生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用的製作方法

2023-04-26 09:27:51

專利名稱：生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬製藥技術領域，具體涉及生物合成竹紅菌乙素(Hypocrellin B，簡稱HB)在製備抗癌藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，在各種疾病所致的死亡中，惡性腫瘤居第二位，並有進一步增高的趨勢。手術、放療和化療是治療惡性腫瘤的三大傳統療法。手術雖能有效地切除肉眼可見腫瘤，但無法保證所有腫瘤細胞都被切除；放化療除了有嚴重毒副反應外，許多腫瘤對其不敏感或產生抗性，使得抗腫瘤的治療非常局限。
苝醌化合物是一類分布於自然界生物中的光敏色素。苝醌類光敏色素是目前已知的在可見光區內優良的光敏劑。這類光敏劑在光照和分子氧存在的條件下對有機體、細胞和病毒有傷害作用。苝醌類光敏活性成分在可見光照射條件下產生的單重態氧和半醌自由基具有化學反應活性，即細胞殺傷能力。其作用是引起細胞膜蛋白交聯、膜脂過氧化、膜流動性改變，誘導DNA損傷，引起酶失活，導致細胞骨架損傷，使細胞周期部分阻斷於S期。用苝醌化合物研究開發光敏活性抗癌藥物有很好的前景。申請號為200310104164.0的中國專利文件公開了屬苝醌化合物的痂囊腔菌素在製備抗癌藥物中的應用。而已知的化合物竹紅菌乙素(HypocrellinB)也屬於苝醌化合物。1985年萬象義等人從竹紅菌中分離得到竹紅菌乙素(雲南大學學報，1985，7[4]，461-463)，張曼華等人用光譜方法鑑定了竹紅菌乙素的結構(科學通報，1988[7]，518-522)，梁麗等人用X射線晶體衍射確定了結構(科學通報，1987[1]，56-59)。
自然界中不同種屬的真菌能產生含有苝醌化合物骨架的次生代謝產物。由於自然資源十分有限，上世紀九十年代以來國內外一些研究人員希望通過化學合成的方法實現苝醌化合物的全合成。但進行人工合成步驟煩瑣，通過十幾步反應合成苝醌骨架化合物，只具有理論上的研究意義，通過生物合成的方法才能大量獲得苝醌化合物。迄今已有生物合成苝醌化合物的技術，如「苝醌化合物的生物催化合成」(《分子催化》，2000，14(14)，300-302)；「苝醌類化合物的生物合成」(《熱帶作物學報》，1998，19(增刊)，45)；「苝醌類化合物產生菌固態發酵工藝研究」(《雲南大學學報》自然科學版，2000，22(5)，389-391)等文章。生物催化合成的苝醌類化合物中就包含有竹紅菌乙素，並且可分離出來。本專利申請人已向市場提供生物合成的竹紅菌乙素。

