一種甄別dpyd基因*9a突變位點的pcr檢測試劑盒及方法

2023-04-26 12:21:21

專利名稱：一種甄別dpyd基因*9a突變位點的pcr檢測試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種甄別二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPYD) 基因*9A突變位點實時螢光PCR檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
化療是臨床惡性腫瘤治療的三大手段之一，其主要應用的就是各類抗瘤機理，毒 性迥異的藥物。5-氟尿嘧啶是一種氟化嘧啶類化療藥物，在臨床上用於抗代謝抗腫瘤治療， 對增殖性細胞均具有較好的殺傷效果。目前，該類藥物已經廣泛應用在臨床多種腫瘤的治 療領域，如胃腸道腫瘤、婦科腫瘤、頭頸部腫瘤等。二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPYD)基因編碼的二氫嘧 啶脫氫酶是作用於5-FU藥物代謝途徑中的關鍵性酶之一，是分解代謝的限速酶，體內二氫 嘧啶脫氫酶含量的高低決定5-FU的代謝速度，進而影響體內藥物的毒性和療效。DPYD酶位 於1號人類染色體短臂上(1ρ22)，基因全長約1501Λ，含有31Λ的編碼序列，由23個外顯子 構成，長度從69bp到1404bp，基因中內含子由長短不等的序列組成。共編碼1025個氨基 酸。5-FU藥物代謝與DPYD多個基因多態性位點相關，*9A位點(T85C)基因多態性是其中 之一。文獻報導表明多種疾病的人體易感性、藥物代謝差異均與人類基因組中含有的基因 多態性相關，根據不同個體的差異制定合適的治療方案是目前臨床治療的發展趨勢。目前 已經明確二氫嘧啶脫氫酶與5-FU藥物療效有較高的相關性，針對酶活性檢測的方法主要 以放射性標記結合HPLC法、mRNA表達等，但是這些方法操作比較麻煩，實驗周期長。研究 表明DPYD基因含有40多種與5-FU分解代謝相關的基因多態性位點(其中DPYD*9A位點 (T85C)基因多態性在中國人群中報導較多)，大部分的檢測方法仍然以基因直接測序方法 為主，一些分子生物學方法如基因晶片、DHPLC、PCR-SSCP, RFLP等已經應用到了 DPYD基因 多態性檢測領域。高解析度熔解曲線是近幾年發展起來的分子生物學技術，是一種結合染 料法螢光定量PCR反應的分析方法，可以直觀、有效地區分PCR產物中含有的基因多態性位 點ο

發明內容
本發明目的是根據二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點設計引物，提供一種甄別甄別二 氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點(T85C)的實時螢光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，可實現 對二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點快速、準確、特異分析。本發明採用的技術方案是一種甄別二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點實時螢光PCR檢測試劑盒，所述試劑 盒主要包括特異性引物、Eva Green螢光染料、PCR緩衝液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚 合酶，其特徵在於所述特異性引物序列如下上遊引物5『 -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 『下遊引物5『 -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 『。
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本發明關鍵在於特異性引物的設計和檢測的方法，試劑盒中其他組成，可按本領 域常規進行選擇，該試劑盒可用作二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點的定性檢測，也可加 入標準品進行定量檢測。高解析度熔解曲線技術(High Resolution Melting, HR )技術是近幾年發展起 來的高精度分析方法，利用螢光定量PCR技術生成熔解曲線，通過讀取其峰值可以將單個 鹼基差別的序列進行特異性的鑑定。本發明選取含有二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點片段， 可通過螢光定量PCR和HR技術對二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點多態性進行準確區分。為達到定量檢測的效果，所述試劑盒還可包括2種二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點 的陽性基因標準品，所述標準品序列如下二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點野生型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt ；二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點突變型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt。一種甄別二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點的實時螢光PCR檢測方法，所述方法 包括(1)提取待測樣品DNA;(2)取特異性擴增引物、PCR緩衝液、Eva Green螢光染料、脫氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶，分別加入待測樣品DNA或陰性對照品配成PCR反應體系，於同等條件下進行 PCR擴增反應，反應管置於定量螢光PCR儀進行螢光檢測；所述特異性引物序列如下上遊引物5『 -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 『下遊引物5,-AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3『；(3)選擇螢光檢測模式FAM螢光對應波長，基線調整取3 15個循環的螢光信號， 以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品螢光增長曲線超過閾值 線，並呈良好的對數增長，則判斷為擴增反應陽性。