鉸鏈區。每ー輕鏈具有兩個域，即氨基末端可變域及羧基末端恆定域(C1)。\域與Vh域非共價結合，而Clj域一般經由ニ硫鍵與Cm域共價連接。人們相信，特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成接ロ(Chothia等人，1985，J. Mol. Biol. 186:651-663)。在不同抗體之間，可變域內的某些域廣泛不同，即具有「超變性」。所述超變域含有直接參與每一特定抗體與其特異性抗原決定簇的結合及特異性的殘基。輕鏈可變域與重鏈可變域二者中的超變性均集中於三個稱作互補決定區(CDR)或超變環(HVL)的區段中。CDR在以下文獻中通過序列對比來定義Kabat等人，1991, Sequences of Proteinsof Immunological Interest,弟 5 te, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.;而HVL根據可變域的三維結構在結構上定義，如Chothia及Lesk,1987，J. Mol. Biol. 196 =901-917中所述。其中該兩種方法使得⑶R的鑑定略有不同，結構定義是優選的。如由Kabat所定義，在輕鏈可變域中，⑶R-Ll大致位於殘基24-34處，⑶R-L2大致位於殘基50-56處，且⑶R-L3大致位於殘基89-97處；在重鏈可變域中，⑶R-Hl大致位於殘基31-35處，⑶R-H2大致位於殘基50-65處，且⑶R-H3大致位於殘基95-102處。重鏈及輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3由此界定了對於給定抗體具有特異性的獨特功能特性。每一重鏈及輕鏈內的三個⑶R為由框架區(FR)來間隔，框架區含有可變性通常較低的序列。自重鏈及輕鏈可變域的氨基末端至羧基末端，FR及CDR以以下順序排列FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3及FR4。FR的較大β -摺疊構型使每ー鏈內的⑶R彼此緊鄰且與另ー鏈中的⑶R緊鄰。所得構象有助於抗原結合位點(參見Kabat等人，1991，NIH Publ.第91-3242號，第I卷，第647-669頁)，但並非所有⑶R殘基皆必須直接參與抗原結合。FR殘基及Ig恆定域並不直接參與抗原結合，但有助於抗原結合和/或介導抗體效應子功能。人們認為，ー些FR殘基以至少三種方式對抗原結合產生顯著效應直接與表位非共價結合，與一或多個CDR殘基相互作用，及影響重鏈及輕鏈之間的接ロ。恆定域並不直接參與抗原結合，但介導各種Ig效應子功能，例如介導抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。可基於恆定域的胺基酸序列將脊椎動物免疫球蛋白的輕鏈分配至兩個顯著不同的種類(卡帕(K)及蘭布達(λ))中的ー類。通過比較，根據恆定域的序列將哺乳動物免疫球蛋白的重鏈分為以下五個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。將IgG及IgA進ー步分為亞類(同種型)，例如IgG1,IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白種類的重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、Y及μ。各天然免疫球蛋白種類的亞單元結構及三維構型為人所熟知。本文所用術語「抗體」、「抗-⑶40抗體」、「人源化抗-⑶40抗體」及「變體人源化抗-CD40抗體」具有最廣泛含義且具體涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及表達期望生物學活性(例如CD40結合)的抗體片段(例如可變域及抗體的其他部分)。術語「單克隆抗體」(mAb)是指基本上均質的抗體群中的抗體，即該群中的個別抗體除可能少量存在的天然突變外均相同。單克隆抗體針對單一抗原決定簇(即「表位」)具有高度特異性。因此，修飾詞「單克隆」指示基本上均質且針對相同表位的抗體群，且不應理解為需要通過任何特定方法來產生該抗體。應理解，單克隆抗體可通過業內已知的任何技術或方法來製備；包括(例如)雜交瘤方法(Kohler等人,1975, Nature 256:495),或業內已知的重組DNA方法(例如，參見美國專利第4，816，567號)，或使用噬菌體抗體文庫通過以下文獻中所述技術分離以重組方式產生的單克隆抗體的方法Clackson等人，1991，Nature 352 :624-628 ;及 Marks 等人，1991，J. Mol. Biol. 222 :581_597。嵌合抗體為由來自ー個物種(例如，非人哺乳動物，例如小鼠)的抗體重鏈及輕鏈可變區及另一物種(例如，人)抗體的重鏈及輕鏈恆定區組成，且可通過以下方式來獲得連接來自第一物種(例如，小鼠)的編碼抗體可變區的DNA序列與來自第二物種(例如人)的編碼抗體恆定區的DNA序列，並用含有所述經連接序列的表達載體轉化宿主，從而使其可產生嵌合抗體。或者，嵌合抗體中，重鏈和/或輕鏈中的一或多個區域或域亦可與來自另ー免疫球蛋白種類或同種型的單克隆抗體中的對應序列相同、同源或為其變體、或來自共有序列或種系序列。嵌合抗體可包括所述抗體的片段，條件是抗體片段表現出其親代抗體的期望生物學活性，例如與相同表位結合(例如，參見美國專利第4，816，567號 '及Morrison 等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855)。術語「抗體片段」、「抗-⑶40抗體片段」、「人源化抗-⑶40抗體片段」、「變體人源化抗-CD40抗體片段」是指全長抗-CD40抗體的一部分，其中保留可變區或功能能力，例如特異性CD40表位結合。抗體片段的實例包括(但不限於)Fab、Fab』、F (ab』)2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體、單鏈抗體、微抗體(minibody)、自抗體片段形成的雙鏈抗體及自抗體片段形成的多特異性抗體。