二粒小麥lrr-受體蛋白激酶基因、該基因的克隆方法及其應用的製作方法
2023-04-26 08:29:51 1
專利名稱：二粒小麥lrr-受體蛋白激酶基因、該基因的克隆方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一種全長cDNA的分離、克隆及其應用。
背景技術：
蛋白激酶家族是酶中的大家族，參與信號傳導途徑並在調節細胞功能中起重要作用，其 中很多成員介導真核細胞對外界刺激的應答反應。類受體蛋白激酶(rec印tor-like protein kinases, RLKs)屬於蛋白激酶的一個亞家族，其結構包含胞外結構域(extracellular domain)、單次跨膜域(signle-pass transmembran domain)禾口胞內激酶域(cytoplasmic protein kinase domain),它們通過胞外結構域與胞外信號分子，如離子、小分子或多肽等 的特異結合來激活胞內激酶域的自磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜傳遞信號的功能。因為 這類蛋白激酶的分子結構和功能酷似動物中發現的受體蛋白激酶(rec印tor protein kinase, RPK) (Hanks等1988; Yarden和Ullrich 1988; Ullrich和Schlessinger 1990)，但對其中的 絕大多數尚未鑑定出其配基，故稱之為類受體蛋白激酶(Stone和Walker 1995)。依胞外結構 域的類型，RLK可分為S-結構域(S-domain)型、類表皮生長因子(印idermal growth factor-like)型、類腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor rec印torlike)型、富含亮 氨酸重複序列(leucine-richr印eat，LRR)型。目前，在植物中已鑑定的類受體激酶絕大多數 屬於LRR型。
在小麥(7>i"ciMses"n//s)高分子量麥谷蛋白基因位點附近有一個編碼LRR-類受體 蛋白激酶的基因位點(標記為化Za)，編碼蛋白與水稻(6!r;^3幼"ra)抗病蛋白Xa21類似。 通過反轉錄PCR途徑，從二粒小麥(rri"c腿^/r&o^ )的7aJa同源位點分離了 3個cDNA 克隆，ZS860 (GenBank査詢號:EF394367), ZS2000 (GenBank査詢號:EF394368)和ZS2001 (GenBank査詢號EF394369)。 一個完整的TaXa蛋白包括N-端保守區、LRR結構域、 一個 跨膜區和位於c-端的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶功能域。在基因進化過程中，由於鹼基代換、 缺失和插入導致了開放讀碼框的改變，使該位點基因的編碼多肽縮短。rafe位點的祖先基因 可能編碼1 028個胺基酸組成的多肽，但到目前為止，還未見從普通小麥中分離到編碼約1 028 個胺基酸的完整、全長基因cDNA克隆的報告，限制了對這一同源位點基因功能的進一步研究。 本發明成功分離到l個&Ja位點基因的全長cDNA克隆，編碼l 026個胺基酸組成的多肽， 構建了植物表達載體，這些將推動小麥屬7sZ3基因功能的研究和利用
發明內容
發明目的
本發明成功分離到1個ra化位點基因的全長cDNA克隆，編碼1 026個胺基酸組成的 多肽，構建了植物表達載體，將推動小麥屬rafe基因功能的研究和利用。 本發明的技術方案是
一種二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因，其特徵是WZ做-5T基茵遊全長cZ 廁,身，其 核苷酸序列的鹼基組成 'formula see original document page 4
^^^遊r"必 -5TT基因編碼的蛋白，其胺基酸序列為1026 Aaformula see original document page 4
所述的7^y 7 -S7基因所編碼蛋白的特點該基因編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋 白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。這個受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結構域(LRR)、中部跨膜結構域和C-端蛋白激酶結構域等幾個部分。其結構與已經克隆 的水稻(ftT幼ssn'ra)抗白葉枯病蛋白Xa21類似(Song等1995; GanBank査詢號U72728) 和大麥(AbiVe〃歷raJgare)的一個受體激酶(GanBank查詢號油| AAP31049. 11 )編碼蛋白
高度相似。
TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶(Hvprk， GanBank查詢號gb|AAP31049. 11 ) 的胺基酸序列比較結果如圖3所示。
TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶的胺基酸序列比較圖4所示。 所述r^y^-^7基因的克隆方法，包括以下步驟
