新型慢性B肝治療性dc疫苗的製作方法
2023-04-26 09:13:16
專利名稱：新型慢性B肝治療性dc疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用重組B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)和重組B肝病毒核心抗原(hepatitis Bvirus core antigen，HBcAg)同時負載單核細胞來源的樹突狀細胞(monocytederived-DC，moDC)，使該樹突狀細胞得以負載抗原而成熟從而製成的HBV特異性DC疫苗。
背景技術：
乙型病毒性肝炎是由HBV引起的，以肝臟炎症核壞死病變為主的一組傳染病，是當前嚴重危害人類健康的疾病之一。據世界衛生組織估計，全球範圍內HBV感染者高達20億以上，其中4億為慢性感染者。慢性感染者中有10～20％可發展為肝硬化，肝硬化的1～5％可演變為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。因此肝細胞癌的發生與慢性HBV感染高度相關，慢性感染者發生肝細胞癌的機率是非感染者的100倍。我國是HBV慢性感染的高流行區，一般人群的HBsAg陽性率為9.09％(近1.2億人為HBV攜帶者)，慢性B型肝炎(chronicalhepatitis B，CHB)現症患者達3000萬，每年因治療慢性B型肝炎及其相關的肝臟疾病(如肝硬化、肝癌等)約花費1000億元人民幣。慢性B型肝炎已嚴重威脅國人健康，給患者個人與家庭帶來了沉重負擔，甚至影響國民經濟的發展，因此，對病毒性肝炎的預防、控制、治療的研究有著重大意義，國務院剛發布的《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020年)》已將「愛滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治」列入16個重大專項之中。
B型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環狀DNA。完整的HBV顆粒直徑為42nm，又名Dane顆粒，分為包膜與核心兩部分。包膜厚約7nm，內含HBsAg、糖蛋白與細胞脂肪。包膜內為直徑28nm的核心或核殼體。HBsAg在肝細胞內合成，大量釋出於血液循環中，在電鏡下呈球形，直徑22nm，分子量24KD；或管狀[(20～30)nm×(200～400)nm]，沒有感染性。在血液中HBsAg的數量遠多於Dane顆粒，可超過100～1000倍。核心部分含有環狀雙股DNA、DNA聚合酶(DNApolymerase，DNAP)和HBcAg，是病毒複製的主體。HBcAg是由HBV DNA負鏈上的開放讀碼區C區編碼的核心(核衣殼)多肽，分子量21KD，在外周血中無游離的HBcAg存在。
HBV引起肝臟損傷的主要原因是宿主針對感染了HBV的肝細胞的免疫反應，即機體免疫系統釋放出大量非溶細胞性的細胞因子所致的肝細胞損害。持續的HBV感染是造成B型肝炎慢性化的主要原因，因此，抗病毒治療是慢性HBV感染的一項基本治療措施，但療效不夠滿意，治療後HBV DNA難以徹底清除，復發率高，最終清除病毒還須機體的特異性免疫功能。病毒特異性T細胞反應是機體抗病毒感染最主要的獲得性免疫反應，其中CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導的免疫反應在機體排斥、清除肝炎病毒的過程中具有關鍵作用，CD4+輔助T細胞(helper T lymphocyte，Th)也是體內有效調節抗病毒免疫反應不可缺少的因素。在急性自限性HBV感染的患者中，HBV特異性的CTL細胞反應在造成肝組織損傷的同時，可清除機體的病毒，使患者獲得痊癒，Th細胞介導的免疫應答在清除病毒中也扮演了重要角色。但是，大部分的HBV感染者不能徹底清除病毒而導致慢性感染。大量研究表明，慢性HBV感染患者免疫應答水平低下或缺失，病毒特異性T細胞的數量和功能都降低，這種現象稱為免疫耐受。加之病毒容易發生變異，更促使免疫耐受的形成。慢性肝炎患者體內HBV特異性的CTL反應和Th細胞介導的免疫反應微弱，甚至檢測不到針對HBV的特異性的CTL反應，因此機體不能有效清除病毒，這就是HBV持續存在的原因之一。
目前常用的抗病毒治療、保肝降酶治療、抗纖維化治療以及免疫學治療(主要是細胞因子等)雖有一定療效，但由於免疫耐受、病毒變異等原因，往往不能徹底清除體內病毒。因此有效控制病毒複製對抑制疾病的進展十分重要。預防性B肝疫苗的接種，對保護易感人群免受HBV的感染以及HBV引起的疾病起十分重要作用。隨著免疫學理論的發展和生物醫學技術的進步，治療性B肝疫苗的開發和應用為慢性B肝的治療帶來了新的希望。目前治療性疫苗主要有以下幾類有核酸疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗、B肝病毒表面抗原-抗體複合物疫苗、抗體化抗原疫苗等。目前我國進入臨床試驗階段的疫苗有B肝病毒表面抗原-抗體複合物疫苗、合成肽疫苗和蛋白疫苗，有的已進入臨床III期。由於以上疫苗均為蛋白或多肽產物，接種體內後必須由抗原提呈細胞處理、加工和提呈後才能有效激活機體的免疫系統，因此抗原提呈的效率直接影響疫苗的療效，其療效和安全性問題還有待於進一步驗證，在臨床上的推廣應用還有待於觀察。
樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是體內分布廣泛的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，具有激活CD8+CTL和CD4+Th的能力，處於免疫應答的中心環節，在機體抗病毒、腫瘤免疫反應中發揮著重要作用。DC可以通過激活體內特異性的CTL前體細胞或未致敏的T細胞、Th細胞，使機體產生擴增、放大的CTL效應，同時產生高水平、高親合力的抗體反應。因此，在慢性B肝或慢性B肝合併肝細胞癌的治療中，通過上調DC介導的特異性免疫反應來清除HBV已經成為目前的研究熱點。近年研究表明，慢性HBV感染患者的體內HBV特異性T細胞免疫耐受的形成，其機制可能是DC的表型不成熟和DC的免疫調節和抗原提呈功能有特異性的缺陷。我們實驗室的研究也發現慢性HBV感染者外周血中DC的增殖數量較正常人明顯降低；表達於慢性B肝患者DC表面的CD1a、CD86、CD80和HLA-DR的水平明顯低於正常；在混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)中B肝患者的DC刺激T淋巴細胞增殖的能力亦低於健康人；在MLR上清及純的DC培養上清液中其產生IL-12的水平下降而NO水平升高，NO被認為可通過抑制多種酶的作用而損傷健康組織，由此可見慢性B型肝炎患者不僅DC表型不成熟同時也存在功能缺陷。Kakumu在研究HBV、HCV感染的肝癌患者的外周血DC功能時，也認為DC功能的降低與HBV或HCV感染有一定關係。
DC疫苗是指負載了特異性抗原的成熟樹突狀細胞疫苗。隨著對DC生物學特徵的深入了解及其在抗病毒、抗腫瘤免疫反應中機理的研究，體外大量製備DC疫苗的方法日益成熟，將DC用抗原肽和蛋白抗原體外負載後回輸到患者體內，在體內可誘導出抗原特異性的T細胞免疫應答和特異性抗體的生成。DC作為一種免疫佐劑在治療黑色素瘤、前列腺癌、胃腸腺癌、肺腺癌、乳腺癌和肝癌中都發揮了較好的作用，而且作為預防性和治療性的疫苗也是安全有效的。關於HBV治療性的DC疫苗國外也已進入臨床實驗階段，但是多用HBsAg負載DC以製備疫苗。Chisari研究組發現，DC經過HBsAg負載後可打破HBV轉基因鼠(HBV-Tg)的免疫耐受，誘導抗HBV的CTL反應(Shimizu Y，Guidotti LG，Fowler P，Chisari FV.Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis Bvirus transgenic mice.J.Immunol.1998，1614520-4529)。Akbar等應用HBsAg負載處於免疫抑制狀態的HBV-Tg鼠的DC，再注射入HBV-Tg小鼠後能有效誘導產生anti-HBs(Akbar SMF，Furukawa S，Hasebe A，Horiike N，Michitaka K，Onji M.Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murinechronic hepatitis B virus carrierer.Int.J.Mol.Med.2004，14295-299)。之後他們應用HBsAg負載正常自願者DC後回輸自願者體內，結果表明能有效誘導機體產生anti-HBs，並且有很好的安全性(Akbar SMF，Furukawa S，Onji M，Murata Y，Niya T，Kanno S，Murakami H，Horiike N.Safety and efficacy of hepatitis B surfaceantigen-pulsed dendritic cells in human volunteers.Hepatol Res，2004，29136-141)。國內研究者應用CHB病人自體的PBMC誘導DC，經HBsAg負載後回輸病人體內後病人HBV-DNA明顯下降，52.6％發生HBeAg/anti-HBe血清轉換，部分病人ALT復常，總反應率達57.9％(Chen M，Li YG，Zhang DZ，Wang ZY，Zeng WQ，Shi XF，Guo Y，Guo SH，Ren Hong.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine onpatients with chronic hepatitis BA clinical study.World J Gastroenterol 2005，11(12)1806-1808)。由於HBV的HBcAg對於不同的病毒亞型是高度保守的，且在急性自限性和慢性肝炎中HBcAg是CD4+T細胞應答最躍的HBV蛋白，被認為是較理想的免疫治療靶位，HBcAg具有多處T細胞識別表位，有保護性功能，還具有直接刺激B細胞應答的作用，現在認為還起佐劑作用，與其他保護性抗原融合可增強其免疫原性。
本發明在此基礎上，提供HBsAg和HBcAg兩種抗原聯合負載的DC疫苗，該疫苗能有效誘導同時針對s181-193表位及c18-27表位的多特異性CTL反應，並且分泌細胞因子如IL-12也顯著高於單純HBcAg或HBsAg負載的DC。HBcAg的c18-27肽表位是HBV特異性CD8+T細胞的識別靶位，共負載HBsAg和HBcAg的DC能有效誘導針對HBV不同表位的多克隆特異性CTL，產生更強的抗HBV特異性和非特異性的免疫反應。
發明內容
本發明提供一種用HBsAg和HBcAg共負載單核細胞來源的樹突狀細胞，使該樹突狀細胞得以負載抗原而成熟從而製成HBV特異性DC疫苗。
