苝醌化合物的生物合成方法
2023-04-26 09:23:01
專利名稱：苝醌化合物的生物合成方法
技術領域：
本發明屬化合物的生物催化合成技術，具體為苝醌化合物的生物合成方法，特別涉及其生物合成過程中發酵工藝的優化。
背景技術：
苝醌化合物，如痂囊腔菌素、竹紅菌甲素、竹紅菌乙素等是一類分布於自然界中的光敏色素。近年來發現它們具有良好的光敏殺傷腫瘤細胞和抑制愛滋病病毒HIV-1的作用，也用於治療皮膚病。苝醌化合物還是潛在的新型光電轉換材料。苝醌化合物作為新興的光敏活性農藥的研究正在受到科學工作者的重視。自然界中不同種屬的真菌能產生含有苝醌化合物骨架的次生代謝產物。由於自然資源十分有限，上世紀九十年代以來國內外一些研究人員希望通過化學合成的方法實現苝醌化合物的全合成。但進行人工合成步驟煩瑣，通過十幾步反應合成苝醌骨架化合物，只具有理論上的研究意義，通過生物合成的方法才能大量獲得苝醌化合物。雖然迄今已有一些文獻初步探討過苝醌化合物的生物合成，如「苝醌化合物的生物催化合成」(《分子催化》，2000，14(14)，300-302)；「苝醌類化合物的生物合成」(《熱帶作物學報》，1998，19(增刊)，45)；「苝醌類化合物產生菌固態發酵工藝研究」(《雲南大學學報》自然科學版，2000，22(5)，389-391)等文章，但產物中苝醌化合物的總量甚低，離實際應用有很大距離。
發明內容
本發明的目的是提供一種苝醌化合物的生物合成方法，特別是對其生物合成過程中的發酵工藝進行優化，從而提高產物中苝醌化合物的總量。
本發明方法如下1、以雲南西部山區生長的，鑑定為子囊菌綱，肉座菌科，菌寄生菌屬的真菌AscomycetesHypomyces(Fr)Tul.sp為菌種，以包含有玉米粉、麥麩和豆渣的固體混合物為固態培養基。
2、將固態培養基滅菌後接入菌種，在24～26℃溫度下發酵不低於7天，可得到含苝醌化合物的磚紅色固體發酵物，即通過生物合成得到了含苝醌化合物的菌塊，菌塊中含有本發明的生物合成產物痂囊腔菌素、竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、寄生菌菌素A和B等苝醌類化合物。
3、將菌塊乾燥粉碎後經提取分離，即可得到苝醌化合物產品。
以上過程中的第3步，最好是將所得固體發酵物，即含苝醌化合物的菌塊乾燥後粉碎，用溶劑提取並濃縮，得苝醌化合物粗品提取液；將苝醌化合物粗品提取液用溶劑萃取，其石油醚部分中含高級烷烴和脂肪酸，其氯仿部分經溶劑洗脫便得痂囊腔菌素、竹紅菌甲素、竹紅菌乙素和其他苝醌類化合物。
菌塊中的苝醌化合物經過光照會發生光氧化，導致含量下降，因此收穫的菌塊最好當天就能在烘箱中抽風加熱烘乾，烘乾的菌塊袋裝放置在陰涼暗處保存。
以下通過實驗對本發明方法做進一步說明一、苝醌化合物的生物合成1、材料和方法菌種以採集自雲南西部山區的，鑑定為子囊菌綱，肉座菌科，菌寄生菌的真菌Ascomycetes Hypomyces(Fr)Tul.sp為菌種。
斜面培養基馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養基。
種子培養基在每升馬鈴薯汁中加入20克葡萄糖，1克KH2PO4，0.5克MgSO4.7H2O，0.1克CaCl2.2H2O，10mg維生素B1，用0.1M的NaOH調節PH＝6，在滅菌鍋中120℃下滅菌30分鐘。
固態基礎培養基m(玉米粉)∶m(麥麩)∶m(豆渣)1∶1∶1，1‰蛋白腖，料水比為10∶3，滅菌處理。
種子培養在500毫升錐形瓶中加入150毫升種子培養基，120℃水蒸汽滅菌30分鐘，冷卻後接入所說菌種，26℃恆溫條件下，在120轉/分的複式搖床上連續振蕩4天，得到外觀為磚紅色糊狀的固體發酵種子。
固體發酵將固態基礎培養基滅菌後接入菌種，以塑膠袋為容器，在26℃恆溫培養，將得到的固體發酵物在70℃條件下烘乾粉碎，備用。
2、不同發酵時段苝醌化合物的總量測定樣品準備發酵條件為｀m(玉米粉)∶m(麥麩)∶m(豆渣)1∶1∶1，1‰蛋白腖，PH＝6，料水比為10∶3，溫度26℃，分別以0天，3天，4.5天，7天，9天和11天為發酵時問，各發酵500克，烘乾備用。
材料預處理(1)竹紅菌甲素標準溶液準確稱取3份經乾燥至恆重的竹紅菌甲素15毫克，用丙酮溶解並定容為100ml。
(2)樣品處理各取不同發酵時段的粗品10克，以丙酮為溶劑，在索氏提取器內提至無色，濃縮，定容為250ml。
實驗儀器及方法722型光柵分光光度計(工作條例件工作波K長465nm；石英比色皿1cm，靈敏度2檔)；