可用例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶處理全長抗體以生成可用抗體片段。使用木瓜蛋白酶消化來產生兩個相同的稱作「Fab」片段的抗原結合抗體片段(各自具有単一抗原結合位點)及殘留的「 Fe」片段。Fab片段亦含有輕鏈恆定域及重鏈Chi域。胃蛋白酶處理產生F(ab』)2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能交聯抗原。Fab』片段與Fab片段的不同之處在於在Cm域的C末端存在額外殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸。F(ab』)2抗體片段為通過鉸鏈區中的半胱氨酸殘基連接的Fab』片段對。亦已知抗體片段的其他化學偶聯。「Fv」片段含有完整抗原識別及結合位點，該位點為由ー個重鏈可變域與一個輕鏈可變域呈緊密非共價連接的ニ聚體組成。在此構型中，每一可變域的三個⑶R相互作用，從而在該VH-\ ニ聚體的表面上界定抗原結合位點。該六個CDR共同賦予該抗體抗原結合特異性。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段為包含抗體Vh及\域的單鏈Fv變體，其中所述域存在於單ー多肽鏈中。單鏈Fv能識別並結合抗原。scFv多肽亦可任選含有位於Vh域與Vlj域之間的多肽接頭，以促進scFv形成用於抗原結合的期望三維結構(例如,參見Pluckthun,1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies,弟 113 巷，Rosenburg 及 Moore編輯，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁)。其他已知的抗體片段包括那些包含一對串聯的Fd區段(Vh-Chi-Vh-Chi)以形成一對抗原結合區的抗體片段。所述「線性抗體」可為雙特異性或單特異性，如(例如)Zapata等人，1995，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 中所述。人源化抗體或人源化抗體片段為特定類型的嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變體或其片段，其能結合預定抗原，且其包含一或多個基本上具有人免疫球蛋白胺基酸序列的FR及一或多個基本上具有非人免疫球蛋白胺基酸序列的CDR。此非人胺基酸序列通常稱作「輸入」序列，通常取自「輸入」抗體域，尤其是可變域。通常，人源化抗體至少包括非人抗體的CDR或HVL，插入人重鏈或輕鏈可變域的FR之間。本發明闡述特定人源化抗-CD40抗體，其含有表3及4所示源自鼠類單克隆抗體的CDR插入人種系序列重鏈及輕鏈可變域的FR之間。應理解，某些鼠類FR殘基可能對人源化抗體的功能重要，且因此將修飾某些人種系序列重鏈及輕鏈可變域殘基，以與對應鼠類序列中的那些相同。在另一方面中，人源化抗-⑶40抗體基本上包含所有至少ー個(通常兩個)可變域(例如含於例如Fab、Fab』、F (ab』)2、Fabc及Fv片段中者)，其中所有或基本上所有⑶R對應於非人免疫球蛋白的CDR，且在本文中特別是所有CDR為本文下表I至4中所詳述的鼠類序列，且所有或基本上所有FR為人免疫球蛋白共有序列或種系序列的FR。在另一方面中，人源化抗-⑶40抗體亦包括免疫球蛋白(通常為人免疫球蛋白)Fc區的至少一部分。通常，抗體含有輕鏈以及至少重鏈可變域二者。若適宜，抗體亦可包括重鏈Cm、鉸鏈、CH2、CH3和/或Ch4區中的一或多者。 人源化抗-CD40抗體可選自任ー種類免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任一同種型(包括IgG1UgG2. IgG3、IgG4, IgA1及IgA2)。舉例而言，恆定域可為補體固定的恆定域，其中期望人源化抗體表現細胞毒性活性，且同種型通常為IgG115倘若不期望該細胞毒性活性，則恆定域可為另一同種型，例如IgG2。替代性人源化抗-CD40抗體可包含來自不止ー種免疫球蛋白種類或同種型的序列，且本領域技術人員可熟練選擇特定恆定域來優化所期望的效應子功能。在具體實施方案中，本發明所提供抗體為IgGl抗體，且更具體而言為剔除效應子功能的IgGl抗體。人源化抗-⑶40抗體的FR及⑶R或HVL不需要與親代序列精確對應。舉例而言，可通過取代、插入或缺失來改變(例如，誘變處理)輸入⑶R或HVL或共有FR或種系FR序列中的一或多個殘基，從而使得所得胺基酸殘基與任ー親代序列中對應位置的原始殘基不再相同，但抗體仍保留與CD40結合的功能。該改變通常可並非廣泛改變且可為保守改變。通常，至少75%人源化抗體殘基可與親代共有FR或種系FR及輸入⑶R序列中的那些殘基對應，更通常有至少90%、且最通常有超過95%或超過98%或超過99%的殘基對應。影響重鏈與輕鏈可變區之間的接ロ(「\-VH接ロ」)的免疫球蛋白殘基為那些影響兩條鏈相對於彼此接近或定向的殘基。某些可能參與鏈間相互作用的殘基包括\殘基34、36、38、44、46、87、89、91、96 及 98 以及 Vh 殘基 35、37、39、45、47、91、93、95、100 及 103 (採用Kabat^人，sequences of Proteins of Immunologica丄 Interest (National Institutesof Health, Bethesda, Md.，1987)中所述的編號系統)。美國專利第6，407，213號亦論述，例如\殘基43及85以及Vh殘基43及60等殘基亦可能參與此相互作用。儘管僅針對人IgG闡述所述殘基，但其亦適用於其他物種。選擇合理地預期參與鏈間相互作用的重要抗體殘基用於共有序列中的取代。術語「共有序列」及「共有抗體」是指在任一特定種類、同種型或亞單元結構的所有免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白可變域)中的每一位置包含最常出現的胺基酸殘基的胺基酸序列。