本發明的特徵在於用HBsAg和HBcAg共同負載未成熟的moDC，負載濃度5～100μg/ml，優選為20μg/ml，負載時間為HBsAg與HBcAg和未成熟的moDC細胞共同孵育12～48小時。此疫苗能誘導機體產生針對HBsAg和HBcAg的特異性免疫。
本發明的特徵在於從單核細胞誘導moDC，在moDC未成熟階段即5～6天時加入HBsAg與HBcAg各20μg/ml，共培養12～48小時，收集成熟moDC即為HBV特異性的DC疫苗。
本發明的疫苗使用時可以製成藥物製劑，如注射劑，該注射劑是單位劑量形式，如每製劑單位含有DC數1×104～1×107個。該注射劑必要時可以加入藥物可接受的載體，如稀釋劑，賦型劑，穩定劑等藥物學常規的輔料。
本發明的疫苗製劑，可通過皮下、肌肉或淋巴結內注射。
本發明的疫苗製劑，可與其他細胞因子治療方法合用。
本發明的疫苗製劑，可與治療慢性B肝的其他治療方法(如抗病毒治療，中醫中藥治療、過繼細胞免疫治療)聯合應用。
本發明的術語解釋如下HBsAgB型肝炎病毒表面抗原，其來源屬於現有技術。
HBcAgB型肝炎病毒核心抗原，其來源屬於現有技術。
DC樹突狀細胞，是體內提呈抗原功能強的抗原提呈細胞，其來源屬於現有技術。
負載是抗原致敏細胞的過程，即將抗原加入DC的培養液中進行培養，DC攝取抗原後，在細胞內經過加工處理，將蛋白抗原分解成多肽後與MHC分子結合而提呈於DC表面，從而被免疫細胞識別而誘發免疫反應。
未成熟的moDC即未成熟的單核細胞來源的樹突狀細胞，其表型和功能均不完善，不能誘導有效的免疫反應。不成熟的DC經抗原致敏可成熟，表型和功能均得到明顯的改善，可有效誘導免疫反應。
孵育即細胞的培養過程。細胞需要在一定的培養基中進行生長繁殖，並且需要保持一定的溫度、溼度和CO2的濃度。
成熟moDC即成熟的單核細胞來源的樹突狀細胞，其表型和功能均完善，如負載了抗原後，其表面可呈現抗原肽與MHC分子結合的複合分子。
HBV特異性的DC疫苗即負載了HBV抗原、可誘導機體產生針對HBV的特異性免疫活性細胞的DC疫苗。
本發明的疫苗的製備過程可描述如下1.HBsAg和HBcAg的獲得HBsAg來源於重組(酵母)B肝疫苗不加免疫佐劑的半成品，HBcAg來源於本室構建的攜帶HBcAg全基因序列的質粒PMM2066，在大腸桿菌中表達後分離純化而得。
2.0dPBMC的分離取外周抗凝血50～100ml，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用預冷的PBS稀釋成15～20ml，分置於2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，離心兩次以去除細胞碎片和血小板，吸棄上清。將去除細胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀釋。在2個滅菌的離心管中加入預先恢復至室溫的淋巴細胞分離液，將稀釋後的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細胞分離液液面上使形成界面，淋巴細胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6。離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細胞分離液和紅細胞四條帶。收集界面單個核細胞於離心管中，用PBS稀釋至10～20ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細胞2～3次。鏡下觀察細胞狀態，如果細胞碎片和血小板較多，1200rpm/8分鐘再洗一次。將細胞合併到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養液懸浮細胞，計數細胞濃度，用臺盼藍染色測定細胞存活比例，計算存活細胞總數，做好記錄。調整細胞濃度至2～5×106/ml，鋪於6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育1～2小時，使單核細胞貼壁。
3.0天DC培養當孵育結束時，首先用培養皿中的液體衝洗貼壁細胞，吸出上層未貼壁細胞，加入預熱的培養基，再衝洗2次，以去除未貼壁細胞和大部分的貼壁的淋巴細胞。未洗盡的淋巴細胞比單核細胞小而圓亮。拍照記錄。置37℃、5％的CO2溫箱中培養3天。未貼壁細胞約佔PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培養基調整細胞濃度為1～3×106/ml，加入維持劑量的IL-2(5～50U/ml)，於一潔淨培養瓶中培養，每3天半量換液，並根據細胞狀況隨時調整培養基量，補加細胞因子，即為自體T淋巴細胞，待後續實驗用。貼壁細胞數量＝總PBMC-總未貼壁細胞數，記錄。衝洗時，用吸管上下吹吸幾次，輕輕振蕩培養皿。接著面向操作者傾斜培養皿，吸盡培養基。當吸下面的液體時，滴管頭懸在液體中，沿培養皿四周邊移動滴管邊吸，不要用吸管刮培養皿的底面。按此法，吸出每個培養皿內的液體。整個操作過程要迅速，以免細胞在洗滌過程中缺水乾死。加入預熱的AIM-V培養基，內含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分。觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態。