(1) r"Ay -57F基因是從對小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的。以二粒小麥的葉 片為材料提取總RNA (核糖核酸)，再進一步分離mRNA (信使核糖核酸)，通過反轉錄將mRNA 轉錄為cDNA (互補脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進行基因克隆。
(2) 根據與植物抗病相關的LRR-類受體蛋白激酶基因序列設計了一對兼併性引物(序 列 為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過反轉錄PCR (RT-PCR)技術從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長度為3081 bp的cDNA片段，克隆於pUC18-T載體上，測序後通過 序列分析證明這個cDNA克隆編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇^酸受體蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine receptor protein kinase)。在GenBank中進鬥亍相1以'性査i旬比較，i正明為 新的二粒小麥基因，暫命名為7M7 ASS7J基因。
具體克隆技術為
cDNA的合成用TRIzor試劑提取葉片總RNA。用Poly (A) Tract* mRNA分離系統III分 離出mRNA。用SMART RACE cDNA擴增試劑盒合成cDNA。
反轉錄PCR:用高保真DNA聚合酶進行擴增。擴增程序為先在94 ° C變性2分鐘； 接30個循環的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘；最後在72 ° C
延伸7分鐘。
產物回收和測序分析擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的 瓊脂糖凝膠切割下來，用液氮反覆凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉澱。 回收的DNA片段用超純水溶解後，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4° C連接過 夜。用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產物轉化到大腸桿菌DH10B菌株中。用質 粒小量提取法提取質粒DNA。在大連寶生物公司用ABI377自動測序儀測序。測序結果用BLASTt 和BLASTp計算機輔助程序(Altschul等1997)在美國國家生物信息中心網站NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov)和相關的連網站點進行同源序列査詢比較。在NCBI網站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法進行保守功能域數據分析。
所述的基因5T在小麥抗白粉病中的應用。
所述的基因r^y y -5T在轉基因抗病育種中的應用。
所述的基因f"^ -5T在轉基因抗病育種中的應用。
所述的基因7YZ^ -5T在設計合成新抗病相關基因中的應用。
所述基因r"vW-5T在基因晶片製作研究中的應用，
本發明的有益效果
l.本發明的基因7YZ必 -5T^議遂/滯基因抗病育種。該基因可以插入到不同類型的啟動 子下遊，構建成植物表達載體，通過基因工程技術進行植物抗病改良。啟動子可以是組成型 表達的啟動子，如花椰菜花葉病毒35S的啟動子、玉米泛素啟動子Ubi等。連接在組成型表 達啟動子下遊的基因將在轉基因植物的任何組織和任何發育時期表達。啟動子也可以是病原 菌誘導表達的啟動子、或組織特異性表達的啟動子。連接在這些啟動子下的基因僅在病原菌 存在時、或在特定組織中表達，使該基因的表達受到更精確的控制。 .2.本發明的基因K^y -5T^議設計合成新抗病相關基因。植物LRR-蛋白激酶類多肽的羧基端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域高度保守，而胞外的LRR區在基因間差異很大，它決定 抗病基因作用對象的分子特異性(Kobe和Deisenhofer 1994)，這個區域的改變可以改變基 因的作用對象，因此，氨基端的LRR結構變化決定LRR-類蛋白激酶與其他蛋白的互作特異性。 通過定點突變、或基因序列重組等技術，可以人工合成很多具有新的特性的基因，通過基因 工程技術應用於植物抗病改良中。
3.本發明的基因n^KS5T^"以基因晶片製作。可將該基因的克隆用於小麥基因晶片制 作，應用於小麥抗病等研究中。根據7^ypy -57F基因cDNA序列設計PCR引物，在含本基因的 克隆中擴增rt^W-S7J基因的全長cDNA，或擴增編碼N-端結構域的基因特異性強的區段，進 行基因晶片的製作。
4.本發明的TtLRR-STK基因在小麥抗白粉病反應中起重要作用。小麥在受到小麥白粉病菌 的攻擊時，表達被激活，轉錄水平顯著增強(參見附圖5)。由圖5可見，未接種白粉病菌的 對照(0小時)沒有擴增產物，接種後12至24小時的表達量最高，直到接種後72小時仍有 較高的表達。rt^W-5TT的表達譜變化證明了其在小麥抗白粉病反應中起重要作用。
