一種集蜂麴黴菌株及其應用的製作方法

2023-04-26 23:25:21 1

專利名稱：一種集蜂麴黴菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種甲醛降解菌，具體涉及一種集蜂麴黴 (Aspergillus nomius) H5及其在降解甲醛方面的應用。
背景技術：
因應用領域的廣泛及重要性，關於甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究早有報 道。早期人們著手於低濃度降解甲醛的研究，近年來高濃度降解甲醛時有報導。 Adroer 等(1990)分離的 Pseudomonas putida A2 能降解甲醛 250mg · L-1 ； Azachil 等 (1995)分離的 Halomonas sp.MAC 僅能耐受甲醛 75 IOOmg · I/1 ； Doronina 等(1997) 分離的 Pseudomonas.alcaligenes 能降解甲醛 200mg · I/1，菌株 Pseudomonas putida J3 能降 解甲醛 450mg · L-1，Methylobacteriumextorquens 能降解甲醛 500 IOOOmg · I/1 ； 一株 Pseudomonas alcaligenes 培養 3 天后能降解甲醛 2000mg · I/1。Mirdamadi 等(2005)報 道 Methylobacterium extorquens (ESS 禾口 PSS)禾口 四株 Pseudomonas pseudoalcaligenes (LSW, SSW, NSW, OSS)能降解甲醛 I85Omg · I/1，其中菌株 Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS 培養 24h 消耗 3700mg · I71 甲醛 100%，培養 72h 消耗 5920mg · I71 甲醛 70%， Methylobacterium extorquens ESS 禾口 Methylobacterium extorquens PSS 還能完全降角軍甲酸 2960mg · I71。Bonastre等(1986)報導在C 為2300mg · dm 3的活性汙泥做基質的 實驗裡能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧條件下被好氧菌降解；當以甲醛為碳源時降解 甲醛400mg · dm3，在活性汙泥廠的廢水處理中完全降解甲醛2300mg · dm3和苯酚 2400mg · dm3(Zagomayaetal，1990)。Yamazaki 等(2001)從海水裡分離了一株甲醛耐 受細菌，發現它在3%的氯化鈉裡能降解甲醛400mg · dm3，在Eiroa等(2004)設計的 模型裡，指出硝化作用可以降解甲醛，當以甲醛為碳源、甲醇為伴生碳源時，硝化細菌 可以降解甲醛的濃度是30 3890mg · dm3，而反硝化細菌在有甲醛和甲醇存在時可以 降解 1360mg · dm3 甲醛(Eiroaetal，2006)。現有的研究，無論是低濃度降解甲醛還是高濃度降解甲醛，大部分都是關於是 降解甲醛細菌和降解甲醛酵母菌的研究，而關於降解甲醛黴菌的研究報導很少。Kondo 等(2002)從土壤中分離 了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomiusIRI013, 它能生長在最高= 0.45%裡並把它完全消耗掉。國內這方面的研究近兩年來也 漸多，黃賽花等人有一系列技術報導，從家具廠未處理出水口處分離到甲醛降解真菌 (2007)，研究出 3 株甲醛轉化黴菌 Trichoderma viride Hl，Penicillium javanicum H2， Aspergillus flavus H4,均能生長在以甲醛為唯一碳源的培養基上，可將甲醛濃度分別由 1047mg/L、1059mg/L 和 1241mg/L 轉化至 7.6mg/L、317mg/L 和 4.0mg/L，轉化率分別 為99.3%、70.1%和99.7% (2008)，都能利用4種複合碳源(0.1 %甲醛+10%蔗糖，0.1% 甲醛+10%麥芽糖，0.1%甲醛+10%澱粉，0.1%甲醛+10%葡萄糖)並轉化甲醛，其轉化 率分別在 99.6%、74.9%和 99.3% 以上(2009)。
但是隨著甲醛汙染的生物處理工程技術日新月異的需求，上述降解甲醛菌數據 庫顯得非常不足，迫切需要更多關於降解甲醛菌的技術研究成果為甲醛汙染的生物處理 工程提供強有力的幫助。

發明內容
本發明的一個目的是針對現有甲醛降解菌技術的不足，提供一種新的甲醛降解 菌，所述甲醛降解菌易培養，甲醛轉化效率高。本發明的另一個目的是提供所述甲醛降解菌的應用。本發明的技術方案通過以下技術予以實現提供一種新的甲醛降解菌，為集蜂麴黴(Aspergillusnomius)菌株，於2010年4
月9日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中
