基於MEMs技術的三維細胞培養晶片、製備方法及其應用的製作方法

2023-04-26 19:05:16 1

專利名稱：基於MEMs技術的三維細胞培養晶片、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於細胞培養晶片領域，特別是涉及一種基於MEMs技術的三維細胞培養晶片、製備方法及其應用。
背景技術：
目前在體外研究細胞時，大多用貼壁的方式進行二維平面培養，與體內狀態(三維立體狀態)有較大的區別。這種二維細胞培養並不是細胞生長的天然狀態，因而細胞的基因表達、信號轉導和形態學都可能與天然有異。而且二維細胞培養還有很多明顯的缺陷。 首先是，細胞的分化不均一，不利於細胞分化研究及其相關的研究。其次是，二維培養時細胞數量較多，而其中有用細胞數目很難分選，且浪費試劑。將微電子機械蝕刻技術與細胞培養技術相結合所製備的細胞培養晶片具有明顯的優勢。該晶片能為細胞培養提供理想的環境，從而允許細胞按照預先設計的圖案聚集、三維生長和分化。這個優勢使得上述晶片的三維培養環境非常接近於體內。基於MEMs技術的3D細胞培養系統的新穎性、先進性、獨特性和產品的競爭優勢在於
①三維培養系統能使細胞共同生長、互相交流和形成三維的結構，細胞功能狀態和細胞形狀更加接近體內狀態；
②相比於其他的三維培養系統(如多孔生物材料支架)而言，能夠通過預先設置的表面圖案精確控制三維細胞球體的形狀和細胞數目並且能長久保持細胞的同質性；
③能增加細胞功能產物的分泌；
④能降低細胞死亡率；
⑤能大幅提聞幹細胞分化效率；
⑥方法相當簡單，任何對腫瘤基礎研究、藥物開發、幹細胞或再生醫學感興趣的實驗室都可以將此系統作為三維細胞培養的起點。與此同時，由於細胞培養的特殊性，晶片製備過程中材料的選擇和製備過程的優化也顯得尤為重要，生物相容性差的材料可能抑制細胞的生長或者分化，影響對於細胞正常生理生化狀態和分化過程的研究以及實驗結果的可靠性。

發明內容
為克服上述不足，本發明的目的是提供一種基於MEMs (微電子機械蝕刻)技術的三維細胞培養晶片、製備方法及其應用，其能為細胞培養提供更接近於體內的理想環境，從而允許細胞按照預先設計的圖案聚集、三維生長或分化。
發明人意外地發現，使用su8-50光刻膠作為三維細胞培養晶片材料時，具有生物相容性好，細胞生長狀態好，分化效率高的特點。本發明提供了一種基於MEMs (微電子機械蝕刻)技術的三維細胞培養晶片的製備方法，包括步驟
首先將膠原溶液旋塗(spin coating)在玻璃基片上，在室溫無菌條件下晾乾。然後再使用旋塗(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8_50光刻膠，85°C烘乾，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，經過紫外線(UV)照射曝光，90°C烘乾，顯影，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，95°C烘乾，即獲得所述三維細胞培養晶片。所述的膠原可以是鼠尾膠原，特別的可以是鼠尾膠原蛋白I型，所述膠原包被濃度可以為5-15 μ g/cm2,優選為5 μ g/cm2
所述的室溫無菌條件下晾乾為在超淨臺上放置晾乾或是在無菌間內室溫晾乾。所述晾乾時間可以是1-24小時，優選是過夜或12小時。
所述的玻璃基片優選是直徑22mm的圓形玻璃基片。所述Su8-50光刻膠的旋塗可以分兩次進行，第一次轉速650rpm，時間10s，第二次轉速3500rpm，時間20s。所述85°C烘乾優選是在85°C熱板上烘乾10分鐘；所述90°C烘乾優選是在90°C熱板上烘乾90s ;所述95°C烘乾優選是在95°C熱板上烘乾I分鐘。所述的預先刻錄好圖案的石英模板是按照實際需求在石英板上設計的圖案，經過無菌處理後晾乾。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，優選可以是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。優選地，利用本方法所述製備方法製備的三維細胞培養晶片上將包含若干個圓形微區(microdomain),直徑100 μ m,圓形微區間的距離同樣是100 μ m。所述的漂洗和烘乾過程均為無菌環境。優選地，本發明提供了一種所述晶片的製備方法，包括步驟首先用無菌乙酸(O. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為O. 025mg/ml的膠原溶液，並將其旋塗(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上,包被濃度為5 μ g/cm2,在超淨臺上放置過夜晾乾。然後再使用旋塗(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋塗分兩次進行，第一次轉速650rpm，時間10s，第二次轉速3500rpm，時間20s，在85°C熱板上烘乾10分鐘，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘乾90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，後在95°C熱板上烘乾I分鐘，即獲得所述三維細胞培養晶片。特別的，所述刻錄好圖案可以是任意圖案，優選可以是直徑ΙΟΟμπι的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。優選地，利用本方法所述製備方法製備的三維細胞培養晶片上將包含若干個圓形微區，直徑100 μ m,圓形微區間的距離同樣是100 μ m。在一個方面，本發明提供了一種基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法所製備出的三維細胞培養晶片。特別的，本發明提供了由本發明中任意製備方法所製備的三維細胞培養晶片。