為確定二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點類型，所述方法可同時以陽性基因野生型標 準品、突變型標準品和雜合型標準品DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應， 擴增反應結束後，進一步以待測樣品DNA、野生型標準品DNA、突變型標準品DNA和雜合型標 準品DNA的PCR擴增產物從75°C逐步升溫到90°C，繪製溶解曲線，進行高解析度溶解曲線 分析，結果與質粒標準品高解析度溶解曲線結果進行比較，進而判定待檢樣品的類型；所述陽性基因標準品序列如下二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點野生型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt ；
二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點突變型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt。二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點雜合型標準品為等摩爾量野生型標準品和突變型 標準品的混合物。熔解曲線對PCR產物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈擴增產物逐漸解鏈，導致螢光 強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產物解鏈，螢光急劇下降。利用該特點，由於不同 PCR產物序列的GC%不同導致其Tm值的不同，因此使其螢光信號發生迅速下降的溫度也不 同，可通過對溫度下降過程進行實時監控，進而此對PCR的特異性進行鑑定。所述方法同時以梯度濃度的陽性基因野生型標準品DNA溶液在與待測樣品DNA相 同條件下進行PCR擴增反應，以標準品DNA溶液拷貝濃度的對數值為橫坐標、標準品Ct值 為縱坐標繪製標準曲線；根據樣品DNA測得的Ct值，對照相應陽性基因標準品的標準曲線， 獲得樣品DNA的拷貝濃度(突變型和雜合型均可以野生型標準品的標準曲線進行定量分 析)。所述PCR反應條件可按參照本領域常規螢光定量PCR方法，具體的，本發明中所述 PCR擴增反應條件如下95°C變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒，進行45個循環。PCR反應液通常按如下組成配製(終濃度)1XPCR buffer、0. 5 μ M的引物、 IXEva GreenUU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，通常取2μ L的模板，反應總體積通常為 20 μ L0本發明建立了利用染料螢光定量PCR結合高解析度熔解曲線技術甄別二氫嘧啶 脫氫酶基因*9Α突變位點的方法，並經檢測實際樣本，表明該方法切實可行。由於本方法採 用了 PCR擴增和高解析度熔解曲線技術，使得二氫嘧啶脫氫酶基因*9Α突變位點甄別的靈 敏度大大提高。本發明採用了目前較先進的定量PCR結合高解析度熔解曲線技術，通過一次PCR 反應可以將二氫嘧啶脫氫酶基因*9Α突變位點類型進行準確甄別。基因序列中單鹼基的 差異可以反應變性過程中解鏈時間的不同，進而可以通過高解析度熔解曲線技術進行鑑 定。以前使用較多的染料法使用的均是不飽和染料，同時儀器的熔解曲線解析度只能達到 1.0°C，不能滿足單個鹼基差異的區分。本發明使用的染料為Eva Green屬於飽和染料，可 以真實的反應PCR片段的Tm值，而且目前所使用的螢光定量PCR儀器熔解曲線的精確度為 0. ore，因此可以對單個鹼基的變化進行甄別。使得對於基因多態性位點通過一次PCR反 應進行鑑定，節省了實驗的時間。本發明的有益效果主要體現在能夠高靈敏度、高特異性、簡便地對二氫嘧啶脫氫 酶基因*9A突變位點進行甄別，也可加入標準品進行定量檢測和分析。


圖1為二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點(T85C)三種類型(野生型、突變型和雜合 型)基因標準品的實時螢光定量PCR檢測，A 實時螢光PCR擴增圖，B:熔解曲線圖，C:高分 辨率熔解曲線圖；其中1 野生型，2 突變型，3 雜合型。
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圖2為野生型質粒標準品實時螢光定量PCR標準曲線；從左至右分別為105、104、 103、102U0\l0°copies/ μ L 標準品。圖3為野生型質粒標準品的實時螢光定量PCR標準曲線方程圖；A為標準曲線為 Y = -3. 642Χ lgX+39. 79 ；Y 對應的CT值；X 野生型樣本的copies ；B 熔解曲線圖；C為高 解析度熔解曲線圖。圖4為9例臨床樣本檢測螢光定量PCR結果；A為螢光定量PCR擴增結果；；B為 熔解曲線結果；C為高解析度熔解曲線結果。其中3例野生型、3例雜合型、3例突變型。Ct 值分別為 27. 99,28. 02,32. 36,29. 12,29. 45,29.86,27.73,27.89,30.05，對應的 copies 為 1. 73X IO3Copies/μ LU. 70X IO3Copies/μ LU X IO2Copies/μ L>8. 5X 102copies/μ L、 6. 92X 102copies/y L>5. 37 X 102copies/μ L、2. 04 X 103copies/μ LU. 86 X 103copies/ μ L、4. 78 X 102copies/μ L0
