一種合相色譜‑串聯質譜法測定煙用紙張中偶氮染料釋放的特定芳香胺的方法與流程
2023-04-26 15:14:26 2
本發明屬於煙用材料中有害物質殘留的理化檢驗技術領域，主要涉及偶氮染料釋放的致癌芳香胺的測定技術，具體說是偶氮染料在檸檬酸緩衝溶液中被連二亞硫酸鈉還原成芳香胺，然後經固相萃取淨化後，氮吹濃縮，用合相色譜串聯質譜聯用儀進行測定，內標法定量。
背景技術：
偶氮染料是指分子結構中含有偶氮基-n=n-的染料。通常研究認為，偶氮染料其結構本身通常不會對人體產生有害影響，但有一些用「芳胺類中間體」合成的偶氮染料，因其與人體皮膚長期接觸之後，會因人表麵皮膚的弱酸環境，極易發生還原反應並使偶氮基斷裂，生成大量芳胺類化合物。其反應式如下：
而這類化合物往往存在著嚴重致癌性，極易使人體細胞誘發病變，對人體皮膚甚至膀胱、輸尿管等器官會產生極其嚴重的致癌損害，是應該被明令禁止的。這種違禁的偶氮染料，也被稱為「致癌芳香胺染料」。
目前，禁用偶氮染料的檢測是基於檢測樣品經還原分解後，是否存在有害的芳香胺，繼而反推樣品是否使用了禁用的偶氮染料。禁用偶氮染料的檢測通常需經歷以下四步：(1)樣品預處理；(2)還原分解，在此過程中偶氮染料與還原劑發生反應；(3)萃取和濃縮，即將還原生成的芳香胺萃取到有機溶劑中，並經濃縮後定容；(4)用先進分析儀器進行檢測。
芳香胺的測定方法主要有氣相色譜法（gc）[胡慶蘭，鄭平，段連生.頂空固相萃取-氣相色譜法測定水中芳香胺類化合物[j].華中師範大學學報，2012，46(4):452-455.]、氣相色譜質譜聯用法（gc-ms）[洪小燕，溫裕雲，林芳，等.土壤及沉積物中25種芳香胺的固-液-液萃取及氣相色譜-質譜測定方法初步研究[j].分析測試學報，2010,29(1):31-34.]、液相色譜法（hplc）[王卉卉，牛增元，葉曦雯，等.染色紡織品與皮革製品中23種禁用偶氮染料的高效液相色譜法測定[j].分析測試學報，2009,28(8):944-948.]和液相色譜質譜聯用法（lc-ms）[孫銀峰，牛增元，葉曦雯，等.液相色譜/質譜法測定電氣產品塑料部件中的初級芳香胺[j].分析化學，2009,37(6):861－866.]。但這些方法均存在一定的局限性，gc和hplc通常靈敏度和定性能力較差，因此可能出現假陽性結果。gc-ms和hplc-ms靈敏度較高，具有一定的選擇性，但在複雜基質體系中也容易受到基質的幹擾，定性能力不如串聯質譜。中國專利（201410041729.3）公開了《一種煙用紙張中禁用偶氮染料的測定方法》，其中涉及到芳香胺檢測，該專利結合液液萃取和液相色譜串聯質譜技術，大大提高了分析靈敏度和檢測效率，但是由於這些芳香胺結構相似，且大多數都有同分異構體的現象，所以採用普通的液相色譜並不能將這些芳香胺很好的分離，且偶爾會有假陽性的結果出現，比如2，4-二甲基苯胺和2，6-二甲基苯胺屬於同分異構體，普通的液相色譜不能很好的分離。本專利申請採用的超高效合相色譜（ultraperformanceconvergencechromatography,upc2）技術是近年來提出的一種分離技術。該技術基於超臨界流體色譜技術原理，其流動相以超臨界co2為主要組成，輔助少量的有機溶劑，具有黏度低、傳質性能好、分離效率高、綠色環保的優勢；同時，該系統基於超高效液相色譜技術平臺，以及亞2μm的色譜柱技術，使得儀器的可操控性能、重現性、精密度等方面有較大的進步，特別適合於異構體的分離檢測。
技術實現要素：
本發明的目的旨在克服現有技術缺陷，提供一種煙用紙張中偶氮染料釋放出的芳香胺殘留量的測定方法，即在弱酸性條件下，加入還原液進行還原分解，然後進行固相萃取、氮吹濃縮後直接以合相色譜-串聯質譜測定樣品中芳香胺，該方法能快速、準確檢測煙用紙張中芳香胺，測定結果準確，基質幹擾少。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種煙用紙張中偶氮染料釋放出的芳香胺殘留量的測定方法，具體包括以下步驟：
