鼠源IgG核酸適配子及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-26 08:22:41

專利名稱：鼠源IgG核酸適配子及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及利用分子生物學技術--一系統進 化指數富集技術設計和製備一組與鼠源IgG高特異性和高親和力結 合的鼠源IgG核酸適配子及其應用。背景技術：
鼠源IgG是用於抗原檢測的單抗的主要種類，廣泛應用於實驗室 和臨床診斷領域。其高特異性、高親和性的配體，對於鼠IgG的分離 純化以及檢測具有重要意義，可替代生物醫學研究中廣泛使用的二 抗。SELEX技術(系統進化指數富集技術)是90年代初研製的一種 新的組合化學技術，其利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨 機寡核苷酸文庫，其中隨機序列一般長度在20 40bp左右，文庫容 量在10" 1015之間，由於單鏈隨機寡核苷酸片段特別是RNA易形成 發卡、口袋、假節、G-四聚體等二級結構，故能與蛋白質、小肽，甚 至金屬離子結合，形成具有很強結合力的複合物。這種方法具有簡便、 快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體 表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的核酸適配子具有許多 優勢a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學合成，節約成本；b. 具有比抗體更高的親和性和特異性；c.便於標記，在不同部位有選擇 性的標記；d.穩定性好，重複性好，易於保存，對高溫和劇烈條件 不敏感。因此，寡核苷酸適配子在臨床檢測及診斷中具有良好的應用 前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種鼠源IgG核酸適配子，它通過SELEX技 術篩選鼠IgG的核酸適配子，與現有鼠IgG的特異性抗體相比，本發 明中的核酸適配子具有更高的特異性、親和力，因此可替代抗體，用 於簡潔快速、高靈敏度、高特異性的鼠IgG檢測及分離純化方法的建本發明的第二個目的是提供一種鼠源IgG核酸適配子替代抗體在鼠源 IgG檢測上的應用或用於鼠源IgG的分離純化。本發明的第三個目的是提供第二種鼠源IgG核酸適配子。本發明的第四個目的是提供第二種鼠源IgG核酸適配子在鼠源IgG檢 測上的應用或用於鼠源IgG的分離'純化。本發明的技術方案 一種鼠源'IgG核酸適配子，其特徵在於，它是具 有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核苷酸序列之一。上述所述的SEQ IDNo.l SEQ ID No.18的核苷酸序列具有下述結構之一image see original document page 7上述所述的核苷酸序列也可以是與SEQ.一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之一相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是與SEQ 一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之-有相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是用SEQ 一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之一上述所述的核苷酸序列的不少於一個位 有鹼基甲基化嘌呤或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤ID No. 1 SEQ ID No. 18'中的 同源序列佔60%以上，使其具有ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 -雜交的寡核苷酸序列，使其具ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 轉錄的RNA序列。 置的A或G或C或T或U被稀 置換後，使其具有相同功能。上述所述的核苷酸序列的不少於一個位置進行磷酸化或甲基化 或氨基化或巰基化或同位素化或結合生物素或結合地高辛或結合熒 光物質或結合納米發光材料或酶標記修飾，使其具有相同.功能。一種鼠源IgG核酸適配子的篩選製備方法，其特徵在於，它是由以下步驟構成(1) 用PCR製備ssDNA文庫；文庫擴增方案一 採用對稱PCR擴增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，後者以鏈親和素磁珠為基質進行分離並變性解鏈，磁分離後經乙醇沉澱得到 後續篩選的ssDNA文庫。 文庫擴增方案二採用不對稱PCR，獲得ssDNA文庫。(2) 反篩與篩選 "以Protein A—瓊脂糖為基質,反篩去掉ssDNA文庫中的非特異 結合部分，篩選得到與鼠源IgG特異結合的ssDNA;(3) 克隆及陽性克隆的序列測定擴增數輪篩選後所得次級文庫，回收目標片段，經連接、轉化， 挑取單克隆白斑，對PCR反應鑑定的陽性克隆進行序列測定。一種鼠源IgG核酸適配子的應用，其特徵在於在實驗室、臨床及 工業化的應用，包括用於鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純化。上述所述的鼠源IgG核酸適配子的應用，其具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36的核苷酸序列之一，用於實驗室、臨床及工業 化，包括鼠源IgG的檢測和/或鼠源IgG的分離純化。本發明的優越性在於具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組 合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷 酸文庫中篩選出的適配子具許多優勢1)本身是寡核苷酸，分子量 較小，可以化學合成，節約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特 異性；3)便於標記且可以在不同部位有選擇性的標記；4)重複性和 穩定性好，且易於保存，即對高溫和劇烈條件不敏感。因此，SELEX 技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。

圖1為檢測一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG特異性結合的 點雜交實驗結果。圖2為一種鼠源IgG核酸適配子檢測鼠源IgG的Western Blot 實驗結果(其中圖2-a為核酸適配子檢測鼠源IgG的實驗結果，圖2- b為抗體檢測鼠源IgG的實驗結果)v圖3為一種鼠源IgG核酸適配子檢測鼠源IgG的組織化學實驗結 果(其中圖3-a為核酸適配子檢測鼠源IgG的組織化學實驗結果，圖3- b為鼠源IgG組織化學檢測的空白對照)。具體實施例方式