共有序列可基於特定物種或多個物種的免疫球蛋白。「共有」序列、結構或抗體可理解為涵蓋某些實施方案中所述的共有人序列，且是指在任一特定種類、同種型或亞単元結構的所有人免疫球蛋白中的每一位置包含最常出現的胺基酸殘基的胺基酸序列。因此，共有序列所含有的胺基酸序列在每一位置具有存在於ー或多種已知免疫球蛋白中的胺基酸，但其可能並不精確複製任一単一免疫球蛋白的整個胺基酸序列。可變區共有序列並非自任何天然產生的抗體或免疫球蛋白及其變體均可獲得(Kabat等人，1991, Sequencesof Proteins of Immunological Interest,弟 5 te, Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.)。重鏈及輕鏈共有序列及其變體的FR為人源化抗-⑶40抗體的製備提供可用序列。例如，參見美國專利第6，037，454號及第6，054，297號。人種系序列天然存在於人種群中。所述種系基因的組合產生抗體多祥性。抗體輕鏈的種系抗體序列來自保守人種系K或λ V-基因及j-基因。類似地，重鏈序列來自種系v_、d_及 i__因(LeFranc,M_P及LeFranc,G,「The Immunoglobulin Facts Book^AcademicPress,2001)。本文所用「變體」、「抗-⑶40變體」、「人源化抗-⑶40變體」或「變體人源化
抗-⑶40」各自是指人源化抗-⑶40抗體，其至少具有來自SEQ ID N0:1至4中任一序列的重鏈可變鼠類⑶R，或源自SEQ ID N0:5至SEQ ID NO:8中任一者所示的鼠類單克隆抗體的輕鏈鼠類CDR序列，及源自人共有序列的FR序列。變體包括那些在輕鏈或重鏈可變域的一者或兩者中具有一或多處胺基酸變化的變體，條件是所述胺基酸變化不會實質上損害抗體與⑶40的結合。本文所產生的示例性人源化抗體包括那些稱為抗體A、抗體B及抗體C的抗體，且其各重鏈及輕鏈序列顯示於SEQ ID N0:26至SEQ ID N0:40中。「分離的」抗體為已經鑑定且已自其天然環境組分中分離和/或回收的抗體。抗體天然環境中的汙染物組分為那些可幹擾抗體的診斷性或治療性應用的物質，且可為酶、激素或其他蛋白性或非蛋白性溶質。在一方面中，可將抗體純化至以抗體重量計分離度至少大於95%。由於抗體天然環境中的至少ー種組分不會存在，故分離的抗體包括產生其的重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常可通過至少ー個純化步驟來製備，其中移除了重組細胞物質。術語「抗體性能」是指有助於抗體識別抗原或者抗體活體內效カ的因素。抗體胺基酸序列的變化可影響例如摺疊等抗體特性，且可影響例如以下的物理因素抗體與抗原結合的初始速率CO、抗體與抗原的解離常數(kd)、抗體對抗原的親和常數(Kd)、抗體構象、蛋白穩定性及抗體半衰期。本文所用術語「表位標記的」是指抗-⑶40抗體與「表位標籤」融合。「表位標籤」為具有足量胺基酸以為抗體產生提供表位的多肽，且其經設計以使得其不幹擾人源化抗-⑶40抗體的期望活性。表位標籤通常具有充分獨特性以使得針對該表位標籤產生的抗體基本上不會與其他表位交叉反應。適宜的標籤多肽一般含有至少6個胺基酸殘基且通常含有約8至50個胺基酸殘基或約9至30個殘基。表位標籤及結合表位的抗體的實例包括流感 HA 標籤多肽及其抗體 12CA5 (Field 等人，1988 Mol. Cell. Biol. 8 :2159-2165) ；c-myc標籤及其 8F9、3C7、6E10、G4、B7 及 9E10 抗體(Evan 等人，1985，Mol. Cell. Biol. 5(12)3610-3616);及單純皰疫病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體(Paborsky等人，1990, ProteinEngineering 3(6) :547-553)。在某些實施方案中，表位標籤為「補救受體結合表位」。本文所用術語「補救受體結合表位(salvage receptor binding epitope) 」是指IgG分子(例如IgG1. IgG2, IgG3或IgG4)Fe區中的表位，其負責延長IgG分子的活體內血清半衰期。在一些實施方案中，本發明的抗體可與細胞毒性劑綴合。細胞毒性劑為抑制或阻止細胞機能和/或引起細胞破壞的任何物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90及Re186)、化學治療藥物及毒素(例如細菌、真菌、植物或動物源酶活性毒素)及其片段。所述細胞毒性劑可通過標準操作與本發明的人源化抗體偶聯，且其可用於(例如)治療適用抗體療法的患者。「化學治療藥物」為可用於治療癌症的化學化合物。化學治療藥物有多種實例可與本發明治療性抗體綴合。所述化學治療藥物的實例包括烷化劑，例如噻替哌(thiotepa)及環磷醯胺；磺酸燒基酯,例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳，例如苯並多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、meturedopa
17CN 102918063 A
書
明
說