4.3天半量換液倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分。觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態。拍照記錄。收集(用吸管輕柔抽吸)每孔細胞於一個離心管中，及時在每孔中添加預熱的AIM-V培養液，以免貼壁細胞缺水乾死。收集的細胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養液，補加入等量新鮮的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培養液(補加培養液量應除去孔中添加的每孔0.5ml的液體量，以便使換液前後培養液總體積保持不變)；置37℃、5％的CO2溫箱中培養。
5.5天半量換液倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分。觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態。拍照記錄。收集每孔的懸浮細胞(用吸管輕柔抽吸)，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定DC細胞存活比例，細胞計數(計數時，只計數典型的DC，不要將淋巴細胞計數在內)。計算出第5天存活的DC細胞佔第0天收集貼壁細胞總數的比例，記錄。半量換液，操作如3天半量換液。換液的細胞因子濃度減半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2溫箱中培養。
6.6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原負載倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態。拍照記錄。然後吸取2～5×105細胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細胞因子IL-10、IL-12等，因子濃度可換算成/24小時/10000細胞，以利於比較。細胞用於流式細胞儀檢測細胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLA DR，CD40，CD83等)，iDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標誌CD11c染色決定。吸取iDC培養液100μl作無菌試驗(包括細菌和真菌培養，支原體，LPS檢驗)。孔內加入HBV抗原按5～100μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養4～6小時。
7.7天成熟的HBV特異性DC(mature DC，mDC)疫苗的收穫倒置顯微鏡下觀察各組細胞，按照細胞狀態進行評分，包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態。拍照記錄。取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例，細胞計數。計算出第7天存活細胞分別佔第0天收集的PBMC總數和貼壁細胞的比例，記錄。分別取對照組和抗原組1～5×105細胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱(細胞因子可換算成/24小時/10000細胞)。細胞用於流式細胞儀檢測細胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)，mDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標誌CD11c染色決定；細菌和真菌培養陰性、支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗。病人注射劑量為1～2×107/次，前臂皮下或淋巴結內注射。
8.HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周後加強免疫。按5×106/ml加入凍存液(含10％DMSO)，凍存管放入預冷的乙醇中，首先置於-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置於液氮中凍存。
9.凍存的HBV特異性DC疫苗的復甦分別在凍存後的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復甦。凍存管由液氮中取出後直接放入37℃水浴中。一旦細胞懸液融化後馬上加入AIM-V(含1％AB血清)進行稀釋。稀釋液應逐滴加入，並且輕輕地搖動凍存管，使DMSO從mDC中釋放出來。否則，太快加入稀釋液，mDC細胞內的DMSO由於其滲透壓會使水分很快滲入細胞，使mDC細胞腫漲裂解而死亡。用AIM-V培養基(含1％AB血清)洗滌3次，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例，細胞計數。計算存活細胞在凍存細胞中比例，記錄。吸取各組解凍的mDC 100ul作無菌試驗(包括細菌和真菌培養，支原體，LPS檢驗)。分別用解凍細胞進行①流式細胞儀測mDC表型；②mDC介導HBV特異性CD8+T淋巴細胞的產生；③混合淋巴細胞反應；④mDC介導自體T細胞分泌IFN-γ等實驗(自體T細胞與mDC同步凍存，在mDC解凍前兩天解凍培養)。