發明內容
本發明的目的是提供生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用。
生物合成竹紅菌乙素(Hypocrellin B)的分子式C30H24O9結構式
按照本發明，以生物合成竹紅菌乙素作為藥物有效成分，製成醫學上可以接受的劑型，施用於癌症患者，並進行光照。所說癌症可以是皮膚、口腔、直腸、鼻、喉、胃等的實體瘤。對於普通光源不能照射到的部位可以用光纖光源進入人體進行照射。
以下通過各項試驗及其結果來說明生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的用途。
一、生物合成竹紅菌乙素對體外腫瘤細胞株的抑癌活性由於腫瘤細胞生長具有相對的自主性，故可在體外建立具有無限增殖能力的細胞系。用體外細胞作抗癌藥篩選具有用藥量少，周期短，費用低等優點，且其篩選結果與體內試驗相關性好。因此選用噻唑藍實驗法(MTT法)檢測生物合成竹紅菌乙素對腫瘤細胞株的抑癌活性。
MTT是一種能接受氫原子的染料，活細胞線粒體中與NADP相關的脫氨酶在細胞內可將黃色的氧化型MTT還原成不溶性的藍紫色的甲(月替)(formazan)，而死細胞無此功能。甲(月替)生成量與活細胞數量、細胞的種類、作用時間等相關。當細胞種類、作用時間一定時，其生成量與細胞數量呈線性相關。用DMSO溶解甲(月替)後，在一定波長下用酶標儀測定光密度值，即可測知活細胞數量。
本實驗用MTT法測定培養的人盲腸癌細胞Hce-8693和人黑色素瘤細胞B-16的光密度得到OD570值。通過OD570值可計算不同條件下細胞的存活率。
1、實驗部分(1)試劑配製MTT溶液將MTT溶解於經高壓滅菌處理的PH7.4的PBS液，濃度為5mg/ml，過濾除菌(臨用時配製)。
細胞培養液即含10％FCS的DMEM溶液，細胞消化液為0.25胰酶-0.038％EDTA溶液。
待測藥物生物合成竹紅菌乙素的配製將HB溶於少量DMSO中，加培養液製備成2mM的原液，臨用時用培養液作濃度梯度稀釋，配成為0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM。
(2)組別及其處理方案空白組除不加細胞外、正常對照組除不加藥物外其餘均與加藥實驗組同樣處理。取10塊96孔板，每板分7個小組，分別為空白、對照、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM。其中8塊板，分成4組，A組光照5min，B組光照6min，C組光照10min，D組光照20min。另2塊板不光照，作為對照組觀察HB本身對細胞的毒性影響。
(3)實驗步驟細胞接種將處於對數生長期的細胞用培養液製成2×5個/ml的細胞懸液。用微量加樣器接種於96孔板中，每孔0.1ml(每孔103-104細胞，孔總容量約為370μl)，邊緣孔不加細胞，僅加培養基作為無細胞空白對照組。5％CO2培養箱中培養，使細胞貼壁，24小時後加HB。
加HB將HB溶於少量DMSO中，加培養液配成濃度為2mM原液，用培養液作濃度梯度稀釋。棄去板中的原培養液，將不同濃度的HB溶液加入相應實驗孔中，每孔100μl，使各組終濃度分別為0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM。正常對照組不加藥，加入等體積培養液作為對照，遮光繼續培養2h。
光照處理將上述培養板置於冰塊上，用1300w的新聞燈按設計方案光照5min，6min，10min，20min。光照距離為100cm。然後棄去上清，用PBS洗板2次，加培養液100μl，遮光繼續培養2h。
加MTT將上述培養板按實驗要求每孔加入5mg/ml的MTT20μl，繼續培養4h。
甲(月替)的溶解棄去培養液，用培養液洗板2次，最後傾幹孔內液體。每孔加入100μlDMSO，溫室放置20min，並不時搖動。
酶聯儀檢測讀數用酶聯儀測定其光密度，以無細胞空白組OD570值調為零，測定各組OD570值，做好紀錄。各組OD570值取均值後，以下列公式計算存活細胞百分數細胞存活率(％)＝(OD實驗/OD對照)×100％(以空白組OD值調零)2、結果MTT法實驗結果見下表1-4表1 生物合成竹紅菌乙素作用下人盲腸癌細胞Hce-8693光密度讀數各組均值統計表

