Vinexin-β在治療腦卒中疾病中的應用的製作方法

2023-04-26 09:14:41 2

Vinexin-β在治療腦卒中疾病中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種Vinexin-β在治療腦卒中疾病中的應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明以Vinexin-β基因敲除小鼠為實驗對象，通過大腦中動脈缺血再灌注損傷模型研究Vinexin-β基因與腦卒中的關係，結果表明與野生型對照小鼠對比，Vinexin-β基因敲除小鼠腦袋梗死體積明顯減少，神經功能明顯好轉，腦袋死亡的神經元細胞數量也明顯減少。從而發現Vinexin-β能夠促進惡化神經功能和腦卒中的作用；因此，Vinexin-β可作為藥物靶標篩選保護神經功能和預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物，Vinexin-β的抑制劑可用於製備保護神經功能和預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物。
【專利說明】[0001] Vinexin-β在治療腦卒中疾病中的應用

【技術領域】
[0002] 本發明屬於基因的功能與應用領域，特別涉及一種Vinexin-β在治療腦卒中疾 病中的應用，具體是在製備預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中應用。

【背景技術】
[0003] 腦卒中疾病是全球第四大致死因素，僅次於心血管疾病、腫瘤和慢性下呼吸道疾 病，也是最主要的導致終生殘疾的致病因素之一。其中，約80%的患者為缺血性腦卒中，主 要發病原因是大腦血管阻塞或腦出血引起腦組織供血供氧不足。據預測，2005年至2050年 美國用於腦卒中治療的費用按2005年購買力評估約為1520億美元，給經濟和健康造成了 巨大的負擔。在中國，隨著經濟發展、人民生活方式轉變和人口老齡化，近年來腦卒中發病 率逐年升高。我國每年約有160萬人死於腦卒中，死亡率為157/10萬人，已經超過心血管 疾病並成為最主要的致死因素和成人致殘因素。與其他國家相似，缺血性腦卒中是我國最 常見的腦卒中類型，約佔所有腦卒中的43-79%。因此腦卒中是現在以及將來很長一段時間 內人類必須面對的重大公共衛生問題之一。
[0004] 多數研究認為，恢復腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。儘管1996年起組 織纖溶酶原激活劑（tPA)即批准用於缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國藥監局 (FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。因為隨時間延長出血風險增加，tPA的治療時間窗僅為 4. 5小時；考慮到缺血性和出血性腦卒中在早期影像學不易鑑別，進一步延誤了患者接受 tPA治療的機會。目前只有小於5%的缺血性腦卒中患者使用tPA溶栓治療。此外，研究發 現腦組織如果長時間嚴重缺血缺氧，即使在後期恢復腦血流仍會對腦組織造成不可逆轉的 損傷，因此當前仍迫切需要研究針對缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理學事件的治療策 略。
[0005] 自20世紀90年代以來，研究保護神經和腦組織的治療策略一直是腦卒中治療的 熱點，這些策略不僅可以延長tPA的治療時間窗，也可以減輕缺血再灌注誘導的腦組織損 傷。神經元細胞是中樞神經系統重要的組成部分，但其高代謝率降低了對缺血缺氧環境耐 受能力，因此較其他神經血管元件組分更易受到損傷。目前組織纖溶酶原激活劑（tPA)纖 溶的治療仍是缺血性腦卒中的主要治療手段，但其僅4. 5小時長的時間窗限制大部分患者 只能接受對症治療。研究表明，神經元保護策略可以在腦缺血損傷後較長時間內改善大腦 功能，減少神經元細胞損失。凋亡是大腦缺血/再灌注過程中細胞死亡的基本機制之一，但 其調控機制仍未完全闡明。因此，研究大腦缺血/再灌注時神經元細胞凋亡生存的分子機 制，將有助於為神經元保護提供新的治療策略和方法。
[0006] Vinexin和其結合蛋白粘著斑蛋白（vinculin)是組成細胞粘附的蛋白質網絡的 重要組成成分，Vinexin與vinculin的結合直接影響粘著斑的形成，並調控細胞-細胞、 細胞-胞外基質的粘附，並最終影響細胞的遷移、分化、分裂和凋亡等一系列重要細胞行 為。Vinexin包括3個亞型，Vinexin-α、β和γ，這3種亞型的蛋白都在其N端有一個 SoHo (sorbinhomology)結構域和C端的三個SH3 (srchomology 3)結構域，分子結構都 高度保守。Vinexin-β在多處表達，尤其在心臟的表達水平很高。研究發現Vinexin-β 基因敲除的小鼠，對主動脈縮窄手術所引起的心肌肥厚反應更加敏感，這表明Vinexin-β 在高負荷所引起的心肌重構和衰竭反應中是一個很重要的調節蛋白（Ke Chen, et al. Vinexin-β protects against cardiac hypertrophy by blocking the Akt-dependent signalling pathway. Basic Res Cardiol，2013，108:338)。到目前為止尚無文獻報導 有關Vinexin-β在腦卒中疾病中應用的內容。