對本發明的疫苗進行了以下效果觀察1.不同成熟階段的DC表型測定結果應用以上技術方法可以有效誘導DC表型的成熟，這為HBV特異性DC疫苗的製備提供了技術保障，見表1。
表1成熟與未成熟DC的表型測定結果(％)
*與iDC組比較，p＜0.052.不同劑量HBV抗原負載後DC疫苗表型的變化應用不同劑量的HBsAg、HBcAg負載DC的效果是不一樣的。但無論是HBsAg、HBcAg，當劑量為20μg/ml時其促進DC成熟的作用強於10μg/ml的劑量，當提高負載劑量時，並未能進一步提高DC的表型，故20μg/ml為最適宜的負載劑量，見表2。應用20μg/ml劑量的HBsAg聯合HBcAg負載DC，其促進DC表型的功能均強於單獨應用HBsAg和HBcAg，見表3。
表2不同劑量的HBsAg和HBcAg負載DC後表型的變化(％)
a與0μg/ml組比較，p＜0.05，b與10μg/ml組比較，p＜0.05
表3HBsAg和HBcAg單獨應用或聯合應用對DC表型的影響(％)
a與No-Ag組比較，p＜0.05；b與HBsAg組比較，p＜0.05；c與HBcAg組比較，p＜0.053.HBV特異性DC疫苗誘導自體T細胞分泌IFN-γ不同抗原負載的HBV特異性DC疫苗誘導T細胞產生IFN-γ的能力不一樣，見圖1，HBcAg或HBcAg聯合HBsAg負載的HBV特異性DC疫苗誘導T細胞分泌IFN-γ的能力要優於HBsAg。
4.應用HBV特異性DC疫苗的適應症對不同免疫狀態的病人研究結果如圖2。從結果可知，HBVDNA＞105copies/ml，並且ALT＞80U/L時，HBV特異性DC疫苗產生IL-12以及誘導自體T細胞產生IFN-γ的能力均強於ALT＜80U/L的病人，因此HBV特異性DC疫苗在免疫激活期病人應用較為有效。
5.HBV特異性DC疫苗的特點HBcAg和HBsAg聯合負載的HBV特異性DC疫苗能誘導體外培養的自體T細胞中產生針對s181-193、c18-27表位的特異性CD8+T細胞。說明應用HBV特異性DC疫苗可誘導機體產生針對HBV的多克隆特異性CTL，更有利於HBV的清除，見圖3。
本發明的DC疫苗較其它疫苗有如下特點DC可採用患者自身的PBMC誘導而成，避免交叉感染，安全性好，同時也可用HLA配型相同的健康獻血者的PBMC誘導而成；HBV感染的病人由於DC功能的數量減少和功能的受損，不能有效提呈抗原，經體外處理後可恢復或增強抗原提呈功能，且分泌細胞因子的功能增強，可有效激活機體的免疫狀態；另外DC在體外已經過抗原的負載，抗原加工及提呈已完成，故可極大的提高疫苗的效率和免疫效果，有效地激活初始的T細胞和靜息狀態的記憶性T細胞，以及B細胞，少量DC疫苗即可誘發強烈的細胞免疫和體液免疫。本發明提供的疫苗不僅可誘導機體產生針對HBsAg的細胞免疫反應，還可誘導機體產生針對HBcAg的免疫反應，兩者結合，相互促進，具有協同作用，抗病毒效果優於單純HBsAg負載的DC疫苗。由於血液來源充分，可大規模分離PBMC製備樹突狀細胞，通過體外誘導以及HBsAg和HBcAg負載後可獲得通用型HBV特異性DC疫苗，可供HLA配型相同廣大的CHB患者使用，應用前景廣闊。
圖1不同類型的HBV特異性DC疫苗誘導T細胞產生IFN-γ的結果圖2HBV特異性DC疫苗對不同免疫狀態T細胞的作用圖3HBV特異性DC疫苗誘導表位特異性CD8+T細胞的比例檢測結果(▲HBV-s183-191-specific CTL的頻率；●HBV-c18-27-specific CTL的頻率；■HBV-pol575-583-specific CTL的頻率)
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1，製備1.HBsAg和HBcAg的來源HBsAg來源於重組(酵母)B肝疫苗不加免疫佐劑的半成品。HBcAg來源於本室構建的攜帶HBcAg全基因序列的質粒PMM2066，在大腸桿菌中表達後分離純化而得。
2、0天PBMC的分離取外周抗凝血100ml，用淋巴細胞分離液分離PBMC，用預冷的PBS將分離出的PBMC稀釋成20ml，分置於2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，共兩次以去除細胞碎片和血小板，吸棄上清。將去除細胞碎片和血小板的PBMC再用PBS稀釋。在2個滅菌的離心管中加入預先恢復至室溫的淋巴細胞分離液，將稀釋後的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細胞分離液液面上使形成界面，淋巴細胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6。離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細胞分離液和紅細胞四條帶。收集界面單個核細胞於離心管中，用PBS稀釋至10ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細胞3次。將細胞合併到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養液懸浮細胞，計數細胞數為6×107，用臺盼藍染色測定細胞存活比例為99％，存活細胞總數約為6×107。調整細胞濃度至2×106/ml，鋪於6孔板中，每孔2.5ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育2小時，使單核細胞貼壁。