表2 生物合成竹紅菌乙素作用下人盲腸癌細胞Hce-8693存活率(％)統計表

表3 生物合成竹紅菌乙素作用下人黑色素瘤B-16細胞光密度讀數均值統計表

表4生物合成竹紅菌乙素作用下人黑色素瘤B-16細胞存活率(％)統計表

在實驗中還觀察到以下現象(1)Hce-8693細胞和B-16細胞與HB接觸2h後，經光照處理再繼續培養6h，在倒置相差顯微鏡下觀察到細胞形態學上的改變較明顯，最初是貼壁生長的細胞邊緣離開培養瓶壁，細胞間的邊距增大，胞膜出現皺褶現象，邊緣變模糊。
(2)加MTT 4hr後，倒置相差顯微鏡下觀察到黃色的MTT被還原成藍紫色顆粒。
從以上數據分析可知HB本身對培養的腫瘤細胞有一定的毒性作用，且與其濃度成正相關。經光照後HB對細胞的毒性作用明顯增強，且隨HB濃度的增高而趨於明顯，但與光照時間無明顯的相關關係。
在MTT法實驗中，當加入不同濃度的HB後培養2h棄去原培養液，換正常培養液繼續培養6h時，我們發現細胞形態發生變化，大部分細胞可見胞質突起，胞膜伸出偽足、出現皺褶等現象；而加入HB並光照5min，6min，10min，20min組的細胞，可見到細胞形態發生更為明顯的變化細胞邊緣變得模糊，細胞間距離增大，細胞邊緣離開瓶壁，出現脫落現象。因此我們推測，在HB光敏生物活性Hce-8693細胞和B-16細胞的殺傷作用中，細胞膜可能是HB光動力學作用的靶部位。
實驗表明，HB對對數生長期的Hce-8693細胞和B-16細胞有抑制生長的作用。培養細胞單獨加HB而不光照，細胞生長受到一定程度的抑制，加HB並光照處理後的細胞，其生長受到進一步抑制，並隨著HB濃度的增高而增強。以上結果表明，HB本身對Hce-8693細胞和B-16細胞有一定的毒性作用，而其光敏活性對細胞的殺傷效應更強，且存在劑量依賴關係。
二、流式細胞術測定HB光敏活性對腫瘤細胞及胚胎幹細胞抑制增殖及誘導凋亡的作用苝醌化合物在光敏化的情況下，其單重態氧和半醌自由基具有化學反應活性，即細胞殺傷能力。通過流式細胞術，可探知苝醇化合物HB抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡的光敏活性及其對腫瘤細胞周期的影響。
細胞凋亡又稱程序化細胞死亡(Programme cell death)，是有核細胞在一定條件下，通過激活其自身內部機制，尤其是開啟與關閉某些基因以及內源性DNA內切酶的活化，導致產生細胞自然性的死亡過程。細胞凋亡對於控制細胞增殖起到重要的作用，促凋亡因素與抑凋亡因素的失衡在腫瘤的發生、發展過程中所起的作用越來越受到關注，許多抗腫瘤藥物的研究都希望通過誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。
流式細胞術(FCM)是一種利用流式細胞儀對生物細胞的理化性質和功能進行多參數分析的技術。FCM在基礎和臨床醫學的眾多學科中均獲得日益廣泛的應用，並促進了相應學科發展。FCM以單細胞懸液為研究對象，對細胞進行快速、大量、多參數的分析，並能對所需細胞亞群作高純度分選，這些特點具目前其它技術所不能替代的優勢。它的基本途徑是(1)利用細胞對光的散射可獲得有關細胞大小(與前向角散射有關)和粒度(與側向角散射有關)的信息，對細胞內部參量進行檢測；(2)經螢光染色或/和單克隆抗體標記後對細胞外部參量進行檢測。從理論上講，只要能對細胞的某一待測成分進行特異性螢光標記即可加以檢測。其主要內容包括DNA成分及含量、RNA含量、總蛋白含量、細胞抗原構成、酶活性及定位、細胞鈣離子、細胞內PH、細胞膜電位、細胞膜流動性或微粘度等。還可以根據細胞內部參量或外部參量的不同將某一特定亞群從細胞總體中分選出來，以便進一步深入研究。
該試驗揭示了HB對人Hce-8693盲腸癌細胞及獼猴胚胎幹細胞R278.5增殖周期的影響及細胞凋亡的誘導作用。
1、實驗HB溶於二甲基亞礬，配成1μM/L、10μMm/L、100μMm/L和1mM/L濃度，避光保存備用。
人Hce-8693盲腸癌細胞株和獼猴胚胎幹細胞R278.5(雲南大學單克隆工程技術中心凍存)於10％BCS-DMEM 37℃、5％CO2中培養；擴細胞至35mm培養皿中，使其密度為5.0×104。
Hce-8693盲腸癌細胞、獼猴胚胎幹細胞R278.5分別培養，分為未給H B未光照空白組，未給HB光照20分鐘對照組，給HB 1μM/L、10μMm/L、100μMm/L和1mM分別光照5min、6min、10min和20min實驗組，每孔設平行孔，將細胞密度為5.0×104的35mm培養皿按實驗設計要求加入HB後，置37℃5％CO2中繼續培養2h，將此標本置於有冰袋的容器內，在離容器60cm處用一可見光(500W)光照(在可見光前置一紅外輻射熱隔離裝置)。光照畢，用PBS洗細胞三次，加入10％ BCS-DMEM培養液於37℃5％CO2中繼續培養2h，再用PBS洗細胞三次後終止細胞培養；用胰酶消化貼壁細胞後收集、離心、洗滌細胞，製成單細胞懸液(1×109/L)，50％冷乙醇固定，PBS洗滌二次；碘丙烷染色後，Coulter EPICS-XL流式細胞儀進行檢測，並進行結果分析處理。
2、結果(1)HB對獼猴胚胎幹細胞R278.5的凋亡誘導作用胚胎幹細胞是源於著床前囊胚、具有正常核型，並能在體外保持不分化態持續分裂生長的細胞系。本工作運用獼猴胚胎幹細胞，通過其凋亡率來評價光敏細胞毒性。從表5可以看出，在HB濃度較低時，所有光照細胞組均無凋亡產生，即其對細胞無毒性；而HB處於高濃度時，各光照細胞組均有凋亡發生，且其毒性效應與HB濃度及光照時間均無對應性。在給藥不光照時，HB對細胞無毒性。
表5 HB誘發的R278.5細胞凋亡(mean±SD，n＝3)

