一個類受體蛋白激酶基因及其表達載體和應用的製作方法

2023-04-26 08:36:46 2

專利名稱：：一個類受體蛋白激酶基因及其表達載體和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程領域，公開了ー個類受體蛋白激酶基因及其表達載體和應用。
背景技術：
：小麥白粉病是由小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的真菌性病害。小麥白粉病過去主要發生在冷涼、潮溼、多雨地區，近年來出現由南向北逐漸加重之勢，給小麥生產帶來了越來越嚴重的危害，在白粉病大發生的年份可使小麥嚴重減產。防治白粉病最經濟有效的方法是使用抗病品種，但由於病原菌小種變化快，我國現有的部分品種已逐漸失去對白粉病的抗性。分離和鑑定新的抗白粉病基因，利用基因工程手段轉入感病品種，開展小麥抗病分子育種，可以提高小麥的抗病性。近年來抗白粉病基因研究工作進展迅速，陸續有新基因被發現的報導。迄今己在小麥基因組的44個位點鑑定了60個主效的抗白粉病基因，並且大多數基因已經被定位到具體的染色體或者染色體特定區段上(McintoshR，YamazakiY，DubcovskyJ，eta丄しatalogueoigenesymbolsforwneat[A」·In:AppelsR,EastwoodR,LagudahE,etaleds.ProceedingsofIlthinternationalwheatgenetsymposium.[C].Sydney,Australia=SydneyUniversityPress,2008)小麥抗白粉病基因共有兩類來源一類來源於普通小麥，包括Pmla、Pmle、Pm3、Pm5b_5e、Pm9、PmlO、Pml1、Pml4、Pml5、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38和Pm39；第二類來源於小麥近緣種屬，包括Pmlb、Pmlc,Pmld,Pm2,Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pml2>Pml3>Pml6、Pml7>Pml9、Pm20、Pm21、Pm25、Pm26、Pm27、Pm29、Pm30、Pm31、Pm32、Pm33、Pm34、Pm35、Pm36禾PPm37。來自四倍體提莫菲維小麥(Triticumtimopheevii,2n=4X=AAGG)2G染色體上的抗白粉病基因Pm6，在我國大部分地區仍表現為高效抗性，尤其是成株抗性強。以含有白粉病抗性基因Pm6的小麥材料做供體，與小麥品種Prins連續回交、自交，結合抗病性鑑定，培育出以「Prins」為背景的Pm6漸滲系IGVI465(紀劍輝，曹愛忠，王海燕，覃碧，王蘇玲，孔芳，陳佩度，劉大鈞，王秀娥。利用基於PCR的分子標記區分普通小麥-提莫菲維小麥漸滲系。遺傳，2007，四(10)=1256-1262)ο本實驗室前期利用IGVI465和!3rins為親本，配製了遺傳作圖群體，利用該群體對Pm6進行了精細定位。在遺傳作圖的基礎上，對Pm6所在區域與短柄草和水稻進行了比較基因組學研究，結果發現在Pm6所在區域小麥、水稻和短柄卓具有民好的共線性(BiQin,AizhongCaoetal.Collinearity-basedmarkerminingiorthelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218.)。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種類受體蛋白激酶基因I^aLRR-RLK〗。本發明的另ー目的是提供該基因的表達載體。本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2，來自普通小麥I^rins-提莫菲維漸滲系IGVI465，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。該類受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質TaLRR-RLK2，其胺基酸序列為SEQIDNO.2。含有所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達載體。所述的含有權利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達載體優選以pBI220為出發載體，將權利要求1所述的iTaLRR-RLI^基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2在構建抗白粉病小麥品種中的應用。所述的含類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達載體在構建抗白粉病小麥品種中的應用。有益效果本發明首次從小麥種克隆得到了一個類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2及其所編碼的蛋白質TaLRR-RLK2，為小麥中首次報導。將其插入表達載體pBI220，得到的該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。TaLRR-RLK2用於基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，能夠獲得具備白粉病抗性的小麥種質。圖lpBI220:TaLRR_RLK2超量表達載體圖譜圖2與白粉菌互作的表達⑶S基因的表皮細胞a白粉菌侵入⑶S表達的表皮細胞後未形成吸器；d白粉菌侵入⑶S表達的表皮細胞後形成吸器CO分生孢子；pp侵入釘；ha吸器；hy菌絲圖3利用瞬間表達研究Ta-LRR_RLK2基因對吸器形成的影響和抗白粉病效應具體實施例方式實施例1含有Pm6的小麥IGVI465中ー個受白粉菌誘導的類受體蛋白激酶基因的克隆本研究的前期已完成了對Pm6的精細定位。在精細定位的基礎上，對Pm6所在區域與短柄草和水稻進行了比較基因組學研究，結果發現在Pm6所在區域小麥和水稻、短柄卓具有才民好的共線性(BiQin,AizhongCaoetal.Co丄丄inearity-basedmarkermimngiortnelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218)。