圖1是LRR-受體蛋白激酶基因的核苷酸序列圖； 圖2是LRR-受體蛋白激酶基因的胺基酸序列圖3是LRR-受體蛋白激酶基因編碼的蛋白二級結構圖，圖中上數字為胺基酸殘基的位置； C0G4886:與C0G4886類似的LRR功能域；TM:跨膜結構域；S-Tkc:絲氨酸/蘇氨酸激酶功能域。
圖4是TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶的胺基酸序列比較圖。
圖5是通過RT-PCR技術分析r^A^-5TJ基因在小麥抗白粉病反應中的表達變化。圖中M為分
子量標記，0、 1、 12、 24、 72等數字為小麥白粉病接種後的時間；^cti"為小麥肌動蛋白基
因，為穩定表達基因，作為基因表達變化的對照。結果可見，7M/^-^57J基因在白粉病菌接
種後表達被激活。
圖6是表達載體質粒pC220-ZS2002結構圖。T-Border (L): T-DNA左邊界;T-border (R): T-DNA右邊界；HYG:潮黴素抗性基因；GUS: 0-葡萄糖苷酸酶標記基因；LacZ: 0-牛乳糖 標記基因；ZS2002: 7z^A!/ -6TJ基因；Ubi-1:玉米泛素-l啟動子；N0S:胭脂鹼基因終止子。
具體實施例方式
實施例i. rt^ / -57J基因的克隆過程
7Y^V -5TJ基因是從對小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的。以二粒小麥的葉片為 材料提取總脂A (核糖核酸)，再進一步分離mRNA (信使核糖核酸)，通過反轉錄將mRNA轉錄 為cDNA (互補脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進行基因克隆。
根據與植物抗病相關的LRR-類受體蛋白激酶基因序列設計了一對兼併性引物(序列為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ;
5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過反轉錄PCR (RT-PCR)技術從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長度為3081 bp的cDNA片段，克隆於pUC18-T載體上，測序後通過 序列分析證明這個cDNA克隆編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇^酸受體蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine rec印tor protein kinase)。在GenBank中進行相似性査詢比較，證明為 新的二粒小麥基因，暫命名為W^y -5TJ基因。(目前在普通小麥及一粒小麥、二粒小麥的同 源位點上還沒有編碼1026個胺基酸的完整cDNA克隆被報告)
具體克隆技術
cDNA的合成用TRIzor試劑提取葉片總RNA。用Poly (A)Tract" mRNA分離系統III分 離出mRNA。用SMART RACE cDNA擴增試劑盒合成cDNA。反轉錄PCR:用高保真DNA聚合酶進行擴增。擴增程序為先在94 ° C變性2分鐘； 接30個循環的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘；最後在72 ° C
延伸7分鐘。
產物回收和測序分析擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的 瓊脂糖凝膠切割下來，用液氮反覆凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉澱。 回收的DNA片段用超純水溶解後，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4° C連接過 夜。用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產物轉化到大腸桿菌DH10B菌株中。用質 粒小量提取法提取質粒DNA。在大連寶生物公司用ABI377自動測序儀測序。測序結果用BLASTt 和BLASTp計算機輔助程序(Altschul等1997)在美國國家生物信息中心網站NCBI (hUp:〃麗w. ncbi. nlm. nih. gov)和相關的連網站點進行同源序列査詢比較。在NCBI網站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法進行保守功能域數據分析。 ' 該基因所編碼蛋白的特點
該基因編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。這個受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結構域(lrr)、中部跨膜結構域和 C-端蛋白激酶結構域等幾個部分。其結構與已經克隆的水稻(6!ry幼^tira)抗白葉枯病蛋 白Xa21類似(Song等1995; GanBank査詢號U72728)和大麥(他rofe腿n/J卵re)的一個受 體激酶(GanBank查詢號gbIAAP31049. 1 i)編碼蛋白高度相似。其比較結果參見附圖3.