與對照組相比，bP＜0.01(2)HB對Hce-8693盲腸癌細胞的凋亡誘導作用從表6可以看出，在低濃度光照組HB即可誘導細胞發生調亡，且呈現劑量依賴效應，但其與光照時間無直接對應關係。無光照組無論HB濃度高低均不能誘導細胞調亡。
表6HB誘發的Hce-8693細胞凋亡(mean±SD，n＝3)

與對照組相比，bP＜0.01三、生物合成竹紅菌乙素抑制鼠移植性腫瘤實驗將黑色素瘤細胞B-16接種到C57純系小鼠皮下，造成黑色素瘤動物模型，以研究生物合成竹紅菌乙素對該腫瘤的光敏活性抑癌作用。
1、實驗(1)將實驗小鼠按表8分組標記全部實驗小鼠，建立小鼠檔案，稱重，計算注射劑量。
(2)黑色素瘤B-16細胞培養及細胞接種將培養處於對數生長的黑色素瘤B-16細胞接種到C57純系小鼠身上，每隻小鼠於左後肢皮下注射2×106細胞，0.2ml/只/次。
(3)藥物注射小鼠腫瘤移植成功後，測量腫瘤的大小，皮下注射HB，按0.25mg/g的劑量注射，每隻0.2ml。HB先用少量的DMSO溶解，再用已滅菌的PBS定容，DMSO不得超過20％。
表8 鼠移植性腫瘤HB光敏活性抑制實驗動物分組表