本研究在與Pm6所在區域具共線性的短柄草和水稻基因組序列中預測了一個富含亮氨酸的類受體蛋白激酶基因(LRR-RLK)，預測在小麥IGVI465的Pm6所在區域也存在一個與模式物種中的類受體蛋白激酶基因同源的基因，這個基因可能是Pm6基因的候選基因。根據水稻、短柄草的LRR-RLK基因，在外顯子區域上設計引物RLK-FTTCACGCCAATTTGAAAACA(SEQIDNO.幻和RLK-R:CGATATTGCAGGCCCATAGT(SEQIDNO.4)。因IGVI465在四葉期開始對白粉菌具有抗病性，推測其抗病基因的表達在四葉期才開始表達，所以為了從IGVI465中分離到抗病基因，對四葉期的IGVI465進行了白粉菌誘導，即將感病材料上繁殖的白粉菌孢子直接從葉片上抖落到IGVI465的葉片上，並於白粉菌接種後M小時取葉片供RNA提取。以IGVI465在四葉期受白粉菌誘導的葉片所提取的RNA反轉錄的cDNA為模板，以RLK-F和RLK-R為引物，進行RT-PCR，獲得了ー個3000bp左右的基因片段。該基因片段與水稻和短柄草的LRR-RLK同源，預測為小麥IGVI465中的LRR-RLK基因，命名為I^aLRR-RLK〗。進ー步根據TaLRR-RLK2的基因片段為模板，分別設計5』RACE和3』RACE引物，利用快速擴增cDNA末端技術(RACE)，從IGVI465中克隆TaLRR-RLK2的5，端和3，端序列，進而獲得iTaLRR-RLK的全長序列。5，RACE程序如下5，RACEouterprimer序列為"CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，，(SEQIDNO.5),5'RACEinnerprimer序列為『『CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC」(SEQIDNO.6)。以四葉期受白粉菌誘導的IGVI465的cDNA為模板，用5，RACEouterprimer和接頭外引物(CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，SEQIDN0.13)進行第一輪PCR反應，取1μ1第一輪PCR產物作為第二輪PCR模板，用5』RACEinnerprimer和接頭內引物(CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC，SEQIDΝ0·14)進行第二輪PCR，第二輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，回收產物並克隆測序，分離到5』端片段。3，RACE程序如下3，RACEprimer序列為「ATATATATGTCCAGGGTGAGCGTAA」(SEQIDΝ0·7)，通用引物AP序列為「GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT」(SEQIDΝ0·8)。以IGVI465的cDNA為模板，以3，RACEprimer和AP為引物進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，回收產物並克隆測序，分離到了3』端片段。分別根據上述5』和3』端片段設計全長擴增弓I物TaLRR-RLK2-F(TAGAGCACCAGGCAGATAGCCA,SEQIDNO.鍆及iTaLRR-RLI^-R(ACTGCAMTCGTACGCGCGTCCAA，SEQIDN0.10)，以四葉期IGVI465受白粉菌誘導後的cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物回收並克隆，獲得大小為3310bp的序列。序列分析顯示該序列包含ー個0RF，其中5，-肌1(非翻譯區)4仙？、3'-UTR221bp、ORF(開放閱讀框)3045bp(SEQIDNO.1)，編碼1014個胺基酸(SEQIDNO.2)。經SMART軟體(http://smart,embl-heidelberg.de/)分析，該基因編碼ー個跨膜蛋白，在N端具有M個胺基酸組成的信號肽，ー個由23個胺基酸組成的疏水跨膜域，胞內含有ー個由268個胺基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域(S/TPK)。水稻基因注釋資料庫GAAS(http/Vricegaas·dna.affrc.go.jp/)分析發現該基因在胞外有11個富含亮氨酸重複(LRR)，具有這種蛋白結構的基因為富亮氨酸重複的類受體蛋白激酶(LeucineRich-RepeatReceptor-LikeKinases,LRR-RLKs)，將該基因命名為TaLRR-RLK2。實施例2TaLRR_RLK2基因瞬間表達載體的構建以經白粉菌誘導的IGVI465中克隆的I~aLRR-RLK2基因cDNA為模板，使用引物對RLK-ATG-BamHI-F(CGGGATCCATGGGGCGGAGGAGGCA,SEQIDN0.11)和RLK-TGA_KpnI-R(GGGGTACCTCAACGGCCTTCGTCCA,SEQIDNO.12)進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和KpnI對擴增產物進行雙酶切，將酶切產物插入到BamHI和KpnI雙酶切後的載體pBI220((JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.LrJSfusions:beta_glucuronidaseasasensitiveanaversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.))TaLRR-RLK2置於35S啟動子後面的多克隆位點處。由此將目標基因TaLRR-RLK2克隆到強啟動子35S的下遊，獲得表達載體pBI220:Ta-LRR-RLK2(圖1)。經測序驗證，表明載體構建成功。實施例3利用瞬間表達方法將TaLRR_RLK2基因轉入小麥葉片瞬間表達方法是ー種可靠且快速鑑定基因功能的方法(ktiweizer，Pokornyetai.ATransientAssaysystemfortheFunctionalAssessmentofDeiense-RelateaGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647_654.)