在另外一個方面，本發明還提供了本發明所述基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法在細胞遷移、細胞分化或細胞之間相互作用的研究中的應用。在另外一個方面，本發明還提供了本發明所述基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法在細胞培養中的應用。特別的，上述應用中所述細胞可以是動物細胞或植物細胞。特別的，上述應用中所述細胞可以是正常細胞或腫瘤細胞。特別的，上述應用中所述細胞可以是HH細胞(牛主動脈上皮細胞)、ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)。特別的，所述ES細胞(胚胎幹細胞)可以是hESC BGOlV細胞。特別的，所述培養可以是三維培養。
特別的，所述培養可以是分化培養。優選的，本發明提供了本發明所述基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法在ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)三維培養中的應用。優選的，所述應用為細胞生物學基礎研究、幹細胞分化與誘導機制基礎研究、三維培養機制研究、藥物篩選、細胞(包括幹細胞)培養條件優化和/或臨床醫學中的細胞治療。在另外一個方面，本發明還提供了本發明所述基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法所製備出的三維細胞培養晶片在細胞遷移、細胞分化或細胞之間相互作用的研究中的應用。在另外一個方面，本發明還提供了本發明所述基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法所製備出的三維細胞培養晶片在細胞培養中的應用。特別的，所述細胞可以是動物細胞或植物細胞。特別的，所述細胞可以是正常細胞或腫瘤細胞。特別的，上述應用中所述細胞可以是HH細胞、ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)。特別的，所述ES細胞(胚胎幹細胞)可以是hESC BGOlV細胞。特別的，所述培養可以是三維培養。特別的，所述培養可以是分化培養。優選的，本發明提供了一種基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備方法所製備出的三維細胞培養晶片在ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)三維培養中的應用。優選的，所述應用為細胞生物學基礎研究、幹細胞分化與誘導機制基礎研究、三維培養機制研究、藥物篩選、細胞(包括幹細胞)培養條件優化和/或臨床醫學中的細胞治療。
本發明的有益效果
(1)利用光刻膠將培養區間格成小室，能使細胞共同生長、互相交流並形成三維的結構，細胞功能狀態和細胞形狀更加接近體內狀態；
(2)利用MEMs技術，能夠通過預先設置的表面圖案精確控制三維細胞球體的形狀和細胞數目並且能長久保持細胞的同質性；
(3)利用玻璃平板作為基片有利於觀察細胞的生長狀況；(4)100 μ m圓形微區圖案的選擇有利於細胞的三維生長及分化；
(5)su8-50光刻膠應用於生物晶片的報導很少，也均沒有應用於三維細胞培養的報導，同時三維細胞培養晶片製備過程中，各個步驟參數的選擇例如膠原的濃度、光刻膠包被厚度、烘乾溫度和時間、圖案的選擇等對於所製備晶片的培養性能均影響很大。發明人經過不斷地試驗和探索，獲得了利用suS-50製備基於MEMs (微電子機械蝕刻技術)技術的三維細胞培養晶片的方法，所獲得的晶片具有生物相容性好，細胞生長狀態好，分化效率高的特點。



圖I是低放大倍數下HH細胞形態。圖2是高放大倍數下HH細胞形態。圖3是高放大倍數下ES細胞形態。圖4是低放大倍數下MSC細胞形態。圖5是MSC細胞存活染色結果。其中，左上圖為鈣黃綠素(Calcein AM)染色結果，右上圖為碘化丙啶(PI)染色結果，左下圖為白光結果，右下圖為三圖融合結果(Merge)。圖6是MSC細胞分化為脂肪細胞過程中脂肪細胞特異性標誌物表達。圖7是MSC細胞分化為成骨細胞過程中成骨細胞特異性標誌物表達。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明內容講授的內容之後，本領域技術人員可對本發明做各種改動和修改，這些等效形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實驗材料
