一種小鼠甲狀腺上皮細胞分離及培養方法與流程
2023-04-26 23:15:02
本發明屬於細胞生物學領域，具體涉及一種小鼠甲狀腺上皮細胞分離及培養方法。
背景技術：
甲狀腺是脊椎動物非常重要的腺體，屬於內分泌器官，位於哺乳動物頸部甲狀軟骨下方，氣管兩旁。其中，甲狀腺上皮細胞(也稱為濾泡細胞或主要細胞)在甲狀腺細胞中是負責生產和分泌甲狀腺激素，包括四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)，具有調節動物體生長發育、基礎代謝及繁殖活動的重要生理功能。甲狀腺功能異常會引起甲狀腺腺瘤、甲狀腺癌、原發性甲狀腺功能亢進和減退等疾病，甲狀腺細胞的體外培養是甲狀腺疾病研究的一種重要方法。目前有關甲狀腺原代培養的組織多取材於體型較大的哺乳動物，如豬、狗、綿羊、兔等，成本較高，而且培養的甲狀腺細胞的體外生存時間和功能差異也較大。由於小鼠的甲狀腺組織較小，取材和後續處理有一定難度，但是小鼠繁殖率高，可以降低實驗成本，而且生物學性質清晰而且便於操作等優勢，是研究人類疾病最佳的模式生物之一，本發明所提供得甲狀腺上皮細胞的分離培養方法可以獲得產量高、純度高且生存時間較長的小鼠甲狀腺上皮細胞。
技術實現要素：
本發明的目的是建立一種獲得產量高、純度高且生存時間較長的小鼠甲狀腺上皮細胞分離培養的方法。
為了解決上述所涉及到的問題，本發明採取如下方法獲得小鼠甲狀腺上皮細胞：
小鼠甲狀腺上皮細胞分離方法的步驟包括：(a)腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，酒精消毒後取出與氣管相連的小鼠甲狀腺組織，置於預冷無菌含雙抗的PBS緩衝液中浸泡洗滌，並剝離甲狀腺組織；(b)機械解離甲狀腺組織後，預熱混合酶液震蕩消化30-40min，Ficoll分離甲狀腺單個核細胞，離心獲取細胞沉澱；(c)混合完全培養基重懸細胞沉澱，接種於處理後的細胞瓶中，差速貼壁法獲得甲狀腺上皮細胞；(d)混合完全培養基培養純化後的甲狀腺上皮細胞。
可選的小鼠為體重20-25g，6-8周齡的小鼠。
可選的消化所用消化酶液為預先在37℃預熱的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原酶和1-2U/mL中性蛋白酶的酶混合液，消化時間為30-40min；
可選的震蕩消化的方法為37℃水浴震蕩，震蕩頻率為250-300次/min；
可選的細胞瓶的處理方法為含5％的小鼠血清37℃孵育過夜；
可選的差速貼壁方法為細胞懸液在37℃培養箱中貼壁20-30min後，將未貼壁的細胞懸液重新轉接於新的包被板中，重複一次該步驟。
可選的混合完全培養基的基礎培養基為RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM(1∶1∶1～1∶1.5∶1)。
可選的混合完全培養基中的添加因子為100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和5％-10％的小鼠血清。
本發明提供的小鼠甲狀腺上皮細胞分離方法中消化液選用預熱的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原 酶和1-2U/mL中性蛋白酶混合液用以消化細胞，一方面減少了胰酶的用量，降低了胰酶對甲狀腺上皮細胞的損傷，提高了細胞的存活率，另一方面節省了消化所需時間。
本發明提供一種混合完全培養基培養甲狀腺細胞的方法，增加了甲狀腺上皮細胞的生存期，以及減少了添加因子的種類，降低了成本。
進一步的，本發明選用加入含有100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和10％的小鼠血清的混合完全培養基作為生長初期的細胞接種液，待細胞長成單層時，更換為含5％小鼠血清的混合完全培養基，促進小鼠甲狀腺細胞保持較長時間的上皮樣。
本發明解決了甲狀腺上皮細胞分離培養過程成本高，存活時間短的問題，使獲得的小鼠甲狀腺上皮細胞產量高、純度高且生存時間較長。
附圖說明
圖1：培養5天的小鼠甲狀腺上皮細胞；
圖2：小鼠甲狀腺上皮細胞免疫螢光鑑定。
具體實施方式
為了使本發明的目的及優勢更清新地展現，現將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發明進行解釋，並不用於限定本發明。
本發明選擇6-8周齡的雄性小鼠，分離甲狀腺上皮細胞。具體操作如下：
1、取6-8周齡的雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒後取出與氣管相連的小鼠甲狀腺組織，置於預冷無菌含雙抗的PBS 緩衝液中浸泡洗滌，並剝離甲狀腺組織；
2、在冰上於顯微鏡下迅速地去除甲狀腺上的包膜、血細胞及結締組織等附著物，將剝離後的甲狀腺轉至新的PBS緩衝液中清洗2次；
3、在冰上用解剖剪機械剪碎甲狀腺組織，大小約1mm3左右的碎塊；
4、將剪碎的組織加入預熱的4-5倍體積的消化混合液，於37℃震蕩消化30-40min，震蕩頻率為250-300次/min；所述消化混合液包括0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型膠原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型膠原酶和1-2U/mL中性蛋白酶；
5、吹打使細胞分散，經200目篩網過濾後，加入至含Ficoll的分離液中，2000r/min離心，取中間白色層，1500rpm/min離心5min，棄上清；
6、製備含10％小鼠血清的混合完全培養基：將RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培養基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基礎培養基，在混合基礎培養基中加入100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和10％的小鼠血清。
製備含5％小鼠血清的混合完全培養基：將RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培養基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基礎培養基，在混合基礎培養基中加入100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物、10ng/mL氫化可的松、10μg/mL胰島素、20-50ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生長因子EGF和5％的小鼠血清。
7、用10％小鼠血清的混合完全培養基重懸細胞沉澱，接種於經5％的小鼠血清37℃孵育過夜處理後的細胞瓶中，置於37℃、5％(m/v)的CO2飽和溼度的培養箱中培養20-30min後，將未貼壁的細胞懸液轉移至新的處理後的細胞瓶中， 重複一次上述差速貼壁步驟。
8、培養24h後，更換為5％小鼠血清的混合完全培養基，顯微鏡下可見細胞貼壁，呈聚集生長，細胞呈圓形或橢圓形。
9、免疫螢光鑑定：(1)待細胞生長5d後，棄去培養基，用溫育的PBS衝洗細胞2次，每次10min，然後用4％多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；(2)PBS衝洗細胞2次，每次10min，然後在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；(3)PBS衝洗細胞2次，每次10min，然後在室溫條件下，用4％BSA封閉細胞30min；(4)按1∶100的比例稀釋單克隆Cytokeratin-18一抗，然後將其放在4℃冰箱中孵育過夜；(5)PBS衝洗細胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀釋二抗，37℃條件下放置1h；(6)用PBS衝洗3次，每次10min，最後DAPI染細胞核並用螢光顯微鏡拍照。
以上已經對本發明創造的較佳實施例進行詳細闡述，但本發明創造不限定於上述實施例，凡在本發明的精神和原則之內作出任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍內。