。*石if究利用瞬間表達方法，將質粒DNA包裹到金屬微粒外層，藉助基因槍將金屬微粒和基因轟擊到小麥葉片的表皮細胞，然後統計轟擊TaLRR-RLK2細胞的白粉菌吸器指數與未轟擊TaLRR-RLK2細胞的白粉菌吸器指數，明確目標基因是否具有白粉病抗病功能。載體DNA與金屬微粒包裹的程序如下製備鎢粉稱取30mg的鎢粉於1.5mleppendorf管中，加入Iml70%酒精，渦旋3-5min後靜置15min，使鎢粉完全沉澱。12000rpm離心Imin後棄上清。加入ImlddH20水，渦旋混勻後，離心棄上清(重複三次)。最後加入500μ150%甘油渦旋混勻，以備用。包裹子彈吸取5μ1渦旋均勻的鎢粉於1.5ml的印pendorf管中，加入5μ1質粒DNA(總量應為lyg)。邊渦旋邊向印pendorf管內滴加50μ12.5ΜCaCl2，然後加入20μ10.IM亞精氨(現配先用)，渦旋;3min。靜置Imin後離心2s，棄上清。加入140μ170%酒精，充分渦旋，離心ム，棄上清。然後加入140μ1100%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。最後加入15μ1100%酒精，充分渦旋，以備使用。實施⑶S基因單轉化時，將含有⑶S基因表達載體pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.Ubiquitmpromoter-basedvectorsfornigh—levelexpressionοιselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的質粒DNA與鎢粉包裹；當實施TaLRR-RLK2與GUS基因共轉化時，將含有TaLRR-RLK2基因表達載體pBI220:TaLRR-RLK2的質粒DNA與含有GUS基因表達載體PAHC25的質粒DNA按摩爾濃度11的比例混合，包裹鎢粉。當⑶S基因與TaLRR-RLK2基因進行共轉化時，Marker基因⑶S轉入的細胞也是iTaLRR-RLI^轉入的細胞。因⑶S基因表達的細胞經染色整個細胞呈現藍色，所以本研究以藍色細胞作為TaLRR-RLK2的表達細胞。基因槍轟擊程序如下剪下長約6cm的小麥幼苗葉片端部，平行貼在載玻片上，每張玻片貼6片葉片左右。基因槍使用PDSIOOO/He系統，採用1350psi的可裂膜片，真空度為^inHg。轟擊後將葉片置於墊有潤溼濾紙的瓷盤內，罩以打有小孔的保鮮膜，保溼並透氣，18-20°C恢復培養4h後，高密度接種白粉菌分生抱子。接種4後用GUS染液(配方為0.lmol/LN￡i2HP04z/NaH2zP04緩衝液(ρΗ7·0)，含10mmol/LEDTA，5mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，0.lmg/mlX-Gluc,0.1%TritonX_100，20%甲醇，)真空滲透10min，37°C染色12h,然後用70%酒精脫色2天直至葉片變成白色為止，最後利用濃度為0.6%的考馬斯亮藍對白粉菌孢子染色。實施例4TaLRR_RLK2抗病功能的分析白粉菌侵入小麥葉片表皮細胞後，在表皮細胞中產生的指狀物稱為吸器。吸器不能正常產生是葉片細胞對白粉菌具有抗性的重要指標。在⑶S表達的細胞中，吸器會被⑶S染色液染成藍色，在顯微鏡下容易辨認(圖幻。在GUS基因轉化細胞後，通過統計與白粉菌互作的⑶S表達細胞中，吸器形成的細胞所佔的比例(％)，即為「吸器指數」(khweizer，Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentoiDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647-654.)。吸器指數越小，表明抗病性越強。本研究利用「吸器指數」作為抗病強弱的衡mfefeo權利要求1.類受體蛋白激酶基因iTaLRR-RLI^,其特徵在於核苷酸序列為SEQIDNO.1。2.權利要求1所述類受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質TaLRR-RLK2，其特徵在於胺基酸序列為SEQIDNO.2。3.含有權利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達載體。4.根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於所述的含有權利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達載體是以PBI220為出發載體，將權利要求1所述的TaLRR-RLK2基因插入PBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。5.權利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2在構建抗白粉病小麥品種中的應用。6.權利要求3或4所述的含類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達載體在構建抗白粉病小麥品種中的應用。全文摘要本發明屬於基因工程領域，公開了一個類受體蛋白激酶基因及其表達載體和應用。類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的胺基酸序列為SEQIDNO.2。該基因來自普通小麥Prins-提莫菲維漸滲系IGVI465，為在小麥中首次報導。通過瞬間表達將該基因轉化感病小麥品種Prins，結果表明TaLRR-RLK2的過量表達可以降低Prins的吸器指數。因此，TaLRR-RLK2可望用於基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。文檔編號C12N15/54GK102533812SQ20121001242公開日2012年7月4日申請日期2012年1月16日優先權日2012年1月16日發明者劉洋洋,曹愛忠,王海燕,王秀娥,肖進,覃碧,邢莉萍,陳婷婷申請人:南京農業大學