3、0天DC培養當孵育結束時，首先用培養皿中的液體衝洗貼壁細胞，吸出上層未貼壁細胞，加入預熱的培養基，再衝洗2次，收集未貼壁細胞和大部分的貼壁(但可被衝洗下來)的淋巴細胞，計數為4×107。用含10％FCS的RPMA1640培養基調整細胞濃度為2×106/ml，加入維持劑量的IL-2(5～50U/ml)，於一潔淨培養瓶中培養，每3天半量換液，並根據細胞狀況隨時調整培養基量，補加細胞因子，即為自體T淋巴細胞，待後續實驗用。剩餘細胞加入預熱的AIM-V培養基，內含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細胞，按照細胞狀態評分為5分，拍照記錄。置37℃、5％的CO2溫箱中培養3天。
4、3天半量換液倒置顯微鏡下觀察DC細胞，按照細胞狀態進行評分為5分。收集每孔細胞於一個離心管中，及時在每孔中添加預熱的AIM-V培養液，以免貼壁細胞缺水乾死。收集的細胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養液，補加入等量新鮮的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培養液，置37℃、5％的CO2溫箱中培養。
5、5d半量換液倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分為5分。收集每孔的懸浮細胞，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定DC細胞存活比例為95％，細胞計數5×107，半量換液，操作如3d半量換液。換液的細胞因子濃度減半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4 250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2溫箱中培養。
6、6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原負載倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分為5分，吸取2×106細胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細胞因子IL-10、IL-12等，細胞用於流式細胞儀檢測細胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。吸取iDC培養液100μl作無菌試驗(包括細菌和真菌培養，支原體，LPS檢驗)。孔內加入HBV抗原按5～1000μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養6小時。
7、7天成熟的HBV特異性DC(mature DC，mDC)疫苗的收穫倒置顯微鏡下觀察各組細胞，按照細胞狀態進行評分為5分，取出10μL細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例為95％，細胞計數為5.7×107。分別取對照組和抗原組2×106細胞懸液，離心，留上清-20℃冰箱保存。細胞用於流式細胞儀檢測細胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。細菌和真菌培養陰性，支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗。
8、HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周後加強免疫。按5×106/ml加入凍存液(含10％DMSO)2.0ml，分裝成10個凍存管凍存。凍存管先放入預冷的乙醇中，首先置於-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置於液氮中凍存。
9、HBV特異性DC疫苗的復甦分別在凍存後的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復甦。復甦時將1個凍存管由液氮中取出後直接放入37℃水浴中。一旦細胞懸液融化後馬上加入AIM-V(含1％AB血清)進行稀釋。用AIM-V培養基(含1％AB血清)洗滌3次，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例為85％，細胞計數4.5×106。吸取復甦後的mDC 100ul作無菌試驗(包括細菌和真菌培養，支原體，LPS檢驗)。分別用復甦細胞進行如下實驗(1)流式細胞儀測mDC表型復甦後HBV特異性DC疫苗取6×105的量，用流式細胞儀檢測細胞的表型。結果見表4。從表4可知凍存後1周、2周和4周表型DC的表型幾乎無改變，說明凍存4周內對DC疫苗的表型無影響，保證的疫苗的質量。
表4HBV特異性DC疫苗在不同時間復甦後的表型檢測(％)
(2)mDC誘導HBV特異性CD8+T細胞的產生將復甦HBV特異性DC疫苗與自體T細胞(自體T細胞與mDC同步凍存，在DC疫苗復甦前兩天復甦培養)按1∶20混合培養7天後用Tetramer檢測T細胞中HBV特異性CD8+T細胞的比例，3次復甦的結果混合培養之前，T細胞含特異性HBV-c18-27CD8+T細胞的比例均由0.01％上升到培養後的0.13％、0.15％、0.12％，特異性HBV-s183-191CD8+T細胞的比例由0.01％上升到培養後的0.08％、0.10％、0.09％，因此HBV特異性DC疫苗可誘導T細胞中HBV特異性CTL的產生。