通過工作曲線得到回歸方程，由樣品液的吸光度代入回歸方程，求得結果。
工作曲線和樣品分析分別取標準液1，2，3，4，5ml於50ml瓶中，定容，在選定條件下測定其吸光度，繪製工作曲線。分別取樣品液10ml各6份，稀釋定容為25ml，測定其吸光度。
3、結果(1)發酵產量經固態發酵，得到含苝醌化合物的磚紅色發酵物菌塊，重量約100kg，將這些菌塊乾燥粉碎，置於陰暗處備用。
(2)發酵過程的代謝變化規律發酵過程一般經過遲緩期，對數生長期，減速期和穩定期四個階段。菌體的生長曲線見圖1。
遲緩期接種後，這是一個不生長期。這段過程是菌種從一個環境轉到另一個環境的適應過程，也可以把這段不生長期稱為適應期。
對數生長期在這個分期中，細胞的生長率逐漸增大，然後達到一個常數，即最大生長率。
減速期和穩定期在發酵過程中，菌種生長會使營養物耗盡，並分泌出真菌的代謝產物，這些都能影響真菌繼續生長。因此經過一段時間培養後，真菌生長速度變慢，直至停止。
(3)發酵過程中的幾個重要參數生長周期菌體的生長動力學周期為10天，1～2天為無明顯生長期，3～6天為迅速生長期，7～10天緩慢增長，10天左右完全轉為磚紅色。
生長溫度以24～26℃為最佳。
PH值PH值是菌體在一定環境下代謝活動的綜合指標，這一重要的參數對菌體的生長和產物的積累有很大的影響。試驗表明PH值以5.5～6.5為好，最佳為6。
生長溼度真菌在一般情況下的生長需要相當高的水分，試驗表明相對溼度以60～80％為好，最佳為68～72％。
菌體的通氣性也是導致培養成功的重要條件。試驗表明在培養基中加入適量的甘蔗渣以改善固體發酵時的通氣性，效果很好。
(4)不同發酵時段苝醌化合物總量測定結果根據朗伯—比爾定律，以竹紅菌甲素為標準可以準確測定苝醌化合物的總量。
a.工作曲線及回歸方程在選定條件下，測定標準液的吸光光度值，數據見表1
表1
將測量結果以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，得到工作曲線圖，見圖2。
根據工作曲線結果，得到回歸方程A＝0.015+0.047Cb.樣品測量結果根據樣品測得的吸光光度值，代入回歸方程，得到樣品濃度，見表2表2
根據以上數據計算得出表3的樣品分析結果表3
根據不同發酵時間的苝醌化合物含量數據，可以得到隨時間變化的含量圖，見圖3。
通過比較圖3與圖1可以看出，苝醌化合物的含量和菌體的生長趨勢基本是一致的。在1-3天的適應期時幾乎沒有苝醌化合物產生；3-5天的時候苝醌化合物的含量開始出現增長，但增長趨勢還不強；5-7天的時候，苝醌化合物的含量開始快速增加，一直到10天左右含量基本穩定。整個發酵期約為10天左右，苝醌化合物的含量也達到了2‰左右。
從不同發酵時間的發酵物的提取液的顏色，看到隨苝醌化合物的含量增加，提取液的顏色也逐漸變深，而且在發酵物的塊狀菌上也能清楚的看到顏色的變化，因此可以從發酵培養物的顏色大致判斷發酵的過程。
本發明的有益效果對苝醌化合物的生物合成工藝過程進行了優化，從而提高產物中苝醌化合物的總量。
圖1為菌體生長曲線。
圖2為工作曲線圖。
圖3為苝醌化合物隨時間變化的含量圖。
圖4為實施例的柱層析流程圖。
具體實施例方式
見以下實施例。
以雲南西部山區生長的，採集後鑑定為子囊菌綱，肉座菌科，菌寄生菌的真菌Ascomycetes Hypomyces(Fr)Tul.sp為菌種。斜面培養基為馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養基。種子培養基為在每升馬鈴薯汁中加入20克葡萄糖，1克KH2PO4，0.5克MgSO4.7H2O，0.1克CaCl2.2H2O，10mg維生素B1，用0.1M的NaOH調節PH＝6，在滅菌鍋中120℃下滅菌30分鐘。固態基礎培養基為m(玉米粉)∶m(麥麩)∶m(豆渣)1∶1∶1，1‰蛋白腖，在加入適量甘蔗渣，料水比為10∶3，滅菌處理。
種子培養在500毫升錐形瓶中加入150毫升種子培養基，120℃水蒸汽滅菌30分鐘，冷卻後接入所說菌種，26℃恆溫條件下，在120轉/分的複式搖床上連續振蕩4天，得到外觀為磚紅色糊狀的固體發酵種子。
固體發酵將固態基礎培養基滅菌後接入菌種，以塑膠袋為容器，在26℃恆溫培養8天。生長相對溼度為68～72％。
將得到的固體發酵物當天在70℃條件下烘乾粉碎。
將烘乾粉碎的固體發酵物用熱提和冷浸的兩種方法，同時以丙酮為溶劑進行反覆提取，合併提取液，濃縮蒸乾，得到暗紅色粘糊狀液體。