【發明內容】

[0007] 為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的目的是確定Vinexin-β的表達與 腦卒中疾病之間的相互關係，提供一種Vinexin-β作為藥物靶標在篩選保護神經功能和 預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物中的應用，進而提供一種Vinexin-β的抑制劑在製備 保護神經功能和預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物中的應用。
[0008] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 本發明以Vinexin-β基因敲除小鼠為實驗對象，通過小鼠大腦中動脈缺血再灌注損 傷造成腦卒中模型，研究Vinexin-β基因與腦卒中的關係，結果表明與野生型小鼠(對照 組）相比，Vinexin-β基因敲除小鼠梗死體積明顯降低，神經功能明顯好轉，死亡神經細胞 數量減少。這提示Vinexin-β具有惡化神經功能的作用，能加重促進腦卒中的發展，為研 究預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0009] 因此，Vinexin-β基因可作為藥物靶點，構建Vinexin-β基因過表達的體外細胞 模型或動物模型，用於篩選預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物；Vinexin-β基因也可作為 基因治療中的靶基因，設計並製備預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物和/或生物學試劑， 通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療腦卒中的目的。例如以Vinexin-β為靶基因， 設計可幹擾Vinexin- β表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成以後，注射入人體通過RNA幹 擾的方法使Vinexin-β基因沉默來治療腦卒中；還可以設計並構建Vinexin-β的突變體， 注射後進入細胞，競爭Vinexin-β原形的作用底物，從而抑制Vinexin-β的功能，起到治 療目的；此外，還可以以Vinexin-β為祀點設計小分子化合物抑制劑，利用Vinexin-β基 因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選，發現其中能夠特異性抑制Vinexin-β的 分子，從而為腦卒中的治療提供新的治療性分子。
[0010] 針對Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β作為藥物祀標在篩選保護神經功 能的藥物中的應用。
[0011] 針對Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β作為藥物祀標在篩選預防、緩解和 /或治療腦卒中的藥物中的應用。
[0012] 針對Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β的抑制劑在製備保護神經功能的 藥物中的應用。
[0013] 針對Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β的抑制劑在製備預防、緩解和/或 治療腦卒中的藥物中的應用。
[0014] -種保護神經功能的藥物，包含Vinexin-β的抑制劑。
[0015] -種預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物，包含Vinexin-β的抑制劑。
[0016] 所述的Vinexin-β的抑制劑優選為Vinexin-β基因的siRNA、Vinexin-β基因 的RNA幹擾載體，Vinexin-β的抗體及其他能夠抑制Vinexin-β表達的抑制劑中的一種。
[0017] 本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果： (1)本發明發現Vinexin-β的新功能，即Vinexin-β能夠惡化腦卒中的作用。
[0018] (2)基於Vinexin-β在惡化腦卒中疾病中的功能，其為研製預防、緩解和/或治療 腦卒中的藥物提供靶標。
[0019] (3)Vinexin-0的抑制劑可用於製備保護神經功能和預防、緩解和/或治療腦卒 中的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是WT和Vinexin-β -K0小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴重程度的評估結果圖。 A為TTC染色結果圖，B為腦梗體積統計柱狀圖，C為神經功能評分統計柱狀圖（* :p < 0. 05 vs 野生型 I/R(24h)組，# :p < 0· 05 vs 野生型 I/R(72h)組)。