實施例l一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵是具有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列之一。 SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列'5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCAGTCACTC TGTGTTTMG CCCAGTACCC 50 TCTTCAACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG''G 3' 81SEQ ID No.2所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTMCGC ACGCATGTCA ACAGACGTCC 50 GCTGCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列V5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTAGCGACA GACGCMTCC CCACGCGCAT 50 CGAGGCACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.4所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCAAGA GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCMCTT GAGC嵐ATC ACCTGCAGGG G 3, 81SEQ ID No.5所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGGCAGCG ATAGAGCCAT CATCCCCCCC 50 CACCCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 6所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTCACAC CGTCATTGAT CCTCCGACAC 50 AAGCTAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 7所述的核苷酸序列 ，5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTCCCTCAGC ACCCAGACCC CGCTTCTCCC 50ACATTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.8所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TACCCGTTAC CCMCCGATT TCCTTACGCC 50 GCMTTACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.9所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCGCCCCACA ACACACTGTC CCGCTGCCAT 50 CCCGTCAACT TGAGCAAAAT CACCTGCAGG GG 3' 82SEQ ID No. IO所述的核苷酸序列:'"5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTGGCCCCG CTCTCTCCTA CCTCTTTCAC 50 CACGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 11所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGTATGCTG AGTGTACCAG CCCTTCTCTC 50 ACCCTAACTT GAGCAMATC ACCTGCAGGG G 3' 81SEQ ID No. 12所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGCCGMC CATCTCGATC CCCAGCTGGG 50 ACTACACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3' 80SEQ ID No. 13所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCMCATCC GGCTTCCCGC GTACGCGCGT 50TGTGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3, 81 SEQ ID No. 14所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCM《A GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 15所述的核苷酸序列 ''5, ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGCCMTCC CCCMGGTTC CTCCATTACA 50TCCGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 16所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TC雄CGCCC CATACCGTCT TCACCCATCC 50 GCCCTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 17所述的核苷酸序列''5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGAGCCCAT CACCTGCAGG GGACCCCGGA 50 TTCACTTGAG CA嵐TCACC TGCGGGGG 3， 78SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCACCTGGA AAAGCATAGC TTG嵐CATC 50 GCACAAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81 本發明中用於SELEX篩選的單鏈DNA隨機庫及引物由 irwitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為35個鹼基的隨機序 列5， CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT- ( N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3，，庫容量為10"以上，引物l: 5' CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，，引物2: 5， -biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT 3，，引物3: 5， biotin-CCCCTGCAGGT GATTTTGCTCMGT3，，引物 4: 5' -ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。