(3)混合淋巴細胞反應復甦後的DC疫苗經絲裂黴素C滅活後按1∶25的比例與自體T細胞(自體T細胞與DC疫苗同步復甦，在DC疫苗復甦前兩天解凍培養)混合培養，同時取相同數量的T細胞不加DC疫苗作為對照進行培養，4天後應用細胞增殖檢測試劑盒(美國Promega公司產品)檢測細胞的增殖情況，3次結果為經DC疫苗刺激的T細胞數量是未用DC疫苗刺激的T細胞數量的1.5倍、1.7倍和1.6倍。說明經HBV特異性DC疫苗刺激後可明顯促進T細胞的增殖。
(4)HBV特異性DC疫苗誘導自體T細胞分泌IFN-γ取復甦後的HBV特異性DC疫苗2×104的量與T細胞按1∶12.5的比例(T細胞數為2.5×105)在ELISpot檢測系統的96孔培養板中進行混合培養，以不與DC疫苗混合培養的相同數量的T細胞作為對照，48小時後檢測分泌IFN-γ細胞的頻率。3次復甦後實驗的結果為，經HBV特異性DC疫苗刺激的T細胞分泌IFN-γ細胞的數量分別為35、31和38，而不經DC疫苗刺激的T細胞分泌IFN-γ細胞的數量分別為11、9和10。說明HBV特異性DC疫苗可誘導分泌IFN-γ的細胞產生，從而增強對病毒的抑制作用。
實施例2注射劑的製備取實施例1步驟7或9得到的疫苗按以下配方溶解在注射用水中，按照常規技術製備成注射液。
疫苗 1×107氯化鉀 0.04mg磷酸二氫鉀 0.04mg氯化鈉 1.6mg磷酸氫二鈉.7H2O0.432mg用蒸餾水配製成終體積為200μl注射液。
權利要求
1.一種HBV特異性DC疫苗，其特徵在於，所述疫苗是用HBsAg和HBcAg負載單核細胞來源的樹突狀細胞，使該樹突狀細胞負載抗原並培養成熟後得到的。
2.權利要求1的疫苗，其特徵在於，所述致敏的單核細胞來源的樹突狀細胞是用HBsAg和HBcAg共同負載未成熟的moDC。
3.權利要求2的疫苗，其特徵在於，所述負載未成熟的moDC是在未成熟的moDC細胞液中加入5～100μg/ml的濃度的HBsAg和HBcAg，共同孵育。
4.權利要求3的疫苗，其特徵在於，所述共同孵育時間為12～48小時。
5.權利要求4的疫苗，其特徵在於，共同孵育後得到的成熟的致敏的樹突狀細胞即權利要求1的疫苗。
6.含有權利要求5的疫苗的疫苗製劑。
7.權利要求6的疫苗製劑是注射劑。
8.權利要求7的疫苗的製備方法，其特徵在於，經過用HBsAg和HBcAg共同負載未成熟的moDC的步驟。
9.權利要求8的製備方法，其特徵在於，經過以下步驟1)HBsAg和HBcAg的獲得HBsAg來源於重組B肝疫苗不加免疫佐劑的半成品，HBcAg來源於本室構建的攜帶HBcAg全基因序列的質粒PMM2066，在大腸桿菌中表達後分離純化而得；2)0天PBMC的分離取外周抗凝血50～100ml，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用預冷的PBS稀釋成15～20ml，分置於2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，離心兩次以去除細胞碎片和血小板，吸棄上清；將去除細胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀釋；在2個滅菌的離心管中加入預先恢復至室溫的淋巴細胞分離液，將稀釋後的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細胞分離液液面上使形成界面，淋巴細胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6；離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細胞分離液和紅細胞四條帶；收集界面單個核細胞於離心管中，用PBS稀釋至10～20ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細胞2～3次；鏡下觀察細胞狀態，如果細胞碎片和血小板較多，1200rpm/8分鐘再洗一次；將細胞合併到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養液懸浮細胞，計數細胞濃度，用臺盼藍染色測定細胞存活比例，計算存活細胞總數，做好記錄；調整細胞濃度至2～5×106/ml，鋪於6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育1～2小時，使單核細胞貼壁；3)0天DC培養當孵育結束時，首先用培養皿中的液體衝洗貼壁細胞，吸出上層未貼壁細胞，加入預熱的培養基，再衝洗2次，以去除未貼壁細胞和大部分的貼壁的淋巴細胞；未洗盡的淋巴細胞比單核細胞小而圓亮；拍照記錄；置37℃、5％的CO2溫箱中培養3天；未貼壁細胞約佔PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培養基調整細胞濃度為1～3×106/ml，加入維持劑量的IL-2，於一潔淨培養瓶中培養，每3天半量換液，並根據細胞狀況隨時調整培養基量，補加細胞因子，即為自體T淋巴細胞，待後續實驗用；貼壁細胞數量＝總PBMC-總未貼壁細胞數，記錄；衝洗時，用吸管上下吹吸幾次，輕輕振蕩培養皿；接著面向操作者傾斜培養皿，吸盡培養基；當吸下面的液體時，滴管頭懸在液體中，沿培養皿四周邊移動滴管邊吸，不要用吸管刮培養皿的底面；按此法，吸出每個培養皿內的液體；整個操作過程要迅速，以免細胞在洗滌過程中缺水乾死；加入預熱的AIM-V培養基，內含GM-CSF、IL-4；倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