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及uredopa ;亞乙基亞胺及甲基密胺，包括六甲密胺(altretamine)、三亞乙基密胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫化磷醯胺及三羥甲基密胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其為布拉他辛(bulIatacin)及布拉他辛酮(bulIatacinone));喜樹減(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan));苔蘚抑制素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)) ；cryptophycin(尤其為 cryptophycin I 及 cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin) ;auristatin (包括類似物單甲基-auristatin E及單甲基-auristatin F);多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物 KW-2189 及 CBI-TMI);艾植素(eleutherobinノ ；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ；氣芥類，例如苯·丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯憐酸胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異憐酉先月安(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸羊し ^ (mechlorethamine oxide hydrochlorideノ、美法侖 uneiphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和烏拉莫司汀(uracil mustard)；硝基脲類，例如卡莫司汀(carmustine)、氯服菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫斯汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，例如烯ニ炔(enediyne)抗生素(例如剌孢黴素(calicheamicin)，尤其是剌孢黴素Y II和剌孢黴素 φ ，參見例如 Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186) ；dynemicin,包括dynemicin A ;ニ膦酸鹽，例如氯膦酸鹽(clodronate);埃斯培拉黴素(esperamicin);新抑癌蛋白生色團(neocarzinostatin chromophore)和相關色蛋白烯ニ炔抗生素生色團U^elated chromoprotem enediyne antibiotic chromophore)、ac_Lacinomysin^|、^>fe胃素(actinomycin)、authramycin、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、carabicin、Yギ紅黴素、carminomycin)、嗜癌4素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6_ 重 SI 基 _5_ 氧代-L-正殼氛酸(6_diazo_5_oxo_L_norleucine)、多柔比星(Adriamycin )(包括嗎啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基嗎啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-卩比咯啉子基-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcelIomycin)、絲裂黴素(mitomycin)類例如絲裂黴素 C (mitomycin C)、麥考酌·酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porf iromycin)、票羅黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);抗代謝物，例如甲氨噪呤(methotrexate)和5_氟尿啼卩定(5-fluorouracil) (5-FU);葉酸類似物，例如ニ甲葉酸(denopterin)、甲氨噪呤、噪羅呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤類似物，例如氟達拉濱(f Iudarabine)、6_ 疏票呤(6-mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)和硫鳥卩票呤(thioguanine);啼卩定類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、
186-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、ニ脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、伊諾他濱(enocitabine)和氟尿苷(fIoxuridine);雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸甲雄焼酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)和睪內酯(testolactone);抗腎上腺素藥(anti-adrenal)，例如氨魯米特(aminoglutethimide)、米託坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，例如亞葉酸(frolinicacid);醋葡醒內酯(aceglatone);醒磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唳(eniluracil);安 B丫唳(amsacrine)；bestrabucil ;比生群(bisantrene);伊達曲殺(edatraxate);地憐酸胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine);地卩丫醌(diaziquone) ；elfornithine ;依利醋銨(elliptiniumacetate);埃坡黴素(epothilone);依託格魯(etoglucid);硝酸嫁(gallium nitrate)；輕基脲(hydroxyurea);香燕多糖(Ientinan);氯尼達明(Ionidainine);美登醇(maytansinoid)類，例如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米託胍月示(mitoguazone);米 f七恩酉昆(mitoxantrone) ;mopidanmol ;ネ艮;Γ留菌齊[J ^nitraerine)；噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽酉昆(Iosoxantrone);鬼曰酸(podophyllinic acid) ;2_ 乙基月井(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine) ; PSK雷佐生(razoxane);根黴素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);錯螺胺(spirogermanium);細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺酉昆(triaziquone) ;2，2，，2，，-三氯三乙胺(2，2，，2，，-trichlorotriethylamine);單端抱黴烯(trichothecene)(尤其是 T-2 毒素、verracurin A、杆抱菌素 A(roridin A)和anguidine);烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ;ニ溴甘露醇(mitobronitol) ;ニ溴衛矛醇(mitolactol);溴丙哌嗪(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) ( 「Ara_C」)；環憐酸胺；塞替派；紫杉焼(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel) ( TAXOL' ，Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, N. J.)及多西紫杉醇(doxetaxel) ( TAXOTERE' ，Rhone-PoulencRorer，Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine) (Gemzar ) ;6_ 硫鳥卩票呤；巰基票呤；甲氨噪呤；鉬類似物，例如順鉬(cisplatin)及卡鉬(carboplatin);長春鹼(vinblastine);鉬；依託泊苷(etoposide) (VP-16);異磷醯胺；米託蒽醌；長春新鹼(vincristine);長春瑞濱(vinorelbine) (Navelbine );諾安託(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依達曲沙(edatrexate);道諾黴素(daunomycin);氨蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda);伊班膦酸鹽(ibandronate) ；CPT-II ;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;ニ氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine);及上述藥物中任一者的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括 Nolvadex )、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY 117018、奧那司麗(onapristone)及託瑞米芬(toremifene) (Fareston );抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中雌激素的產生，例如4(5)-咪唑、胺魯米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate) (Megace )、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(Rivisor )、來曲唑(Ietrozole) (Femara )及阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex );及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)及戈舍瑞林(goserelin);及上述藥物中任一者的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。所述藥物中的任何一或多者可與本發明的人源化抗體綴合以提供可用於治療各種病症的治療藥物。亦可使抗體與前藥綴合。「前藥」為藥物活性物質的前體或衍生物形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小，且能酶促活化或轉化為活性更強的形式。例如，參見 Wilman, 1986，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」，BiochemicalSociety Transactions,14,第 375-382 頁，615th Meeting Belfast ；及 Stella 等人，1985, 「Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，，，Directed DrugDelivery,Borchardt等人(編輯)，第247-267頁,Humana Press。