TtLRR-STK(TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶(Hvprk， GanBank查詢號gb IAAP31049.11) 的胺基酸序列比較。
image see original document page 7Hvprk 655 TtLRR 659Hvprk 715 TtLRR 719LQI簡TAfe6/ IHI龜趣l 跨膜結構域■ARC|VNKSB 國虛IK驛I闘DISag,iNI針:MTORIS， l:UISA'l 1)SI:SE P 1A1S，A1::LIIL'\ l'DSFSV丄ILUVKVl,muKU(;ATKSI: I SI:('\AI,iai 1 RH服l .VK\||!j達.i TAAYKVi .m'g叫(;Ai s卜:(i川服lvkv絲氨te蘇&K」力能械-714 718774 778Hvprk TtLRR775 779irVCi^BM^NWK ^iit|)\(;Sl,l)KM .1ii 'ST卜:)l'H;TI'Nil .、M、'l .、 1 Al .l)VAl':AI丄:、 IWCDSLDHSGSQI'KALVLEF 11'N(;SU)KWI ,1 ll)S'iT':(;l: WJPSLV1QRIA1 A1,1)VAI':A1上Y834 838Hvprk TtLRR835 839L錢D歸PPr,' 1 l(T)VKi 'S\ 11丄)I)隨.A11L(、'I)R;1 ..\K] 1 RA:KS,」D0S〔'SV(' 1 KT 1 SfflH!DPPIVHCDVKiJS\ 1 l丄l)IAMVAlll.('l)r('LAK1 k'Al-:liSSQSU'(;QSSSV'(; [KG'I' 1894 898Hvprk TtLRR895 899df viMfiTG:i svh( tI)vysy(; vi .i丄i':Mi ,'i r'Ki們'm)i'Fsi)'i 'ai ,pky v'i':vi八(:p(;M丄r: GYLi*S S￡IS\,i:(;l)VYSY(;VLU,l:.\lLTWWr )l'T\inT\LPKYVBl.'\t:l>G\Ll,l':954 958Hvprk TtLRR955 959t蒙NlR^fc駒4vpLMM^ si化(;l'uti";sai《ok i k i(;i)vvki':i .(;aku i i maso、' iMWfCNQEPKiTULPiy '.\Ki,(;L\('(、K(;r'.\RwnAisDYVKnL(;;aK'm..i\iAS(A1014 1018Hvprk TtLRR1015 1019YASWV服LY 1023 S輔,Q 1026實施例2.本發明的W^y -57J基因在轉基因抗病育種上的應用。將7t^y -5TJ基因從pUC18-T載體上酶切下來，或用高保真化^DNA聚合酶和基因特異性 引物擴增下來。用T4-麗A連接酶將r^^/ -57J連接在玉米泛素高效啟動子Ubi(Ubiquitin-1) 的下遊，再插入到pCAMBIA-Bar植物表達載體中，從而構建成pCAMBIA-Ubi-7&^S57J表達 載體質粒。'將該表達載體轉化到大腸桿菌DH10B菌株中繁殖，提取該載體的質粒，即可進行 轉基因抗病育種。通過基因槍(如伯樂公司的高壓氦氣基因槍，PDS-1000/He)將 pCAMBIA-Ubi-rt^^-57J表達載體質粒轉化到高產、優質，但抗病性差的小麥品種的幼胚愈 傷組織中。利用表達載體上的篩選標記基因——抗除草劑基因Bar，在加有除草劑PPT的MS 固體培養基中篩選，獲得抗PPT的轉基因愈傷組織。再將篩選獲得的轉基因愈傷組織轉到新 的誘導組織分化的分化培養基(含3mg/L的PPT; 1 mg/L的Zeatin，和1 mg/L的IAA， 1/2 的MS固體培養基)中培養，誘導產生新的再生植株。這樣就獲得了轉基因小麥。用基因特異 性引物通過PCR技術對轉基因植株的後代進行檢測，選擇基因純合，抗病性好的理想轉基因 品系，即可進行大田種植、推廣。下圖是將7^^!/ -5TJ基因(ZS2002)插入在玉米泛素高效 啟動子下遊構建成的單子葉植物表達載體結構示意圖(圖6)。實施例3.本發明的7YZ^P-6TJ基因在設計合成新抗病相關基因。現代dna合成技術已經可以合成全長基因。因此，根據已經克隆研究的植物LRR-蛋白激 酶類抗病基因的特徵，設計合成需要的編碼特異LRR結構域的序列，與TtLRR-STK的編碼約 第600胺基酸以後的序列相連接，就可合成全新LRR-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶基因。然 後，通過測序驗證合成基因的編碼框(ORF)是否正確。通過驗證的基因即可進一步構建到植' 物表達載體中，通過轉基因技術對合成基因的抗病性進行檢測。具有良好抗病性的合成基因 可以用於轉基因抗病小麥新品種的培育(植物表達載體的構建和轉基因的具體操作如(1)中 示例玩述)。實施例4.本發明的7yz^ -5tj基因在基因晶片製作中的應用。以5TJ基因cDNA克隆為模板，用基因特異性引物或pUC18-T載體上的M13通用引 物通過PCR擴增獲得DNA產物。對產物進行純化，'溶解後，按照基因晶片製作程序製作小麥 基因晶片，用於抗病等相關研究。如可以用英國的BioRobotics自動點膜儀將標本點在8X 12釐米的尼龍膜上。每個樣品點2個點，每個點的DNA量為幾納克，同時點上看家基因(如 18sRNA和Actin基因)作為穩定表達基因對照。試驗研究材料的mRNA提取後用同位素(如833P)標記作為探針，與基因晶片進行雜交。用記錄儀分析雜交信號。根據雜交信號的強弱分析不同實驗條件下r^z A7基因的表達變化。研究rs^aw基因與抗病等反應的關係。