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此實施例1 1、材料人體血液基因組DNA提取試劑購自上海輝睿生物技術有限公司；PCR反應體系和 Taq DNA聚合酶購自上海輝睿生物技術有限公司，pGEM-T-Easy克隆系統購自Promage公 司、Eva Green染料購自上海輝睿生物技術有限公司，377型測序儀、Bio-Rad icycler PCR 儀，RotoGene 6000定量PCR儀為澳大利亞Corbett公司產品。2、引物合成以二氫嘧啶脫氫酶基因序列(註冊號為MNOOOl 10)為模板，使用I^rimer 5. O軟體 分析引物，從中選擇最佳組合。檢測用PCR引物序列如下上遊引物5『 -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 『下遊引物5『 -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 『測序用PCR引物序列如下Fl 5' -ACTCGAGACTGTAGGCACTG-3『，Rl 5' -AAGAGTCGTGTGCTTGATGT-3『均由上海輝睿生物技術有限公司合成。3、檢測標準品製備選取ImL血液樣本，用DNA提取試劑提取基因組DNA，取1. O μ 1 (50ng/ μ L)做PCR 反應模板，用前述引物(Fl和Rl)在Bio-Rad icyclerPCR儀上進行PCR擴增PCR反應液組成如下
2XPCR buffer10. Ομ L
引物 Fl (10 μ Μ)1 μ L
引物 Rl (10 μ Μ)1 μ L
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2μ L
dNTPs (各 250mM)1. 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L) 1 μ L水補足至20 μ L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒進行35個循環擴 增，最後於72°C延伸5分鐘後置40C0PCR產物經電泳檢測後即用克隆系統插入pGEM-T-Easy克隆載體，並將陽性克隆 經測序驗證，確認DPYD*9A位點突變類型，並採用重疊定點誘變擴增法構建對應另外類型 的標準質粒。回收223bp片段，即為野生型和突變型標準品，測定濃度並換算成(拷貝數/ 體積)。4、結果經測序，上述設計標準品完全與預期相符，回收的標準品片段序列如下二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點野生型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataattttgatgac atcaagcaca cgactctt ；二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點突變型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataattttgatgac atcaagcaca cgactctt。實施例2 螢光定量PCR結合高解析度熔解曲線法檢測二氫嘧啶脫氫酶基因*9A 位點1、樣本檢測9例臨床血液標本，採用基因組DNA提取試劑提取基因組DNA，分別取LOyL做模 板，用檢測用上下遊引物在Corbett公司RotoGene 6000型定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR反應液組成如下IXPCR buffer2μ LMgCl22· 8 μ LIXEva Green2μ L上遊引物(10μ Μ)IuL下遊引物(10μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補足至20 μ L。PCR反應條件為95°C預變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進行40個循環擴增， 75°C逐步升溫到90°C，形成熔解曲線。以不含有該靶基因的非人源性細胞為陰性對照於相同條件下進行PCR檢測，以閾
8值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品螢光增長曲線超過閾值線， 並呈良好的對數增長，則判斷為擴增陽性，否則判斷為擴增陰性結果，擴增陽性的結果，通 過高解析度熔解曲線與標準質粒結果相比較，確定樣本類型。同時在相同條件下以不同濃度標準品進行檢測，並繪製標準曲線。待測樣本的測定結果經儀器處理根據標準曲線計算出檢測樣本中DPYD基因的 copies。按照上述方法，對各種不含有該靶基因的非人源性樣品DNA(鼠源性Lewis肺癌細 胞株，或鼠源性B16黑色素瘤細胞株等)進行檢測，結果均呈陰性，說明本發明方法特異性 好。按照上述方法，對三種類型模板(野生型、突變型和雜合型標準質粒)進行螢光定 量PCR檢測，圖1為標準質粒的螢光定量PCR擴增結果、熔解曲線結果和高解析度熔解曲線結果。2、樣品檢測結果野生型質粒標準品檢測結果參見圖2，標準曲線及對應的熔解曲線、高解析度熔解 曲線結果參見圖3。9例臨床樣本檢測螢光定量PCR結果參見圖4，圖4A為螢光定量PCR擴增結 果；圖4B為熔解曲線結果；圖4C為高解析度熔解曲線結果。其中3例野生型、3例雜合 型、3 例突變型。Ct 值分別為 27. 99,28. 02,32. 36,29. 12,29. 45,29. 86,27. 73,27. 89、 30. 05，對應的 copies 為 1. 73 X 1O3Copies/μ L、1. 70 X 1O3Copies/μ L、1 X 1O2Copies/μ L、 8. 5Χ 1O2Copies/μ L、6. 92 X 1O2Copies/μ L、5. 37X 1O2Copies/μ L、2. 04Χ 1O3Copies/μ L、 1. 86Χ 1O3Copies/μ L、4. 78X 1O2Copies/μ L。本發明是結合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發明的上述內容後，本領 域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求 書所限定的範圍。