可用的前藥包括(但不限於)含有磷酸根的前藥、含有硫代磷酸根的前藥、含有硫酸根的前藥、含有肽的前藥、經D-胺基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含有內醯胺的前藥、含有任選經取代的苯氧基こ醯胺的前藥及含有任選經取代的苯基こ醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶前藥及其他5-氟尿苷前藥，其可轉化成具有更高活性的無細胞毒性藥物。可衍生為前藥形式的細胞毒性藥物的實例包括(但不限幹)那些上文所述的化學治療藥物。出於診斷性以及治療性監測目的，亦可使本發明的抗體與標記(単獨的標記或者標記與另外的第二藥物(前藥、化學治療藥物等))綴合。標記與其他第二藥物不同，其是指可檢測的化合物或組合物藥物，且其可與本發明的人源化抗體直接或間接綴合。標記本身可被可檢測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記情況下，標記可催化底物化合物或組合物發生可檢測的化學變化。可製備經標記人源化抗-CD40抗體並用於各種應用中，包括體外及活體內診斷學。可將本發明的抗體調配為脂質體製劑的一部分以實現其活體內遞送。「脂質體」為由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡。脂質體可用於向哺乳動物遞送化合物或調配物，例如本文所公開的人源化抗-CD40抗體，該抗體任選與ー或多種藥物活性藥物和/或標記偶聯或組合。脂質體的組分通常以雙層結構排列，此與生物膜的脂質排列類似。本發明某些方面涉及分離的核酸，其編碼本發明的人源化抗體的一或多個域。「分離的」核酸分子為自至少ー種汙染物核酸分子鑑定並分離的核酸分子，其在抗體核酸的天然來源中通常與該汙染物核酸分子相結合。分離的核酸分子與存在於天然細胞中的核酸分子不同。在本發明各方面中，重組表達人源化抗體的一或多個域。該重組表達可採用一或多種控制序列，即在特定宿主有機體中表達可操作連接的編碼序列所需的多核苷酸序列。適用於原核細胞中的控制序列包括(例如)啟動子、操縱子及核糖體結合位點序列。真核控制序列包括(但不限幹)啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。所述控制序列可用於在原核及真核宿主細胞中表達及產生人源化抗-⑶40抗體。在使核酸序列與另ー核酸序列具有功能性聯繫時，該核酸序列經「可操作連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列表達為參與多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌前導序列與編碼該多肽的核酸可操作連接；若啟動子或增強子影響該序列的轉錄，則該啟動
20子或增強子與該序列可操作連接；或若核糖體結合位點的定位可促進翻譯，則該核糖體結合位點與該編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接」意指所連接DNA序列為鄰接序列，且在分泌前導序列情形下為鄰接序列且位於閱讀框內。然而，增強子任選鄰接。可通過在便捷的限制位點處接合來完成連接。若不存在所述位點，則可使用合成寡核苷酸銜接子或接頭。
本文所用措辭「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有所述名稱皆包括其子代。因此，「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及其衍生的培養物而不考慮轉移次數。用於治療目的的術語「哺乳動物」是指任何歸類為哺乳動物的動物，包括人、家畜及農場動物，以及動物園動物、運動用動物或寵物，例如狗、馬、貓、牛等。優選地，哺乳動物為人。本文所用「病症」為可受益於使用本文所述人源化抗-CD40抗體治療的任何病況。該術語包括慢性及急性病症或疾病，包括那些使哺乳動物易患所述病症的病理學病況。本文欲治療的非限制性實例或病症包括癌症、血液惡性腫瘤、良性及惡性腫瘤、白血病及淋巴惡性腫瘤以及炎性、血管生成性、自身免疫性及免疫性病症。術語「癌症」及「癌性」是指或描述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長失調的生理學病況。癌症的實例包括(但不限幹)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。本文所用術語「CD40相關的病症」或「CD40相關疾病」是指需要改良或消除表達CD40的細胞的病況。所述病況包括顯示異常增殖的表達CD40的細胞或與癌性或惡性生長有關的表達CD40的細胞。更具體而言，顯示異常表達CD40抗原的癌症的實例包括B淋巴樣幹細胞、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髄瘤、T細胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、骨肉瘤、表皮及內皮腫瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巣癌、結腸癌、前列腺癌、頭頸癌、皮膚癌(黑色素瘤)、膀胱癌及腎癌。所述病症包括(但不限幹)白血病、淋巴瘤(包括B細胞淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤)、多發性骨髄瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症；實體腫瘤，包括肉瘤(例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma))、惡性黑色素瘤、腺癌(包括卵巣腺癌)、卡波西氏肉瘤/卡波西氏腫瘤及鱗狀細胞癌。