心保藏，保藏號是CGMCCNo.3721，命名為集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5。 所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius) H5的平板觀察特徵和顯微觀察特徵如下H5在察氏培養基上7天直徑3 4cm，12 14天達5 6cm，質地主要為致 密絲絨狀，中央部出現不規則的溝紋，菌落初期黃色，而後變綠，反面無色至淡黃色； 在麥芽汁瓊脂上菌落生長快，培養7天長滿全皿，質地絮狀，較厚，初期白色，後變綠 色；在查氏酵母膏瓊脂上，菌落生長液快，培養7天長滿全皿，質地絲絨狀或絮狀，較 厚，分生孢子結構多，綠色，有不規則的溝紋，菌落反面淡黃褐色；顯微鏡下可以觀察 到分生孢子頭初為球形，後呈輻射形；頂囊近球形至燒瓶形，直徑10 25 μ m，產孢結 構雙層，分生孢子多為球形或近球形，直徑3.0 5.0 μ m，壁稍粗糙。所述集蜂麴黴(Aspergillusnomius) H5 的 18Sr DNA 比對序列見 SEQ ID NO 1 所 示。其18Sr DNA序列與集蜂麴黴(Aspergillusnomius)同源率達100%。本發明同時提供了所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5的甲醛降解特性實驗， 通過大量實驗證明了 H5的甲醛轉化效率很高，可以作為優良的甲醛降解菌應用於甲醛汙 染的生物處理方面。本發明的有益效果是本發明提供了一種新的集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5，所述菌株具有優良
的降解甲醛的能力，極大地補充了降解甲醛菌的資料庫；所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5在自然界中分布範圍廣，繁殖迅速，生長能力強。本發明提供了集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5在甲醛降解方面的應用，為甲醛 汙染的生物處理工程，提供了強有力的技術支持。


圖1H5在察氏培養基上菌絲生長情況圖2H5在麥芽汁瓊脂上菌絲生長情況圖3H5在查氏酵母膏瓊脂上菌絲生長情況
圖4H5顯微鏡下孢子結構圖5不同甲醛濃度培養基中的H5降解曲線圖6不同甲醛濃度培養基的空白曲線
圖7不同甲醛濃度培養基中的H5生長曲線
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。實施例1本發明甲醛降解菌-集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5的分離與鑑定1、培養基配方基本培養基1.0%(w · ν—1)葡萄糖，0.2% (w · NaNO3, 0.1% (w · ν-1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7H20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 0.01% (w · 酵母膏，0.1% (w · 甲醛(甲醛用市售甲醛標準溶 液)，培養基最終pH為6.0。(如沒有特別說明，以下基本培養基均為此配方培養基)察氏培養基配方3.0%(w .ν—1)蔗糖，0.3% (w · NaNO3, 0.1% (w · ν-1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7Η20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 1.5 ~ 2.0% (w · 瓊脂。麥芽汁培養基配方2.0% (w · V1)麥芽浸膏，0.1% (w · V1)蛋白腖，2.0% (w · ν—1)葡萄糖，1.5-2.0% (W · V-1)瓊脂。查氏酵母膏瓊脂配方K2HPO4CU % (w · v—1)，酵母膏0.05% (w · ν—1)，蔗糖 3.0% (w ·丨1)，查氏濃儲液 ml(w ·丨1)，1.5 2.0% (w · ν-1)瓊脂。pH 自然。 其中查氏濃儲液配方NaN0330g，KC15g，FeSO4 · 7H200.1g, MgSO4 · 7H205g,水 IOOmLo2、分離純化隨機取菜園土 1kg，晾至7 8成幹，0.1 % (w · ν—1)的甲醛溶液200mL，用 滴管均勻加入菜園土樣中，4 5天後再重複加入一次0.1% (w · ν—1)的甲醛200mL，
3 4天後混勻取樣IOOg左右，在超淨工作檯上，取IOg經0.1%甲醛馴化過的土樣置 於90mL無菌水中，振蕩15min，放置20秒，取ImL上清液接種於基本培養基中，在 搖床上160r · miiTiCTC培養5d，生長起來的真菌再多次用PDA培養基平板畫線，經多 次純化，分離到一株黴菌，編號H5。然後將菌株H5分別接種於察氏培養基、麥芽汁培 養基、查氏酵母膏瓊脂上，25°C培養8d，觀察其菌落特徵。同時，顯微鏡下觀察顯微結 構，並記錄好結構特徵。H5在察氏培養基上7天直徑3 4cm，12 14天達5 6cm，質地主要為緻密 絲絨狀，中央部出現不規則的溝紋，菌落初期黃色，而後變綠，反面無色至淡黃色；見 附圖1所示；在麥芽汁瓊脂上菌落生長快，培養7天長滿全皿，質地絮狀，較厚，初期白 色，後變綠色；見附圖2所示；在查氏酵母膏瓊脂上，菌落生長液快，培養7天長滿全皿，質地絲絨狀或絮 狀，較厚，分生孢子結構多，綠色，有不規則的溝紋，菌落反面淡黃褐色；見附圖3所