a、樣品的提取：將樣品剪成5mm×5mm左右的碎片，混合均勻；稱取1.0g樣品，將樣品置於50ml具塞離心管中，加入15ml預熱至70±2℃的檸檬酸緩衝液，猛烈搖動，使液體浸透樣品，於70±2℃水浴中放置30min；加入200mg/ml連二亞硫酸鈉水溶液3ml，保持70±2℃，反應30min，然後將離心管置於冰水浴中於2min內冷卻至室溫；
b、樣品淨化：往離心管中分別加入0.5ml的質量分數為40%的氫氧化鈉溶液和100µl內標工作溶液，之後將離心管中的上層液體全部倒入提取柱中，任其吸附10～20min，然後用4*20ml叔丁基甲醚分4次洗提離心管中的下層樣品，每次均需混勻叔丁基甲醚和樣品，然後將叔丁基甲醚洗液倒入該提取柱中，收集叔丁基甲醚洗脫液於三角瓶中，往三角瓶中加入5～8g的無水硫酸鈉；
c、樣品濃縮：移取8ml的洗脫液於帶刻度的10ml氮吹管中，氮吹至近幹，加入1ml的甲醇復溶，進upc2-ms/ms分析；
d、準備標準工作溶液：稱取0.01g各芳香胺的標準品到同一個10ml容量瓶中，用甲醇稀釋並最終配製成具有濃度梯度的標準工作溶液；
e、合相色譜-串聯質譜測定:吸取配製好的不同濃度的標準工作溶液，注入合相色譜-串聯質譜儀進行測定；
f、芳香胺殘留量測定結果的計算
以內標法進行殘留量的定量分析，即以目標物和內標的定量離子對峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線，相關係數大於等於0.99，對提取後的樣品進行測定，測得檢出分析物和內標的定量離子對峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中各種芳香胺的殘留量。
本發明所述內標為d9-4-氨基聯苯，內標工作溶液的配製方法如下：稱取0.01gd9-4-氨基聯苯標準品到10ml容量瓶中，用甲醇稀釋得到濃度為10μg/ml的內標工作溶液。
所述提取柱為迪馬科技的proelutazo固相萃取小柱。
在本發明中，標準工作溶液的配製方式如下：稱取10mg標準品到10ml容量瓶中，精確至0.0001g，用甲醇定容，配製成濃度為1.0mg/ml的混合標準儲備液；移取該混合標準儲備液100μl於10ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，得到濃度約為10μg/ml的工作溶液；分別移取一定體積的工作溶液於10ml容量瓶中，並加入100μl內標工作溶液，用甲醇稀釋定容，即配製成不同濃度的標準工作溶液，系列標準工作溶液中各芳香胺的含量分別為：0.5µg，1.0µg，2.0µg，5.0µg和10µg。
合相色譜-串聯質譜條件具體如下：色譜柱：規格100mm×3.0mm，1.7µm的upc2fluoro-phenyl柱；流動相：超臨界co2/甲醇，流速：2ml/min；梯度洗脫條件如表1；柱溫：50℃；背壓：1800psi；進樣量：2µl；離子源：電噴霧離子源(esi)；掃描方式：正離子掃描；毛細管電壓：2.6kv；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣體流速：800l/h；錐孔氣體流速：50l/h；補償溶劑：0.1%甲酸甲醇溶液，流速為0.2ml/min；檢測方式：多離子反應監測（mrm）；mrm參數見表2。
表2質譜條件
本發明的方法克服了現有技術樣品處理方法的不足，針對煙用紙張樣品優化了樣品前處理方法和儀器檢測條件。與現有技術相比本發明方法具有如下優良效果：
（1）本發明萃取液經過固相萃取，減少了基質的幹擾。
（2）本發明方法利用內標法測定煙用紙張中芳香胺的含量，避免了基質效應，抵消了體積變化對定量的影響，而且同時進行定量和定性分析，無需再使用其他儀器進行定性分析。