下述實施例中，膠原採用鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml),購自杭州生友生物技術有限公司；su8_50光刻膠及su8顯影液均購自MicroChem公司，P-PEG購自Toyo gosei公司，HH細胞系購自JCRB cell bank(JCRB0099);所用ES細胞為hESC BG01V，該細胞系及培養所用DMEM F12培養基均購自ATCC，人骨髓間充質幹細胞MSCs及培養所用骨髓間充質幹細胞基礎培養基均購自Cambrex公司。
實施例I、三維細胞培養晶片的製備
A、基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備(su8-50晶片)
首先用無菌乙酸(O. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為O. 025mg/ml的膠原溶液，並將其旋塗(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上，包被濃度為5 μ g/cm2，在超淨臺上放置過夜晾乾。然後再使用旋塗(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋塗分兩次進行，第一次轉速650rpm，時間10s，第二次轉速3500rpm，時間20s，在85°C熱板上烘乾10分鐘，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘乾90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，後在95°C熱板上烘乾I分鐘，即獲得所述三維細胞培養晶片。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，本實施例中所米用的是圖案是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。利用本方法所製備的三維細胞培養晶片上將包含若干個圓形微區，直徑100 μ m，圓形微區間的距離同樣是100 μ m。為簡單起見，將上述晶片命名為su8-50晶片。
B、基於MEMs技術的三維細胞培養晶片的製備(P-PEG晶片)
首先製備濃度為O. 3%的膠原溶液，並將其包被在直徑22mm的圓形玻璃基片上，在細胞培養條件下凝膠2小時，並在37°C晾乾2天。然後將P-PEG包被在上述膠原包被的基片上(第I次轉速為500rpm，5s，第2次轉速為3000rpm，30s)，在60°C熱板上烘乾，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，經過紫外線(UV)照射曝光，顯影，在水中樹脂化，再在60°C熱板上烘乾，即獲得所述三維細胞培養晶片。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，本實施例中所米用的是圖案是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。利用本方法所製備的三維細胞培養晶片上將包含若干個圓形微區，直徑100 μ m，圓形微區間的距離同樣是100 μ m。為簡單起見，將上述晶片命名為P-PEG晶片。
實施例2、HH細胞的培養結果
按常規方法培養HH細胞，將HH細胞系(牛主動脈上皮細胞)接種於實施例I所製備的SU8-50晶片微區上進行培養，接種密度為5X IO5個/晶片，培養所用培養基為添加10%胎牛血清的常規MEM培養基；培養2天後，如圖I和圖2所示，細胞呈三維生長，生長形態良好。
實施例3、ES細胞的培養結果
按常規方法培養ES細胞(hESC BG01V)，將ES細胞接種於實施例I所製備的su8_50晶片微區上進行培養，接種密度為3X IO5個/晶片，培養所用培養基為DMEM F12培養基；培養3天後，如圖3所示，細胞呈三維立體生長，生長形態良好。
實施例4、MSC細胞的培養及分化結果
A、骨髓間充質幹細胞(MSC)的培養
將傳代第5次的人骨髓間充質幹細胞，以6X IO5個/晶片的密度接種在實施例I所製備的兩種晶片(su8-50晶片和P-PEG晶片)的微區上進行培養，培養所用培養基為間充質細胞基礎培養基；在細胞球形成以後，每3天更換一次培養基。培養3天後，如圖4所示，細胞呈三維立體生長，生長形態良好。B、三維骨髓間充質幹細胞球存活/死亡染色
按常規方法對於三維骨髓間充質幹細胞球進行細胞存活/死亡染色，首先用PBS溶液漂洗細胞三次，然後加入混合後的LIVE/DEAD檢測試劑(Sigma)，37°C孵育40分鐘，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況。如圖5所示，細胞全部為存活狀態，生長狀態良好。
C、三維骨髓間充質幹細胞球的分化 (O向脂肪細胞分化
按常規方法誘導三維骨髓間充質幹細胞球分化為脂肪細胞，每3天更換一次培養基，直到細胞100%長滿，將培養基替換為脂肪細胞分化培養基(含有L-穀氨醯胺和地塞米松)以誘導脂肪細胞發生。誘導5-7天後，在光學顯微鏡下觀察到細胞中形成脂滴，說明骨髓間充質幹細胞向脂肪細胞分化。 (2)向成骨細胞分化