鼠源IgG購於天津華生生物技術 有限公司，硝酸纖維素濾膜購於MiriiPore公司，寡核苷酸的純化試 劑購於北京天為時代公司，PCR試劑盒和T載體購於Promega公司。實施例2一種鼠源IgG核酸適配子的篩選製備方法，其特徵在於，它是由以下步驟構成(l)用PCR製備ssDNA文庫文庫擴增方案一PCR反應體系為 IOX擴增緩衝液 10 ul 4種dNTP混合物各200 u mol/L引物l 100pmo1(5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，)引物2 lOOpmol (5， biotin-ATCCGCCTGATTAGCGAT ACT3，)模板DNA lug (5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT- (N35)-AGTATCGCTMTCAGGCGGAT 3')Taq DNA聚合酶 2. 5UMg2+ 1.5ramol/X加雙或三蒸水至 100 ulPCR反應條件為94'C預變性3min,然後94'C變性lmin， 65°C 退火45sec， 72。C延伸30sec，循環30次,最後72。C延伸5min。將PCR擴增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，dsDNA產物經 分離純化，與鏈親和素磁珠結合；然後用0. 15mol/L的Na0H使dsDNA 變性解鏈，磁分離；液體經乙醇沉澱，溶於TE緩衝液中。98° C加 熱2 min，冰上1 min，室溫5 min，測定吸光度(A)值，作為篩選 的ss靈文庫。 "''文庫擴增方案二利用引物l、引物2擴增單鏈DNA文庫採用不對稱PCR，引物 1/引物2濃度比100: 1,擴增條件為94。C預變性3min，然後94°C 變性30s， 65""C退火45s， 72'C延伸lmin，循環35次，最後72。C延 伸7min。將獲得的產物(主要為ssDNA)於95。C作用3min,於冰中 2min，室溫放置10min,即為ssDNA文庫。(2)反篩與篩選100pmo1隨機ssDNA文庫和5nmo1 (tRNA+鮭魚精DNA)加入10 n 1 Protein A—瓊脂糖反篩，在100ul結合緩衝液中室溫孵育lhr;然後轉移液體，與鼠源IgG—Protein A—瓊脂糖25。C結合lhr，用衝 洗緩衝液洗6次，洗去未結合的ssDNA，再加洗脫緩衝液於8(TC作用 10min，洗脫下與鼠源IgG結合的ssIJNA,經酚一氯仿抽提、乙醇沉 澱。將ssDNA溶解於20pl TE緩衝液中，用作擴增的模板，進行下 一輪篩選，重複篩選20輪。— (3)克隆及陽性克隆的序列測定以第20輪篩選所得文庫為模板，以引物1和引物^進行PCR，瓊 脂糖電泳後回收81bp處片斷，與T載體4'C連接過夜，轉化DH5 a感 受態細胞，塗板(Amp+， IPTG誘導，X—gal為底物)，37'C培養16h 後，挑取單克隆白斑，置Amp+液體培養基搖菌過夜，提取質粒，如 圖l所示質粒電泳圖。以質粒為模板，以引物l，引物4擴增，如圖 2所示在81bp左右處有擴增出的目標條帶，將有目的條帶的陽性克隆進行序列測定。 實施例3點雜交實驗檢測一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG的結合將不同量鼠源IgG (0， 1， 2， 3， 4ng;體積均為10ul)點在硝 酸纖維素膜上，待吸收完全，將膜以3%BSA和100 ix 1鮭魚精DNA室 溫封閉l一l. 5h，然後將獲得的5'標記生物素的一種鼠源IgG核酸 適配子lOOpmol以TBS稀釋至適當體積，與膜雜交，室溫lh, TBST 洗後雜交辣根過氧化酶標記的鍵親和素，發光顯跡，結果陽性，並呈 現梯度。表明篩選得到的一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG存在特 異性結合。實施例4 Western Blot法測定鼠源IgG將Hs578T細胞裂解液與加樣緩沖液混合，採用Bio-rad的 mini-VE電泳系統進行蛋白質SDS-PAGE電泳，分離膠濃度12%，濃縮 膠5%，將膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。用鼠源抗GSTn抗體與 膜孵育，洗滌後用5，標記生物素的一種鼠源IgG核酸適配子與生物 素標記的抗鼠IgG的特異性抗體分別痴交，繼而與辣根過氧化酶標記 的鏈親和素孵育，洗滌後用發光顯跡液發光，暗室內X光片曝光，X光片顯影定影。結果均顯示明顯的條帶，表明一種鼠源IgG核酸適配 子可替代抗體用於鼠源IgG的檢測。 實施例5組織化學法檢測鼠源IgG以 篩 選 的 阮，觀U 序 列 為 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCAGTCACTCTGTGTTTMG板，以引物3和引物4進行不對稱PCR，引物3 (lOOpmol) /引物4 濃度比200: 1,擴增條件為94。C預變性3min,然後94。C變性30s， 65。C退火45 s， 72。C延伸lmin,循環35次，最後72°。延伸7min。 反應產物主要為5'生物素標記的DNA適配子，將其於95'C作用3min， 於冰中2min，室溫放置10min，'作為檢測試劑備用。人乳腺癌病理切 片常規脫蠟至水，0. 3%仏02-甲醇溶液作用30min封閉內源性過氧化物 酶，TBS洗5min，與鼠源抗GSTn抗體孵育後再與製備好的DNA適配 子室溫孵育lh，設立空白對照組，TBS洗3X5min。切片與辣根過氧 化物酶標記的親和素(1: 1000稀釋)孵育30min, DAB顯色液(50mg 溶於100ml TB液中，臨用前加入10pl 30% H202)中顯色5-10min, 鏡下觀察控制顯色程度。結果空白對照組無明顯棕黃色沉澱，而與鼠 源IgG核酸適配子孵育的乳腺癌組織顯示明顯的棕黃色沉澱，表明篩 選得到的核酸適配子能與鼠源IgG特異結合，從而可用於鼠源IgG的 檢測和分離純化。 ' 實施例6 …一種鼠源IgG核酸適配子，具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列之一。SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列.5'CAGTCACTCT GTGTTTAAGC CCAGTkcCT CTTCA 3， 35SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列5，CCCTMCGCA CGCATGTCM CAGACGTCCG CTGC 3' 34SEQ ID No. 21所述的核苷酸序列5'GTAGCGACAG ACGCMTCCC CACGCGCATC GAGGC 3' 35SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列5'GACCCAAGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列^ 5'GCGGCAGCGA TAGAGCCATC ATCCcfccCCC ACCC 3， 34 SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列 5'CCCTCACACC GTCATTGATC CTCCGACACA AGCTA 3， 35 SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列 ， 5'TCCCTCAGCA CCCAGACCCC GCTTCTCCCA CATTC 3， 35 SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列 5'ACCCGTTACC CMCCGATTT CCTTACGCCG CMTT 3， 35 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列 5，CGCCCCACM CACACTGTCC CGCTGCCATC CCGTCA 3， 36 SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列 5，GTGGCCCCGC TCTCTCCTAC CTCTlltACC ACGAC 3' 35 SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列 5，TGTATGCTGA GTGTACCAGC CCTTCTCTCA CCCTA 3， 35 SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列 5，GCGCCGAACC ATCTCGATCC CCAGCTGGGA CTAC 3' 34 SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列 5'CCMCATCCG GCTTCCCGCG TACiXGCGTT GTGAC 3， 35 SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列 5'GACCCMGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列 5，TGCCMTCCC CCMGGTTCC TCCA竹ACAT CCGAC 3， 35 SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列 5'CAMCGCCCC ATACCGTCTT CACCCATCCG CCCTC 3， 35 SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列 5，TGAGCCCATC ACCTGCAGGG GACCCCGGAT TC 3， 32 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列 5'GCACCTGGM MGCATAGCT TGAAACATCG CACAA 3， 35 SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 2所述的核苷酸 序列第22至55的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 #SEQ ID No. 21所述的核苷寧序列% SEQ ID No. 3所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一遂，這兩個序列所示的^種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 'SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 4所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 5所述的核苷酸 序列第22至55的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 6所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩'個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。力" ？SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 7所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 8所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一惡這兩個序列所示的一種鼠源IgG核酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 9所述的核苷酸 序列第22至57的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 "SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 10所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 11所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致,這兩'個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 12所述的核苷酸 序列第22至55的鹼基順序一致，這裔個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 13所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 ，SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 14所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 15所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。