CD40相關的病症亦包括免疫系統疾病及病症，例如自身免疫病症及炎症病症。所述病況包括(但不限幹)類風溼性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮症、Sjogren氏症候群、多發性硬化、牛皮癬、炎性腸病(例如，潰瘍性結腸炎及節段性迴腸炎)、肺炎症、哮喘及特發性血小板減少性紫癜(ITP)。本文所用詞組「阻止…生長」或「生長抑制性」是指抑制細胞、尤其是表達⑶40抗原的腫瘤性細胞類型的生長或増殖。因此，生長抑制(例如)顯著降低S期腫瘤性細胞的百分比。術語「靜脈內輸注」是指在動物或人患者靜脈中經大於約15分鐘、一般介於約30至90分鐘之間的一段時間引入藥物。術語「靜脈內推注」或「靜脈內推射」是指將藥物給予至動物或人的靜脈中，從而使機體在約15分鐘或更短、一般5分鐘或更短時間內接受藥物。術語「皮下給予」是指在動物或人患者的皮膚下、優選在皮膚與基底組織之間的囊內通過自藥物貯器相對緩慢的持續遞送來引入藥物。將皮膚向上捏離或拉離基底組織可產生囊。術語「皮下輸注」是指在動物或人患者的皮膚下、優選在皮膚與基底組織之間的囊內經一段時間(包括(但不限於)30分鐘或更短、或90分鐘或更短)通過自藥物貯器相對緩慢的持續遞送來引入藥物。任選地，輸注可通過皮下植入藥物遞送泵(植入動物或人患者的皮膚下)來實施，其中該泵經預定時間段(例如30分鐘、90分鐘或跨越整個治療方案的時間段)遞送預定量的藥物。術語「皮下推注」是指在動物或人患者的皮膚下給予藥物，其中推注藥物遞送短於約15分鐘；在另一方面中，短於5分鐘；且在另一方面中，短於60秒。在另一方面中，在皮膚與基底組織之間的囊內給予，其中該囊可通過將皮膚向上捏離或拉離基底組織來產生。所用術語「治療有效量」是指活性藥物可緩解或改善所治療病症的一或多種症狀的量。在此情況下，其為具有有益患者結果(例如生長阻止效應)或引起細胞缺失的量。在一方面中，治療有效量具有細胞凋亡活性，或能誘導細胞死亡。在另一方面中，治療有效量是指已顯示可有效(例如)減慢疾病進展的目標血清濃度。可取決於欲治療病況以常用方式來測量功效。舉例而言，在特徵為表達CD40的細胞的腫瘤性疾病或病症中，可通過評價至疾病進展時間或測定反應率來測量功效。本文所用「治療」及「療法」及類似術語意欲包括針對疾病或病症的治療性以及預防性或抑制性措施，其產生任何臨床上期望或有益的效應，包括(但不限於)減輕或緩解疾病或病症的一或多個症狀、使疾病或病症消退、減慢或停止疾病或病症的進展。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症的症狀發作之前或之後給予藥物，由此預防或消除疾病或病症的一或多個體徵。作為另ー實例，該術語包括在疾病的臨床表達後給予藥物，從而抵抗該疾病的症狀。此外，在發作後及在已出現臨床症狀後給予藥物包含本文所用「治療」或「療法」，其中不論該治療是否引起疾病改善，給予皆影響疾病或病症的臨床參數，例如組織損傷度或轉移的量或程度。另外，只要単獨或與另一治療藥物組合的本發明組合物與未使用人源化CD40抗體組合物時相比減輕或改善所治療病症的至少ー個症狀，不論是否減輕該病症的所有症狀，該結果即應視為可有效治療潛在病症。所用術語「包裝說明書」是指通常包括於治療產品商業包裝內的說明書，其含有關於使用所述治療產品的適應症、用法、給予、禁忌症和/或警告的信息。抗體本文描述並公開了人源化抗-CD40抗體以及包含本發明ー或多種人源化抗-CD40抗體的組合物及製品。本文還描述了包括人源化抗-CD40抗體的抗原結合片段的結合剤。人源化抗-CD40抗體及結合劑可阻止細胞生長,引起表達CD40的細胞缺失,或者誘導或引起針對靶細胞的細胞毒性或細胞抑制效應。人源化抗-CD40抗體及結合劑可用於治療多種特徵為表達CD40表面抗原的細胞増殖的疾病或病症。人源化抗-CD40抗體及CD40結合劑各自包括至少ー個特異性識別⑶40表位的部分(即，抗原結合片段)。在初步表徵中，鼠類抗體基於CD40結合表徵來選擇。根據所述初始研究，選擇具有以下表I中所示的重鏈可變區及表2中所示輕鏈可變區的鼠類抗體表I :⑶40鼠類前導-VH序列
2權利要求
1.人源化抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈序列和輕鏈序列選自 a)選自SEQ ID N0:9 至 SEQ ID NO: 11 的重鏈 CDRl 序列，選自 SEQ ID N0:12 至 SEQ IDNO: 15的重鏈CDR2序列，和選自SEQ ID NO: 16至SEQ ID NO: 17的重鏈CDR3序列；和 b)具有選自SEQID N0:18至SEQ ID N0:21的序列的輕鏈CDRl序列，SEQ ID NO:22至SEQ ID NO: 23的輕鏈CDR2序列，和選自SEQ ID NO: 24至SEQ ID NO: 25的輕鏈CDR3序列。
2.權利要求I的抗體，其中所述抗體包含重鏈⑶Rl序列SEQID NO: 10、重鏈⑶R2序列SEQ ID NO: 13和重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 16 ;且其中所述抗體包含輕鏈CDRl序列SEQID NO:19、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22 和輕鏈 CDR3 序列 SEQ ID NO:24。
3.權利要求I的抗體，其中所述抗體包含重鏈⑶Rl序列SEQID NO:9、重鏈⑶R2序列SEQ ID NO: 14和重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 16 ;且其中所述抗體包含輕鏈CDRl序列SEQ IDNO: 20、輕鏈 CDR2 序列 SEQ ID NO: 22 和輕鏈 CDR3 序列 SEQ ID NO: 24。