將得到的暗紅色粘糊狀液體靜置，一段時間後在容器底部有亮黑色的顆粒狀結晶析出，分離出結晶用石油醚洗滌(經分析，該結晶為痂囊腔菌素A的不純結晶，其中混有少量的竹紅菌甲素和乙素)。
丙酮提取後餘下的殘渣風乾後用乙醇加熱回流，濃縮提取液，靜置，有結晶析出，傾出上層清液，用乙醇洗去紅色素即得到粗品，加少量水處理，活性炭褪色、過濾、濃縮濾液，用95％的乙醇重結晶得到結晶體(經分析，此結晶為甘露醇)。
暗紅色的粗提物經石油醚洗滌後用氯仿處理，將處理樣用H膠上柱洗脫，而石油醚部分的小極性物質用氣相色譜/質譜聯用儀分析。
將分離得到的化合物進行物理和化學性質分析並進行UV，IR，HNMR，CNMR波譜分析，鑑定其結構。
粗品浸膏用大柱分段為三個部份，將每部份分別上柱分離。
第一部份以石油醚和氯仿(5∶1～1∶1)作為洗脫劑，用H矽膠作為固相，得到化合物II、IV、V；第二部份以石油醚和乙酸乙酯作為洗脫劑，用H矽膠作為固相得到化合物III；第三部份以氯仿和甲醇(60∶1～20∶1)作梯度洗脫，得到化合物VI～XI。柱層析工作如圖4所示。經結構鑑定，其中6個是苝醌化合物，如化合物VI～X。含量最多的是痂囊腔菌素和竹紅菌甲素。
以上實施例僅對發明做進一步的說明，而本發明的範圍不受所舉實施例的局限。
權利要求
1.一種苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是按以下步驟進行(1)、以雲南西部山區生長的，鑑定為子囊菌綱，肉座菌科，菌寄生菌屬的真菌Ascomycetes Hypomyces(Fr)Tul.sp為菌種，以包含有玉米粉、麥麩和豆渣的固體混合物為固態培養基。(2)、將固態培養基滅菌後接入菌種，在24～26℃溫度下發酵不低於7天，可得到含苝醌化合物的磚紅色固體發酵物，(3)、將磚紅色固體發酵物乾燥粉碎後經提取分離，即可得到苝醌化合物產品。
2.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是將所得的磚紅色固體發酵物乾燥後粉碎，用溶劑提取並濃縮，得苝醌化合物粗品提取液，將苝醌化合物粗品提取液用溶劑萃取並分離。
3.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是將所得的磚紅色固體發酵物當天就在烘箱中抽風加熱烘乾，烘乾後袋裝放置在陰涼暗處保存。
4.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是發酵時的PH值為5.5～6.5。
5.如權利要求4所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是發酵時的PH值為6。
6.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是發酵時的生長相對溼度為60～80％。
7.如權利要求6所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是發酵時的生長相對溼度為68～72％。
8.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是在培養基中加入適量的甘蔗渣以改善固體發酵時的通氣性。
9.如權利要求1所說的苝醌化合物的生物合成方法，其特徵是發酵7～10天。
全文摘要
本發明屬化合物的生物催化合成技術，具體為苝醌化合物的生物合成方法，特別涉及其生物合成過程中發酵工藝的優化。以雲南西部山區生長的，鑑定為子囊菌綱，肉座菌科，菌寄生菌屬的真菌Ascomycetes Hypomyces(Fr)Tul.sp為菌種，以包含有玉米粉、麥麩和豆渣的固體混合物為固態培養基。將固態培養基滅菌後接入菌種，在24～26℃溫度下發酵不低於7天，可得到含苝醌化合物的磚紅色固體發酵物，即通過生物合成得到了含苝醌化合物的菌塊，菌塊中含有本發明的生物合成產物痂囊腔菌素、竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、寄生菌菌素A和B等苝醌類化合物。將菌塊乾燥粉碎後經提取分離，即可得到苝醌化合物產品。本發明提高產物中苝醌化合物的總量。
文檔編號C12P7/26GK1680562SQ20051001061
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月17日 優先權日2005年1月17日
發明者李聰, 陳遠騰, 臺虹, 歐靈澄, 荷嚴萍 申請人:雲南大學