(4)光照處理注射藥物後6h及24h時分別用1300w新聞燈分組進行光照。光照部位正常皮膚部位以及腫瘤部位(光照前將需要光照部位的體毛剪去)。光照距離100cm。光照時間30min。光照時要放置冰袋和保持良好的通風狀態，以便儘可能降低光照時的溫度。
(5)觀察及病理檢查光照後分別於第2、7、14、21、28天處死小鼠2隻，取血、皮膚、肌肉、肺、心、肝臟、腸及腫瘤組織進行病理學檢查.。同時每天觀察小鼠腫瘤壞死情況，並用圓規、直尺測量腫瘤的大小，收集小鼠的尿液和糞便。
2、鼠移植性腫瘤HB光敏活性實驗結果對照組腫瘤平均直徑最大，實驗組1(即注射HB後6小時光照30分鐘)腫瘤平均直徑最小，其次為實驗組2(即注射HB後24小時光照30分鐘)，而實驗組3、4的腫瘤平均直徑差別不大。
在實驗中還觀察到，對照組腫瘤表面光滑，無壞死出血等現象。實驗組1腫瘤除平均直徑明顯減小外，其腫瘤均可見壞死、出血、結痴以及壞死部位中央出現凹陷，呈火山口狀等現象，且多數腫瘤完全壞死。實驗組2腫瘤壞死面積與實驗組1比較，壞死部位中央未出現凹陷，無火山口狀變化。實驗組3、4壞死面積很小，甚至無肉眼可見的壞死現象。
正常鼠第一次注射HB時，局部皮膚充血腫脹連續注射HB14天，注射部位的皮膚增厚，未出現壞死。
該實驗表明HB對小鼠移植性實體腫瘤有明顯的殺傷治療效果和顯著的抑制腫瘤生長作用。
四、生物合成竹紅菌乙素小鼠經口(光照)急性毒性試驗結果急性毒性試驗分二組實驗完成。第一組實驗為低劑量組試驗目的是確定安全劑量範圍。第二組實驗為光敏化合物限度試驗目的是求出最大耐受量MTD。
(1)低劑量試驗結果經口灌藥後，大部分試驗小鼠運動困難，臥而不動，喘氣、呼吸緩慢，稍後能緩慢運動。1小時後運動能力增強，但呼吸還仍較困難。2小時後，添加飼料，少部分小鼠有進食現象。3小時後，大部分小鼠有進食現象，小鼠運動基本恢復正常。4小時後，小鼠活動正常，但精神狀況與對照組相比要差。第二天小鼠精神狀況完全恢復。連續15天觀察未見動物出現任何中毒反應，一般情況良好，毛色光亮，活動自如，食慾正常，糞便成型，黃褐色。體重在15天生長中每組都略有增長，全部動物存活。結果測定HB小鼠經口給藥劑量為4.1g/kg，按50kg體重計算相當於臨床推薦用量20mg/kg體重的205倍，用於臨床是安全的。
(2)限度試驗結果從低劑量試驗中已知HB是低毒化合物。按美國FDA規定，毒性低的化學物，PO大於5g/kg(也就是100mg/20g)無任何死亡，便可視為無毒，此劑量即為MTD(最大耐受量)。稱HB3.6g，先用少量DMSO溶解，再用已滅菌的PBS定容至25ml(DMSO不超過20％)，其溶液的濃度為144mg/ml，每隻鼠給藥0.8ml，即1152mg/只/次，本次實驗鼠的均重為22g，即HB的劑量為5.24g/kg(實際上用藥劑量的數值)，因而實際用的劑量略大於美國ma規定的低毒化學物MTD的5g/kg劑量。灌完藥物時，大部分鼠不能運動，稍後能緩慢的運動，少部分的鼠灌藥後就能緩慢的運動。連續15天觀察，未見動物出現任何中毒反應，神經、呼吸、心血管等系統情況良好，老鼠的毛色光亮，活動自如，食慾正常，糞便成型，呈黃褐色，體重在15天生長中每組都有增長。
五、小鼠體內生物合成竹紅菌乙素的組織分布試驗結果抗腫瘤藥是否能在腫瘤部位的濃集而發揮作用是決定其療效的一個重要方面，而其進入機體後的代謝過程及是否會影響正常組織器官的生理功能也是決定其療效的另一重要方面。因此研究抗腫瘤藥物不同給藥途徑以及不同劑型在體內的組織分布是一項重要而不可缺少的工作。高效液相色譜(high Performance liquid chromatograPhy，HPLC)具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度高和應用範圍廣的特點，適用於揮發性低、熱穩定性差、分子量大、沸點高及極性強的化合物的分離和分析。實驗採用高效液相色譜法(HPLC)研究了HB經口灌注進入小鼠體內後其在小鼠體內組織及排洩物中的分布。結果表明，小鼠經口灌注HB後，經胃腸毛細血管吸收入血，首先進入肝門靜脈，經肝臟的首過消除效應後，在腫瘤、肝臟、肺等組織中有分布。在腫瘤中的分布濃度不高，在糞便中的濃度很高，說明其經口服的選擇性不好。HB在肝臟中的分布濃度較高，說明其大部分在肝臟首過效應中消除並與肝臟的親和力較高HB基本不由腎濾過排出，主要是由肝腸途徑後由糞便排出。給藥途徑不同，可因其吸收、分布、代謝、排洩的不同而使藥物的效應強弱不同，甚至可改變效應的質。口服是最常用的給藥方法，其主要優點是方便、經濟、安全，適用於大多數藥物和病人，其主要缺點是吸收較慢而不規則，且易受胃腸內容物的影響，藥物在達到全身循環之前就可在肝內破壞。若需藥物發揮局部治療作用，可以採用局部給藥方法。HB經口服給藥，在肝臟和糞便中濃度最高，不能濃集在腫瘤部位，而是被肝臟的首過效應消除，經肝腸途徑排出，這對於腫瘤的治療是不利的。可以通過改變給藥途徑如採取靜脈給藥或局部皮下給藥等來解決這一問題。
本發明的有益效果是對已知化合物生物合成竹紅菌乙素HB發掘了作為製備抗癌藥物的醫療用途，開拓了重要的應用領域。生物合成竹紅菌乙素屬於周期性特異性藥物，能使細胞增殖阻斷於G1期，並誘導腫瘤細胞凋亡，具有抑制瘤細胞增殖的作用，可製備成低毒高效的抗癌藥物，具有很好的藥用前景。
具體實施例方式
見以下實施例用HB製成抗癌藥物治療外陰白色病變。外陰白色病變為皮膚癌。將生物合成竹紅菌乙素用醫用凡士林配成6％的軟膏(含HB的重量比)，塗抹於患者的外陰白色病變部位，並用200瓦的白織燈照射20分鐘，每天一次，每個療程30次。經臨床治療41例，有效率為98％。
以上實施例僅對發明做進一步的說明，而本發明的範圍不受所舉實施例的局限。
權利要求
1.生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用。
2.如權利要求1所說的生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用，其特徵是以生物合成竹紅菌乙素作為藥物有效成分，製成醫學上可以接受的劑型，施用於癌症患者，並進行光照。
全文摘要
本發明涉及生物合成竹紅菌乙素在製備抗癌藥物中的應用。已知的化合物生物合成竹紅菌乙素屬於苝醌化合物，其分子式為C
文檔編號A61K31/122GK1686093SQ20051001074
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月13日 優先權日2005年4月13日
發明者李聰, 臺虹, 馬嵐, 歐靈澄, 陳遠騰, 荷嚴萍 申請人:雲南大學