按常規方法誘導三維骨髓間充質幹細胞球分化為成骨細胞，每3天更換一次培養基，直到細胞50%-70%長滿，將培養基替換為成骨細胞分化培養基(含有L-穀氨醯胺、地塞米松和抗壞血酸鹽)以誘導成骨細胞發生。誘導7天後，在顯微鏡下觀察到細胞體積增大，變得狹長，似魚群樣排列，說明骨髓間充質幹細胞向成骨細胞分化。
D、使用RT-PCR法定量測定三維骨髓間充質幹細胞球分化的RNA水平 (O實驗方法
首先從培養的細胞中提取出總RNA，用常規的RT-PCR獲得cDNA，對cDNA樣品進行PCR檢測。我們選取本領域常規使用的PPAR-Y基因作為脂肪細胞分化的一個標誌物，選擇ALP基因作為成骨細胞分化的一個標誌物，選擇GAPDH基因作為內參。所用PCR弓丨物序列分別為
3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)
上遊5』 -GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3』，
下遊5』 -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3』，
過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-Y)
上遊5』 -TCAGGTTTGGGCGGATGC-3』，
下遊5』 -TCAGCGGGAAGGACTTTATGTATG-3』
鹼性磷酸酶(ALP)
上遊5』 -GACCCTTGACCCCCACAAT-3』，
下遊5，-GCTCGTACTGCATGTCCCCT-3，.
擴增條件如下初始變性94°C，5min，隨後變性94°C，30s，退火59_70°C，45s，延伸72°C，45s，進行30個循環，最後延伸72°C，10分鐘。在擴增實施例I中兩種三維細胞培養晶片(su8-50晶片和P-PEG晶片)培養的骨髓間充質幹細胞球樣本以外，還使用單層細胞培養方法培養分化的骨髓間充質幹細胞進行擴增，作為對照，所述單層培養按本領域常規進行，其他條件均與三維細胞晶片培養相同。RT-PCR法均進行三組平行測定，數據顯著性分析使用單尾t檢驗，顯著性使用95%概率值確定。
(2)PPAR-Y基因表達實時定量PCR檢測
通過實時定量PCR獲得PPAR-Y基因與內參基因GAPDH的表達水平，確定不同分化時間點(第8天、第16天、第26天)標誌基因的表達變化。以單層細胞培養組分化第8天時為基數。
從圖6可以清楚看出，與單層細胞培養組和P-PEG晶片組相比，使用su8_50晶片培養分化的骨髓間充質幹細胞中脂肪細胞特異性標誌物PPAR-Y的表達顯著均提高(P〈0. 05)，誘導分化為脂肪細胞的效率大大提高。
(3)ALP基因表達實時定量PCR檢測
通過實時定量PCR獲得ALP基因與內參基因GAPDH的表達水平，確定不同分化時間點(第3天、第6天、第10天)標誌基因的表達變化。以單層細胞培養組分化第3天時為基數。從圖7可以清楚看出，與單層細胞培養組和P-PEG晶片組相比，使用su8-50晶片培養分化的骨髓間充質幹細胞中成骨細胞特異性標誌物ALP的表達均顯著提高(P〈0. 05)，誘導分化為成骨細胞的效率大大提高。
權利要求
1.一種基於MEMs (微電子機械蝕刻)技術的三維細胞培養晶片的製備方法，包括步驟 首先將膠原溶液旋塗(spin coating)在玻璃基片上，在室溫無菌條件下晾乾；然後再使用旋塗(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8_50光刻膠，85°C烘乾，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，經過紫外線(UV)照射曝光，90°C烘乾，顯影，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，95°C烘乾，即獲得所述三維細胞培養晶片。
2.如權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述膠原可以是鼠尾膠原，特別的可以是鼠尾膠原蛋白I型。
3.如權利要求I或2所述的製備方法，其特徵在於，所述膠原的包被濃度可以為5-15 μ g/cm2,優選為 5 μ g/cm2。
4.如權利要求1-3任一所述的製備方法，其特徵在於，所述的室溫無菌條件下晾乾為在超淨臺上放置晾乾或是在無菌間內室溫晾乾；所述晾乾時間可以是1-24小時，優選是過夜或12小時。
5.如權利要求1-4任一所述的製備方法，其特徵在於，所述的玻璃基片優選是直徑22mm的圓形玻璃基片。
6.如權利要求1-5任一所述的製備方法，其特徵在於，所述suS-50光刻膠的旋塗分兩次進行，第一次轉速650rpm，時間10s，第二次轉速3500rpm，時間20s。
7.如權利要求1-6任一所述的製備方法，其特徵在於，所述85°C烘乾優選是在85°C熱板上烘乾10分鐘；所述90°C烘乾優選是在90°C熱板上烘乾90s ;所述95°C烘乾優選是在95 °C熱板上烘乾I分鐘。
8.如權利要求1-7任一所述的製備方法，其特徵在於，所述的預先刻錄好圖案的石英模板是按照實際需求在石英板上設計的圖案，經過無菌處理後晾乾。