示ο顯微鏡下可以觀察到分生孢子頭初為球形，後呈輻射形；頂囊近球形至燒 瓶形，直徑10 25μιη，產孢結構雙層，分生孢子多為球形或近球形，直徑3.0 5.0 μ m，壁稍粗糙。見附圖4所示。
提取DNA，檢測DNA濃度和純度，PCR 18S rDNA擴增等一系列的分子鑑定， 所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5的18& DNA比對序列見SEQ ID NO 1所示，本 發明分離純化得到的降解甲醛菌的18SrDNA序列與集蜂麴黴(Aspergillusnomius)同源率 達100%，其培養特徵及顯微特徵也與集蜂麴黴(Aspergillusnomius)最相似。由此可見，本發明篩選到的降解甲醛菌是集蜂麴黴(Aspergillusnomius)。實施例2本發明集蜂麴黴(Aspergillus nomius) H5對甲醛的降解實驗1、一級種子的製取選取產孢良好的集蜂麴黴(Aspergillus nomius)H5，接種在基本培養基中，搖床 160r · mm1, 30°C培養2 3d，當黴菌進入快速生長期時，定時測定OD475值，當OD475 值快速上升時，此菌液即可作為一級種子。2、實驗方案選取大口 150mL三角瓶，配製基本培養基，按約0.1%、0.15%, 0.2%, 0.25% (w - ν"1)加入(C 以實際測量數據為準)，瓶口用無菌封口培養膜封口，培養一 級種子(OD475值為0.878)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上30°C 160r · miiT1培養，並 在接種的第O、24、48、72、96、120、144h分別取樣，每次取3瓶，其中一瓶為空白， 取樣後先7000 X超低溫離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度法檢測C甲·，濾紙和 菌一起轉入已稱至恆重的燒杯中測菌絲乾重，菌絲乾重用重量法測量，結果取其平均值 作圖。OD值測定用北京普析通用儀器有限責任公司TU-1800型紫外可見分光光度計，
菌絲乾重用重量法測量，結果取其平均值作圖。結果見附圖5 附圖7所示。其中，附圖5為不同甲醛濃度培養基中的H5降解 曲線，附圖6為不同甲醛濃度培養基的空白曲線，附圖7不同甲醛濃度培養基中的H5生 長曲線。由附圖5 附圖7可知4個濃度的空白在144h內的揮發很少，基本可以忽略不計，見附圖6所示。當甲醛初始濃度為1235mg/L時，144h可全部被降解完，降解率為100%，快 速降解從48h後開始，見附圖5所示；菌絲乾重也從0.4689g上升到0.5298g，增加了 0.0609g,快速增長從72h後開始，見附圖7所示；當甲醛初始濃度為1682mg/L時，144h 下降到65mg/L，降解率為96.1%，快速降解從48h後開始，菌絲乾重也從0.4759g上升 到0.5236g，增加了 0.0477g，快速增長從72h後開始；當甲醛初始濃度為2377mg/L時， 144h下降到854mg/L，降解率為64.1%，快速降解從96h後開始，菌絲乾重增加緩慢， 沒有明顯的快速增長；當甲醛初始濃度為2849mg/L時，144h也能降解到1507mg/L，降 解率達到47.1%，沒有快速降解期，菌絲乾重增加緩慢，沒有明顯的快速增長。
權利要求
1.一種集蜂麴黴(Aspergillus nomius)菌株H5，於2010年4月9日保藏於中國微生物 菌種保藏管理委員會，保藏號是CGMCCNo.3721。
2.權利要求1所述集蜂麴黴(Aspergillusnomius)菌株H5的序列表。
3.權利要求1所述集蜂麴黴(Aspergillusnomius)菌株H5的應用，其特徵在於應用於降解甲醛。
全文摘要
本發明公開了一種集蜂麴黴(Aspergillus nomius)菌株H5及其應用。所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius)菌株H5於2010年4月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏號是CGMCCNo.3721。所述集蜂麴黴(Aspergillus nomius)菌株H5在自然界中分布範圍廣，繁殖迅速，生長能力強，本發明提供了集蜂麴黴(Aspergillusnomius)菌株H5在降解甲醛方面的應用，為甲醛汙染的生物處理工程提供技術支持。
文檔編號C12N1/14GK102021121SQ201010253820
公開日2011年4月20日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者劉婷琳, 盧普相, 張朝陽, 楊孟娟, 陳能場, 黃賽花 申請人:廣東省生態環境與土壤研究所