[0021] 圖2是Fluoro Jade B染色檢測腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果 圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。
[0023] 實驗用動物及飼養 實驗動物：選用雄性，11-12周齡，體重在25-30g，背景為C57BL/6的野生型小鼠（WT， 購自北京華阜康生物科技有限公司，質量合格證號=949431)、Vinexin-β基因敲除小鼠 (Vinexin-β-ΚΟ,購自日本 RIKEN 公司，貨號：01732)。
[0024] 飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中 心。SRF級大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養條件：室溫在22-24°C之 間，溼度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0025] 實施例1小鼠腦梗死模型（I/R)獲得 1.實驗動物分組：野生型小鼠及Vinexin-β基因敲除小鼠，通過大腦中動脈缺血再 灌注建立腦梗死模型（I/R)。隨機分為2組，每組10隻小鼠：野生型小鼠 I/R術組（WT 1/ RXVinexin-β基因敲除小鼠 I/R術組（K0 I/R)。
[0026] 2.線栓法腦梗死 I/R 手術米用 MCA0(middle cerebral artery occlusion，大腦 中動脈閉塞）模型操作流程： (1)抓取小鼠，使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術剪 迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘1次。
[0027] (2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結締組 織。將雷射都卜勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前?後方2_、左側5_的部位。
[0028] (3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左 側頸總動脈（CCA)、頸外動脈（ECA)和頸內動脈（ICA)。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA，在 ECA遠心端結紮和剪一小口，將線栓由剪口送入ICA，當線栓進入深度在9-11mm左右至血流 下降遇阻力停，整個過程必須維持小鼠的肛溫在37±0. 5°C。
[0029] (4)從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時開始計時，45min後將線栓拔出，並將 ECA近心端結紮，迅速鬆開CCA處動脈夾。注意觀察血流恢復情況，選擇血流下降75%以上， 血流恢復達70%以上的小鼠納入實驗。
[0030] (5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，並用活力碘消毒傷口。手術結束後，將小鼠放在溫 箱中，箱溫維持在28°C，給水和飼料，分別在24h、72h取材。
[0031] 實施例2腦梗死模型（I/R)小鼠腦梗死體積測定 腦缺血/再灌注損傷嚴重程度的評估指標主要包括大腦梗死體積和神經功能評分，這 些指標均與缺血/再灌注損傷嚴重程度正相關。
[0032] (1)分別在手術後24h、72h取材前進行神經功能及行為學評分； 基於Berderson神經功能評分改進方法（9分制）： 0分：無神經受損的症狀； 1分：提尾時對側前肢蜷曲，或者不能完全到達患側前肢； 2分：提尾時對側肩膀內收； 3分：平推：向對側推動時阻力下降； 4分：可自發的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向對側轉彎； 5分：自發運動時轉圈或只向對轉； 6分：無自主運動，只在刺激時運動； 7分：無自主運動，刺激時也無運動； 8分：與腦缺血有關的死亡。
[0033] (2)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取腦。
[0034] (3)將取下的腦組織放入1mm小鼠腦模，置於_20°C冰箱凍存。
[0035] (4)腦組織 2, 3, 5_ 三苯基氯化四氮唑（2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloricej，TTC)染色：從-20°C冰箱取出腦組織，立即切成1mm厚的切片，共切7片。將切 片立即置於10mL 2% TTC溶液中，37°C恆溫孵育lOmin。正常腦組織染色後呈鮮紅色，而梗 死區呈蒼白色。
[0036] (5)用10%中性福馬林溶液固定腦組織切片，大體拍照。
[0037] (6)腦梗體積計算（Image-Pro Plus 6. 0軟體）：梗死體積％ =(對側大腦半球體 積-梗死側未梗死體積）/(對側大腦半球體積X2) X 100%; 總梗死體積為各自7張大腦切片結果數據之和。
[0038] TTC是脂溶性光敏感複合物，它是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶系統的質子受體，與 正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內脫氫酶活性下降，不能反應，呈蒼白色。