9.如權利要求1-8任一所述的製備方法，其特徵在於，所述刻錄好圖案可以是任意圖案。
10.如權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，所述刻錄好圖案優選是直徑100μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。
11.如權利要求ι- ο任一所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法製備的三維細胞培養晶片上包含若干個圓形微區(microdomain),直徑100 μ m,圓形微區間的距離同樣是 100 u rtio
12.如權利要求1-11任一所述的製備方法，其特徵在於，所述的漂洗和烘乾過程均為無菌環境。
13.如權利要求1-12任一所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括步驟首先用無菌乙酸(0. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為0. 025mg/ml的膠原溶液，並將其旋塗(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上,包被濃度為5 μ g/cm2,在超淨臺上放置過夜晾乾；然後再使用旋塗(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋塗分兩次進行，第一次轉速650rpm，時間10s，第二次轉速3500rpm，時間20s，在85°C熱板上烘乾10分鐘，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘乾90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，後在95°C熱板上烘乾I分鐘，即獲得所述三維細胞培養晶片。
14.如權利要求13所述的製備方法，其特徵在於，所述刻錄好圖案可以是任意圖案。
15.如權利要求14所述的製備方法，其特徵在於，所述刻錄好圖案優選是直徑100μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。
16.如權利要求1-15所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法製備的三維細胞培養晶片上將包含若干個圓形微區，直徑100 μ m,圓形微區間的距離同樣是100 μ m。
17.如權利要求1-16任一所述的製備方法所製備出的三維細胞培養晶片。
18.如權利要求1-16任一所述的製備方法或如權利要求17所述的三維細胞培養晶片在細胞遷移、細胞分化或細胞之間相互作用的研究中的應用。
19.如權利要求1-16任一所述的製備方法或如權利要求17所述的三維細胞培養晶片在細胞培養中的應用。
20.如權利要求18或19的應用，其特徵在於，所述細胞可以是動物細胞或植物細胞。
21.如權利要求18或19的應用，其特徵在於，所述細胞可以是正常細胞或腫瘤細胞。
22.如權利要求18-21任一的應用，其特徵在於，所述細胞可以是HH細胞(牛主動脈上皮細胞)、ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)。
23.如權利要求22的應用，其特徵在於，所述ES細胞(胚胎幹細胞)可以是hESCBGOlV細胞。
24.如權利要求18-23任一的應用，其特徵在於，所述培養可以是三維培養。
25.如權利要求18-24任一的應用，其特徵在於，所述培養可以是分化培養。
26.如權利要求18-25任一的應用，其特徵在於，所述應用為在ES細胞(胚胎幹細胞)或MSC細胞(骨髓間充質幹細胞)三維培養中的應用。
27.如權利要求18-26任一的應用，其特徵在於，所述應用為細胞生物學基礎研究、幹細胞分化與誘導機制基礎研究、三維培養機制研究、藥物篩選、細胞(包括幹細胞)培養條件優化和/或臨床醫學中的細胞治療。
全文摘要
本發明涉及一種基於MEMs技術的三維細胞培養晶片、製備方法及其應用，所述晶片的製備方法包括步驟首先將膠原溶液旋塗在玻璃基片上，在室溫無菌條件下晾乾。然後再使用旋塗的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，85℃烘乾，然後覆蓋上預先刻錄好圖案的石英模板，經過紫外線照射曝光，90℃烘乾，顯影，用乙酸丁酯漂洗1min，再用清水漂洗10分鐘，95℃烘乾，即獲得所述三維細胞培養晶片。本發明的三維細胞培養晶片具有方便、精確、集約的特性，可以精確控制多細胞三維結構模擬細胞體內的行為特徵和生長環境，為研究細胞間的相互作用提供了方便，可用於研究細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的作用，使體外細胞研究環境更接近體內細胞環境。
文檔編號C12N5/07GK102816694SQ201210085698
公開日2012年12月12日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者王文杰 申請人:王文杰, 上官俊龍, 閆翊斐, 趙青