；、、.SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 16所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 17所述的核苷酸 序列第22至53的鹼基順序二致，這^個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 18所述的核苷酸 序列第22至56的鹼基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQUENCE LISTING國家納米技術與工程研究院鼠源IgG核酸適配子及其製備方法和/^用 2007101880615 2007101880615 2007-U-23 200610130352.4 2006-12-15 36 Patentln version 3.4 1 81 DNA 人.r序列 1atccgcctga ttagcgatac tcagtcactc tgtgtttaag cccagtaccc tcttcaactt 60gagcaaaatc acctgca鵬g 81 2 8'0 DNA 人工序列. 2atccgcctga ttagcgatac tccctaacgc acgcatgtca acagacgtcc gctgcacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80 3 81 DNA ^工序列 3atccgcctga ttagcgatac tgt^cgaca gacgcaatcc ccacgcgcat cgaggcactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81 4 81 DNA人i:序列 4atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 5 80 pNA 人工序列 5atccgcctga ttagcgatac tgcggcagcg atagagccat catccccccc cacccacttg 60 agcaaaatca cctgcag^g 80 6 81 DNA 人工序列 6atecgc魄a ttagcgatac tccctcac^;敏cattgat cctccgacac aagctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 7 81 DNA 人.l:序列81 7atccgcctga ttagcgatac ttcccte^c acccagaccc cgcttctccc acattcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 8 81 DNA 人丄序列 8atccgcctga ttagcgatac tacccgttac ccaaccgatt tccttacgcc gcaattactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 9 82 DNA 人工序列 9atccgcctga ttagcgatac tcgccccaca acacactgtc ccgctgccat cccgtcaact 60 ,tgagcaaaat cacctgcagg gg 82 10 81 DNA 人工序列 10atccgcctga ttagcgatac tgtggccccg ctctctccta cctotttcac cacgacactt 60 gagcaaaatc acctgc^gg g 81' 11 81 DNA '人工序列 11atccgcctga ttagcgatac ttgtatgctg agtgtaccag cccttctctc accctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81 12 80 DNA 人工序列 12atccgcctga ttagcgatac tgcgccgaac catctcgatc cccagctggg actacacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80 13 81' DNA 人T序列 13atccgcctga ttagcgatac tccaacatcc ggcttcccgc gtacgcgcgt tgtgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 14 81. DNA 人工序列' 14atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 g堪caaaate acctgcaggg g 81 15 81 DNA 人工序列 15atccgcctga ttagcgatac ttgcc幼tcc ccca^gttc ctccattaca tccgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 16 81 DNA 人工序列 16atccgcctga ttagcgatac tcaaacgccc cataccgtct tcacccatcc gccctcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 17 7.8 DNA. 人工序列 17atccgcttga ttagcgatac ttgagcccat cacctgcagg ggaccccgga ttcacttgag 60 caaaatcacc tgcggggg 78 18 81 DNA 人工序列 18.atccgcctga ttagcgatac tgcacc^ga aaagcatagc ttgaaacatc gcacaaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81 19 35 DNA 人工序列 19cagtcactct gtgtttaagc ccagtaccct cttca 35' 20 34 DNA 人工序列 20ccctaacgca cgcatgtcaa cagacgtccg ctgc 34 21' 35 DNA 人工序列<40O 21gtagcgacag acgcaatccc cacgcgcatc gaggc 35 22 35 DNA 人工序列 22gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35 23 34 DNA 人工序列 23gcggcagc扭tagagccatc atcccccccc accc 34 24， 35 DNA 人工序列 24cccteacacc gtcattgate ctccgacaca. agcta 35 25 35 t)NA 人工序列 25tccctcagca cccagacccc gcttctocca cattc 35 26 35 DNA 人工序列 26acccgttacc caaccgattt ccttacgccg caatt 35 27 36 DNA 人工序列 57cgccccacaa cacactgtcc cgctgccatc ccgtca 36. 