權利要求
1.二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因，其特徵是其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據權利要求1所述的基因，其特徵在於該基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.二根據權利要求1所述的基因，其特徵在於該基因編碼的蛋白二級結構圖如SEQ ID N0:3所示。
4. 如權利要求l所述基因的克隆方法，包括以下步驟(1) 以二粒小麥的葉片為材料提取總RNA(核糖核酸)，再進一步分離mRNA(信使核糖核酸)， 通過反轉錄將mRNA轉錄為cDNA (互補脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進行基因克隆。(2) 根據與植物抗病相關的LRR-類受體蛋白激酶基因序列設計了一對兼併性引物(序列為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過反轉錄PCR (RT-PCR)技術從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長度為3081 bp的cDNA片段，克隆於pUC18-T載體上，測序後通過 序列分析證明這個cDNA克隆編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶。
5. 根據權利要求4所述基因的克隆方法，其特徵在於cDNA的合成方法包括用TRIzor試劑提取葉片總RNA，用Poly (A) Tract* mRNA分離系統III 分離出mRNA，用SMART RACE cDNA擴增試劑盒合成cDNA;反轉錄PCR合成方法包括用高保真DNA聚合酶進行擴增，擴增程序為先在94° C變性2 分鐘，接30個循環的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘，最後在 72 ° C延伸7分鐘；產物回收和測序分析擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的瓊脂 糖凝膠切割下來，用液氮反覆凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉澱。回收 的DNA片段用超純水溶解後，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4 ° C連接過夜， 用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產物轉化到大腸桿菌DH10B菌株中，用質粒小 量提取法提取質粒DNA，測序儀測序，測序結果進行保守功能域數據分析。
6.根據權利要求l所述的基因在小麥抗白粉病中的應用。
7. 根據權利要求1所述的基因在轉基因抗病育種中的應用。
8. 根據權利要求l所述的基因在轉基因抗病育種中的應用。
9. 根據權利要求l所述的基因在設計合成新抗病相關基因中的應用。 ，
10. 根據權利要求1所述基因在基因晶片製作研究中的應用，
全文摘要
本發明涉及植物基因工程技術領域，特別是涉及一種全長cDNA為3081bp基因TtLRR-STK的分離、克隆及其應用。本發明TtLRR-STK基因是從對小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的，該基因編碼富亮氨酸區-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶，所述的受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結構域(LRR)、中部跨膜結構域和C-端蛋白激酶結構域等幾個部分。其結構與已經克隆的水稻抗白葉枯病蛋白Xa21類似和大麥的一個受體激酶編碼蛋白高度相似。本發明的基因TtLRR-STK可以插入到不同類型的啟動子下遊，構建成植物表達載體，通過基因工程技術進行植物抗病改良，也可將該基因的克隆用於小麥基因晶片製作，應用於小麥抗病等研究中。
文檔編號C12N15/82GK101407814SQ20071018971
公開日2009年4月15日 申請日期2007年10月10日 優先權日2007年10月10日
發明者瑞 劉, 牛吉山, 磊 鄭 申請人:河南農業大學