分；觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態；4)3天半量換液倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分；觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態；拍照記錄；收集每孔細胞於一個離心管中，及時在每孔中添加預熱的AIM-V培養液，以免貼壁細胞缺水乾死；收集的細胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養液，補加入等量新鮮的含GM-CSF、IL-4的AIM-V培養液；置37℃、5％的CO2溫箱中培養；5)5天半量換液倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，由最差到最好劃分標準並評分0～5分；觀察的指標包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態；拍照記錄；收集每孔的懸浮細胞，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定DC細胞存活比例，細胞計數；計算出第5天存活的DC細胞佔第0天收集貼壁細胞總數的比例，記錄；半量換液，操作如3天半量換液；換液的細胞因子濃度減半；置37℃、5％的CO2溫箱中培養；6)6天收集未成熟DC和抗原負載倒置顯微鏡下觀察細胞，按照細胞狀態進行評分，包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態；拍照記錄；然後吸取2～5×105細胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細胞因子IL-10、IL-12等，因子濃度可換算成/24小時/10000細胞，以利於比較；細胞用於流式細胞儀檢測細胞iDC表型，iDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標誌CD11c染色決定；吸取iDC培養液100μl作無菌試驗；孔內加入HBV抗原按5～100μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養4～6小時；7)7天成熟的HBV特異性DC疫苗的收穫倒置顯微鏡下觀察各組細胞，按照細胞狀態進行評分，包括細胞密度、細胞碎片、懸浮細胞的數量、大細胞的數量和樹枝狀突起的狀態；拍照記錄；取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例，細胞計數；計算出第7天存活細胞分別佔第0天收集的PBMC總數和貼壁細胞的比例，記錄；分別取對照組和抗原組1～5×105細胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱；細胞用於流式細胞儀檢測細胞mDC表型，mDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標誌CD11c染色決定；細菌和真菌培養陰性、支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗；病人注射劑量為1～2×107/次，前臂皮下或淋巴結內注射；8)HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周後加強免疫；按5×106/ml加入凍存液，凍存管放入預冷的乙醇中，首先置於-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置於液氮中凍存；9)凍存的HBV特異性DC疫苗的復甦分別在凍存後的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復甦；凍存管由液氮中取出後直接放入37℃水浴中；一旦細胞懸液融化後馬上加入AIM-V進行稀釋；稀釋液應逐滴加入，並且輕輕地搖動凍存管，使DMSO從mDC中釋放出來；否則，太快加入稀釋液，mDC細胞內的DMSO由於其滲透壓會使水分很快滲入細胞，使mDC細胞腫漲裂解而死亡；用AIM-V培養基洗滌3次，取出10μl細胞懸液用臺盼藍染色，測定細胞存活比例，細胞計數；計算存活細胞在凍存細胞中比例，記錄；吸取各組解凍的mDC 100ul作無菌試驗；分別用解凍細胞進行①流式細胞儀測mDC表型；②mDC介導HBV特異性CD8+T淋巴細胞的產生；③混合淋巴細胞反應；④mDC介導自體T細胞分泌IFN-γ等實驗。
10.權利要求9的疫苗在製備用於誘導機體產生針對HBsAg和HBcAg的特異性免疫反應的疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種HBsAg和HBcAg共負載的B肝特異性DC疫苗，該疫苗是用重組B型肝炎病毒表面抗原和重組B肝病毒核心抗原同時負載單核細胞來源的樹突狀細胞，使該樹突狀細胞得以負載抗原而成熟從而製成的HBV特異性DC疫苗。
文檔編號A61P31/00GK1981866SQ200610078028
公開日2007年6月20日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者王福生, 施明, 金磊, 陳威巍 申請人:解放軍三○二醫院生物治療研究中心