（3）本發明的標準曲線採用芳香胺的絕對質量作為橫坐標，省去了定量過程繁雜的計算過程。
（4）由於芳香胺的結構相近、異構體眾多，本發明方法採用合相色譜對芳香胺進行分離，可以降低結構相近的物質對目標物的幹擾，使得該方法具有操作準確、回收率高、快速簡便及靈敏度高等優點。合相色譜技術是基於超臨界流體色譜技術原理，其流動相以超臨界co2為主要組成，輔助少量的有機溶劑，具有黏度低、傳質性能好、分離效率高、綠色環保的優勢，特別適合於異構體的分離檢測；採用固相萃取和內標法相結合，洗脫液部分濃縮，大大縮短了濃縮時間，也減少了幹擾物的影響。
①本發明方法的檢測限：
將不同濃度的標準工作溶液注入upc2－ms/ms，以3倍信噪比（s/n=3）計算檢測限（lod），以10倍信噪比（s/n=10）計算檢測限（loq），見表3。
②本發明方法的重複性和加標回收率見表3：
在空白樣品中加入芳香胺的標準溶液，然後分別按本發明的方法進行前處理和upc2－ms/ms分析，並按照加標量和測定值計算其回收率，結果見表3。由表3可以看出方法穩定性良好，平均相對標準偏差（rsd）小於6%，說明本發明重複性好。
附圖說明
圖1為本發明的測定方法流程圖（該圖作為摘要附圖）。
具體實施方式
本發明以下結合實例做進一步描述，但並不是限制本發明。
實例1：
1．儀器與試劑：
叔丁基甲醚、甲醇均為色譜級試劑，氫氧化鈉，硫酸鈉均為分析純試劑；蒸餾水，符合gb/t6682中一級水的要求。
upc2-ms/ms四極杆串聯質譜儀；水浴恆溫振蕩器；瑞士mettlerae163電子天平（感量：0.0001g）。
2．樣品處理：
稱取1.0g樣品（精確至0.0001g）；將碎片置於50ml具塞三角瓶中，將樣品置於50ml具塞離心管中，加入15ml預熱至70±2℃的檸檬酸緩衝液，猛烈搖動，使液體浸透樣品，於70±2℃水浴中放置30min；加入200mg/ml連二亞硫酸鈉水溶液3ml，保持70±2℃，反應30min，然後將離心管置於冰水浴中於2min內冷卻至室溫；
往離心管中分別加入0.5ml的質量分數為40%的氫氧化鈉溶液和100µl內標工作溶液，之後將離心管中的上層液體全部倒入偶氮專用提取柱（即迪馬科技的proelutazo固相萃取小柱）中，任其吸附15min，用4*20ml叔丁基甲醚分4次洗提離心管中的下層紙張樣品，每次均需混勻叔丁基甲醚和試樣，然後將叔丁基甲醚洗液倒入該提取柱中，收集叔丁基甲醚洗脫液於三角瓶中，往三角瓶中加入5～8g的無水硫酸鈉，移取8ml的洗脫液於帶刻度的10ml氮吹管中，氮吹至1.0ml，進upc2-ms/ms分析；
3.準備標準工作溶液：稱取10mg標準品到10ml容量瓶中，精確至0.0001g，用甲醇定容，配製成濃度為1.0mg/ml的標準儲備液；移取標準儲備液100μl於10ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，得到濃度約為10μg/ml的工作溶液；分別移取一定體積的工作溶液於10ml容量瓶中，並加入100μl內標工作溶液。用甲醇稀釋定容，即配製成不同濃度的標準工作溶液，系列標準工作溶液中各芳香胺的含量分別為：0.5µg，1.0µg，2.0µg，5.0µg和10µg；
4.測定方法:以內標法進行殘留量的定量分析，即以分析物和內標的定量離子對峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線，相關係數大於等於0.999，對提取後的樣品進行測定，測得檢出分析物和內標的定量離子對峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中的各芳香胺的殘留量。求得樣品中鄰甲苯胺的含量分別是1.52mg/kg。
實例2：
如實施例1所述的測定方法，選擇另一煙用紙張樣品，樣品中對氯苯胺含量為2.25mg/kg。