權利要求
1.一種甄別二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點實時螢光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒 主要包括特異性引物、Eva Green螢光染料、PCR緩衝液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，其特徵在於所述特異性引物序列如下上遊引物5 『 -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 『下遊引物5 『 -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 『。
2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括2種二氫嘧啶脫氫 酶基因*9A位點的陽性基因標準品，所述標準品序列如下二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點野生型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點突變型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt。
3.—種甄別二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點的實時螢光PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣品DNA；(2)取特異性擴增引物、PCR緩衝液、EvaGreen螢光染料、脫氧三磷酸核苷混合物和 DNA聚合酶，分別加入待測樣品DNA或陰性對照品配成PCR反應體系，於同等條件下進行 PCR擴增反應，反應管置於定量螢光PCR儀進行螢光檢測；所述特異性引物序列如下上遊引物5 『 -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 『下遊引物5 『 -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 『；(3)選擇螢光檢測模式FAM螢光對應波長，基線調整取3 15個循環的螢光信號，以閾 值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品螢光增長曲線超過閾值線， 並呈良好的對數增長，則判斷為擴增反應陽性。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述方法同時以陽性基因野生型標準品、突 變型標準品和雜合型標準品DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應，擴增反 應結束後，進一步以待測樣品DNA、野生型標準品DNA、突變型標準品DNA和雜合型標準品 DNA的PCR擴增產物從75°C逐步升溫到90°C，繪製溶解曲線，進行高解析度溶解曲線分析， 結果與陽性基因標準品高解析度溶解曲線結果進行比較，進而判定待檢樣品的類型所述陽性基因標準品序列如下二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點野生型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點突變型標準品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactcatgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氫嘧啶脫氫酶基因*9A位點雜合型標準品為等摩爾量野生型標準品和突變型標準 品的混合物。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述方法同時以梯度濃度的陽性基因野生型 標準品DNA溶液在與待測樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應，以標準品DNA溶液拷貝 濃度的對數值為橫坐標、標準品Ct值為縱坐標繪製標準曲線；根據樣品DNA測得的Ct值， 對照陽性基因標準品的標準曲線，獲得樣品DNA的拷貝濃度。
6.如權利要求3 5之一所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增反應條件如下95°C 變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒，進行45個循環。
全文摘要
本發明提供了一種甄別二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點實時螢光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物、Eva Green螢光染料、PCR緩衝液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特徵在於所述特異性引物序列如下上遊引物5′-CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3′，下遊引物5′-AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3′。本發明的有益效果主要體現在能夠高靈敏度、高特異性、簡便地對二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點進行甄別，也可加入標準品進行定量檢測和分析。
文檔編號C12Q1/68GK102146440SQ20101061226
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者徐農, 方維佳, 牟海波, 鄭怡 申請人:浙江大學