[0039] TTC染色結果如圖1A和B所示，經過I/R缺血45min再灌注24小時後 Vinexin-β -K0小鼠梗死體積較野生型小鼠降低，且這種保護作用在I/R術後72小時仍然 持續，腦組織梗死比野生型小鼠均低；而神經功能評分在I/R術後24小時、72小時均比野 生型小鼠均低（圖1C)。表明Vinexin-β基因的缺失可減少缺血再灌注損傷引起的腦卒中 小鼠的大腦梗死體積，可保護神經功能。
[0040] 實施例3腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定 1.腦組織冰凍切片製備 (1)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。
[0041] (2)開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺入左心室，同時剪開右心房。
[0042] (3)用PBS (0.01M，pH 7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變白後，用4%多聚甲醛灌流 15min〇
[0043] (4)開顱迅速取出小鼠大腦，室溫4%多聚甲醛後固定6_8h。
[0044] (5)切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先後兩個部分，用先前的固 定液再固定15min。
[0045] (6)隨後浸沒於含30%蔗糖的PBS (0· 01M，pH 7. 4)中，4°C冰箱沉底過夜。
[0046] (7) 30%蔗糖與0CT包埋劑按1:1 (v/v)混合後，倒適量到包埋框中，將前一步的 組織取出，在紗布上吸去液體後在該包埋框中浸泡一會兒，再將其轉入到先已加入2滴0CT 的另一個包埋框中，調整組織的位置，使其正好位於包埋框的正中。
[0047] (8)將盛組織的包埋框，移入乾冰中，儘量使其處於水平位，稍待一會兒後，繼續加 入0CT，浸沒組織一定的高度，待0CT凝固後，將其儲存於-80°c的冰箱中。
[0048] (9)用冰凍切片機的標準程序切5 μ m的冰凍切片備用。
[0049] 2. FJB (Fluoro Jade B)染色 (1) 將冰切組織切片在烘箱中烘乾1小時； (2) 1% Na0H+80% 無水乙醇 5min ; (3) 70%無水乙醇2min ; (4) ddH20 2min ； (5) Flouro Jade B 稀釋液（AG310, Millipore, Billerica, MA)，室溫，避光 20min; (6) ddH20 lminX3 ； (7) 在烘箱中烘片5-10min ; (8) 二甲苯 > lmin ; (9) 封片，拍照。
[0050] 腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果見圖2所示，本實施例檢測了 Vinexin-β-ΚΟ小鼠和野生型小鼠 I/R術後24小時腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡 情況。Fluoro Jade B細胞凋亡檢測顯示，Vinexin-β-ΚΟ組小鼠的凋亡細胞數量明顯比 WT組小鼠少，這表明Vinexin-β與神經元細胞缺血再灌注時死亡相關。這些結果表明， Vinexin-β的缺失可以減少神經元細胞的凋亡。
[0051] 研究結果表明，在大腦中動脈缺血再灌注引起的損傷中，Vinexin-β敲除後 的小鼠梗死體積顯著減少，神經功能明顯好轉，凋亡的神經細胞數量也明顯減少，這說明 Vinexin-β敲除可保護神經功能，改善腦卒中；Vinexin-β在腦卒中疾病模型中有著重 要的惡化作用。
[0052] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1. Vinexin-β作為藥物靶標在篩選保護神經功能的藥物中的應用。 2. Vinexin- β作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應 用。 3. Vinexin-β的抑制劑在製備保護神經功能的藥物中的應用。
4. 一種保護神經功能的藥物，其特徵在於：包含Vinexin-β的抑制劑。 5. Vinexin-β的抑制劑在製備預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應用。
6. -種預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物，其特徵在於：包含Vinexin-β的抑 製劑。
7. 根據權利要求3或5所述的應用或權利要求4或6所述的藥物，其特徵在於：所述 的Vinexin-β的抑制劑為Vinexin-β基因的siRNA、Vinexin_i3基因的RNA幹擾載體或 Vinexin-β的抗體及其他能夠抑制Vinexin-β表達的抑制劑中的一種。
【文檔編號】G01N33/68GK104087678SQ201410355303
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】李紅良, 郭森, 盧燕雲, 鄭安康, 李明昌 申請人:武漢大學