4.權利要求I的抗體，其中所述抗體包含重鏈⑶Rl序列SEQID NO: 11、重鏈⑶R2序列SEQ ID NO: 15和重鏈CDR3序列SEQ ID NO: 17 ;且其中所述抗體包含輕鏈CDRl序列SEQID NO:21、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:23 和輕鏈 CDR3 序列 SEQ ID NO:25。
5.人源化單克隆抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列的重鏈可變域和輕鏈可變區SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:29和 SEQ ID NO: 26 ；SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 26 ；SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 31 ；SEQ IDNO:33 和 SEQ ID NO:31 ；SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:31 ；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:31;SEQ ID NO :37 和 SEQ ID NO :36; SEQ ID NO :38 和 SEQ ID NO :36; SEQ ID NO :39 和 SEQ IDNO:36 ；SEQ ID NO:40 和 SEQ ID NO:36。
6.特異性結合人CD40的分離的抗體或抗原結合片段，其包含 a)人源化重鏈可變域，該人源化重鏈可變域包含框架區，該框架區的胺基酸序列與人可變域重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34 或 SEQ ID NO: 35 中的框架區的胺基酸序列至少90%—致，且包含與相應的SEQ ID NO:31的輕鏈可變域至少90%一致的輕鏈胺基酸序列；或 b)人源化重鏈可變域，該人源化重鏈可變域包含框架區，該框架區的胺基酸序列與人可變域重鏈胺基酸序列 SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39 或 SEQ ID NO: 40 中的框架區的胺基酸序列至少90%—致；且包含與相應的SEQ ID NO: 36的輕鏈至少90%—致的輕鏈胺基酸序列。
7.人源化單克隆抗體或抗體的抗原結合片段，其中所述抗體或所述抗體的抗原結合片段特異性結合人CD40，在B細胞增殖中具有IC50小於InM的拮抗活性且在高達100 μ g/ml的濃度不具有激動作用，且其中所述抗體或所述抗體的抗原結合片段的特徵還在於所述抗體或所述抗體的抗原結合片段在非人靈長類中的活體內半衰期為至少10天；且其中所述抗體或所述抗體的抗原結合片段在小於30mg/kg的劑量於短尾猴中的半衰期任選大於8天。
8.一種在哺乳動物中阻斷人CD40的功能的方法，所述方法包括向該哺乳動物給予組合物，該組合物以足以阻斷該哺乳動物中CD40介導的免疫應答的量包含權利要求1-7中任一項的抗體量。
9.一種治療或改善哺乳動物的疾病或病症的方法，所述方法包括向該哺乳動物給予組合物，該組合物以足以在該哺乳動物中減少所述疾病或病症的一或多個症狀的量包含權利要求1-7中任一項的抗體。
10.權利要求9的方法，其中所述疾病或病症選自移植物抗宿主病、自身免疫性或炎性疾病，和⑶40相關的病症。
11.權利要求10的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病選自類風溼性關節炎、多發性硬化、增生性狼瘡性腎小球腎炎、炎性腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、節段性迴腸炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、I型糖尿病、古德帕斯丘氏症候群、重症肌無力、自身免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、Sjogren氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其還包括給予所選擇的第二治療藥物。
13.權利要求8-12中任一項的方法，其中所述抗體通過腸胃外途徑、靜脈內途徑或皮下途徑給予。
14.藥物組合物，其包含⑴權利要求1-7中任一項的抗體；和(ii)藥學上可接受的賦形劑；且其中該抗體或其抗原結合片段任選與第二藥物綴合。
15.一種分離的多核苷酸，其編碼重鏈可變區胺基酸序列或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區胺基酸序列包括以下的任一者SEQ ID N0:1至4、SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID N0:61、SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70,SEQID NO:71, SEQ ID N0:72或SEQ ID NO:73 ;且輕鏈可變區胺基酸序列包括以下的任一者SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:36,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或 SEQ ID NO:76。
全文摘要
本發明涉及新的人源化拮抗性抗-CD40抗體，及使用該抗體的治療及診斷方法及組合物。
文檔編號A61K39/395GK102918063SQ201180026863
公開日2013年2月6日 申請日期2011年3月30日 優先權日2010年3月31日
發明者R.巴雷特, S.布羅德, K.A.卡納達, T.利曾伯格, S.辛格 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司