28 35 DNA 人工序列 28gtggccccgc tctctcctac ctctttcacc acgac 35 9 35. DNA 人工序列 29tgtatgctga gtgtaccagc ccttctctca cccta 3 5 30 34 DNA 人工序列 2|0gcgccgaacc atctcgatcc cc堪ctg^a ctac 34 31' 35 DNA 人工序列 31 》 .ccaacatccg gcttcccgcg tacgcgcgtt gtgac 35 32 35 DNA 人工序列 32gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35 33. 35 DNA 人工序列 33tgccaatccc ccaaggttcc tccattacat ccgac 35 34 35 DNA 人工序列 34'caaacgcccc ataccgtctt cacccatccg ccctc 35' 35 32 DNA 人工序列 35tg呢cccatc acctgcaggg gaccccggat te 32 36 35 DNA 人工序列 36gcacctggaa aagcatagct tgaaacatcg cacaa 3權利要求
1. 一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於，它是具有序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一。
2、根據權利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於所說的 SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核智酸序列具有下述結構之一
3.image see original document page 33、 .根據權利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於所說的 核苷酸序列也可以與SEQ ID No. 1廣SEQ ID No. 18中的一種鼠源IgG核酸適 配子的核苷酸序列之一同源序列佔60%以上，使其具有相同功能。
4、 根據權利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於所說的拔-竹Ef酸序列也可以與SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18一種鼠源IgG核酸適合匕配子的核苷酸序列之一雜交的寡核苷酸序列，使其具有相同功會
5、 根據權利要求l所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於所說的 核苷酸序列也可以用SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18中的一種鼠源IgG核酸適 '配子的核苷酸序列之一轉錄的RNA序列。
6、 根據權利要求l所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於所說的 核苷酸序列的不少於一個位置的A或G或C或T或U被稀有鹼基甲基化嘌呤 或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換後，使其具有相同功能。
7、 根據權利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在 於所說的核苷酸序列的不少於,一個位置進行磷酸化或甲基化或氨基 化或巰基化或同位素化或結合生物素或結合地高辛或結合螢光物質或結合納米發光材料或酶標記修飾，使其具有相同功能。
8、 一種上述鼠源IgG核酸適配子的篩選製備方法，其特徵在於它是由以下步驟構成U)用PCR製備ssDNA文庫；文庫擴增方案一採用對稱PCR擴增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，後者以 鏈親和素磁珠為基質進行分離並變性解鏈，磁分離後經i醇沉澱得到 後續篩選的ssDNA文庫。文庫擴增方案二-採用不對稱PCR，獲得ssDNA文庫。(2) 反篩與篩選以Protein A—瓊脂糖為基質，反篩去掉ssDNA文庫中的非特異 結合部分，篩選得到與鼠源IgG特異結合的ssDNA;(3) 克隆及陽性克隆的序列測定擴增數輪篩選後所得次級文庫，回收目標片段，經連接、轉化， 挑取單克隆白斑，對PCR反應鑑定的陽性克隆進行序列測定。
9、 一種上述鼠源IgG核酸適配子的應用，其特徵在於在實驗室、 臨床及工業化的應用，包括用於鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純 化。
10、 根據權利要求9所說的一種鼠源IgG核酸適配子的應用，其 特徵在於所說的具有序列表中SEQ ID No.l9 SEQ ID No.36的核苷 酸序列之一，用於實驗室、臨床及工業化，包括鼠源IgG的檢測和/ 或鼠源IgG的分離純化。
全文摘要
一種鼠源IgG核酸適配子，其特徵在於它是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一；製備方法包括(1)用PCR製備ssDNA文庫、(2)反篩與篩選、(3)克隆及陽性克隆的序列測定；應用其特徵在於在實驗室、臨床及工業化的應用，包括用於鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純化。本發明的優越性本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，節約成本；具有比抗體更高的親和性和特異性；便於標記且可以在不同部位有選擇性的標記；重複性和穩定性好，且易於保存，即對高溫和劇烈條件不敏感；因此，SELEX技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。
文檔編號C12N15/13GK101275137SQ20071018806
公開日2008年10月1日 申請日期2007年11月23日 優先權日2006年12月15日
發明者吳淑慶, 弓景波 申請人:國家納米技術與工程研究院