檢測日本乙型腦炎病毒的rt-lamp核酸試紙條試劑盒及應用的製作方法

2023-04-27 01:26:11

檢測日本乙型腦炎病毒的rt-lamp核酸試紙條試劑盒及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應用。該試劑盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示的引物組和核酸檢測試紙條。該試劑盒的使用方法如下：配製RT-LAMP反應體系，進行恆溫反應；恆溫反應所得產物用核酸檢測試紙條檢測後直接進行判讀：陽性結果為出現兩條紅色條帶，一條位於檢測區內，另一條位於質控區內。該試劑盒操作簡單、成本低廉，反應結果易於觀察，特異性好，非常適用於出口檢疫、食品衛生以及畜牧養殖場的現場檢測，易於大範圍推廣應用。
【專利說明】檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應
用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應用。
【背景技術】
[0002]流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)是由流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一種重要的蚊媒性人畜共患傳染病。JEV是引起母豬出現繁殖障礙的主要病原體之一，對豬的致死率不高，但可引起懷孕母豬流產、產死胎或木乃伊胎，也可引起公豬的睪丸急性炎症反應或不育，給養豬業的持續發展造成較大的經濟損失。因此，防制豬JE不僅可以減少養豬業的損失，而且對人類的健康發展有重要意義。
[0003]流行性乙腦病毒首先於1953年在日本從患者腦組織中分離獲得，因此稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),所致疾病在日本稱日本乙型腦炎(JBE)。1950年以來，中國對該病進行了大量病原學和流行病學研究，為了與甲型腦炎相區別，定名為流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是中國夏秋季流行的主要傳染病之一，除新疆、西藏、青海外，全國各地均有病例發生，年發病人數2.5萬，病死率10%，大約15%的患者留有不同程度的後遺症。
[0004]日本腦炎病毒( Japanese Encephalitis virus)屬於黃病毒科甲病毒屬。該病毒呈球形，直徑約40nm，二十面體立體對稱的核衣殼，內有衣殼蛋白(C)與核酸構成的核心，外披以含脂質的囊膜，表面有囊膜糖蛋白(E)刺突，即病毒血凝素，囊膜內尚有內膜蛋白(M)，參與病毒的裝配。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長llkb，自5'至3'端依次編碼結構蛋白C、M、E以及非結構蛋白NSl—NS5，病毒RNA在細胞漿內直接起mRNA作用，翻譯出結構蛋白和非結構蛋白，在胞漿粗面內質網裝配成熟，出芽釋放。
[0005]目前，有許多技術可用於JEV的檢測，如免疫螢光法、免疫組織化學技術、直接電鏡、免疫電鏡、酶聯免疫吸附試驗、阻斷ELISA、鏈黴親和素-生物素技術、原位雜交法、競爭阻斷ELISA。然而這些檢測方法不但需要昂貴的設備儀器花費較長的時間，而且特異性和敏感性較低。因此，在實驗室建立一種快速，敏感，特異的檢測JEV的診斷方法是十分必要的。
[0006]環介導等溫核酸擴增技術(LAMP):LAMP是由日本的Notomi (Notomi et al, 2000)在2000年發明的一種全新的核酸擴增方法。該技術依賴於能夠識別靶序列上6個特異區域的4條引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下(60°C -65°C )可高效、快速、特異的擴增靶序列。LAMP法不僅能擴增DNA，也能擴增RNA，只需在反應體系中加入一定量的反轉錄酶就能實現擴增，整個反應時間非常短，此技術設備要求低，一個恆溫箱或水浴鍋就能完全反應。近年來，國內外已將該技術廣泛應用於病原體檢測。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplificationmethod for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol, 2004May ；42(5):1956-61)於 2004 年根據 LAMP 原理設計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-Cov，結果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai 等人(Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newlydeveloped influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.Virol Methods.2007May, 141 (2): 173-80.)於 2007 年建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。由於LAMP的擴增產物是白色焦磷酸鎂沉澱，用肉眼難以觀察，日本已研製出專門對LAMP產物進行實時監控的濁度儀。但是濁度儀的使用不但增加了費用，而且不方便攜帶；有學者利用往反應後的體系中加入SYBR Green I染料的方法來檢測擴增產物，但是這樣觀察又必需開蓋處理，LAMP擴增的高效性及高敏感性使得產物中含有大量目的片段，開蓋添加染料極其容易汙染環境。後來，有研究對LAMP方法作進一步改進，在原有LAMP反應試劑的基礎上添加鈣黃綠素和氯化錳後，可以衍生出另外一種更為簡便的可視化LAMP，一步即可完成LAMP擴增及結果判定，LAMP產物無需開蓋分析即可用肉眼觀察結果。但這種方法因存在假陽性率過高、弱陽性結果的判別不夠準確、且鈣黃綠素與錳離子的濃度配比體系不穩定等缺點而使該方法的應用推廣受到限制。

【發明內容】

[0007]本發明首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作方法簡單等優點。
[0008]本發明的另一目的在於提供實現上述檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應用。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，包含如下引物組和核酸檢測試紙條:
[0010]所述的引物組的核苷酸序列如下所示:
[0011]F3:5，-CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3，；
[0012]B3:5』 -CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3』 ；
[0013]FIP:5』 -Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3』 ；
[0014]BIP:5』 -AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3』 ；
[0015]LoopF:5，-FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3，；
[0016]LoopB:5，-GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3，；
[0017]所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條；
[0018]所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒優選包含上述引物組和全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置；
[0019]所述的全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置為杭州優思達生物技術有限公司產品；該檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內得到；
[0020]所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，還包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反應緩衝液、鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、甜菜鹼(Betaine)溶液和AMV逆轉錄酶；[0021]所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒更優選為包含濃度為5υ/μ L的AMV逆轉錄酶、10倍反應緩衝液(10XThermoPol Reaction Buffer)、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜鹼溶液、濃度為lOOmmol/L的MgSO4溶液、濃度為10 μ mo I/L的引物FIP、濃度為10 μ mo I/L的引物BIP、濃度為10 μ mo I/L的引物F3、濃度為10 μ mo I/L的引物B3、濃度為10 μ mo I/L的引物LoopF和濃度為10 μ mo I/L的引物LoopB ；
[0022]所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應用，包含以下步驟:
[0023](I)配製RT-LAMP反應體系，按終濃度計算，AMV逆轉錄酶為105U/L、10倍反應緩衝液(10 X ThermoPol Reaction Buffer)為 I 倍(I X )、鏈置換 DNA 聚合酶為 0.32U/L、dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜喊為O~2mol/L、MgS04為O~3mmol/L、FIP引物為1.6ymol/L、BIP 引物為 1.6ymol/L、F3 引物為 0.2ymol/L、B3 引物為 0.2 μ mol/L、LoopF弓丨物為0.8 μ mol/L、LoopB弓丨物為0.8 μ mol/L，待測樣品RNA為12ng/ μ L ;恆溫反應；
[0024](2)反應:將步驟(1)恆溫反應後的產物用核酸檢測試紙條檢測，IOmin觀察結果；
[0025](3)結果判讀:直接肉眼判讀，
[0026]①陰性(一):僅在質控區(C)出現一條紅色條帶，在檢測區(T)內無紅色條帶出現，證明所檢測的樣本沒有日本乙型腦炎病毒感染；
[0027]②陽性(+):出現兩條紅色條帶，一條位於檢測區(T)內，另一條位於質控區(C)內，證明所檢測的樣本為日本乙型腦炎病毒感染；
[0028]③無效:質控區(C)和檢測區(T)內均無紅色條帶出現，表明核酸試紙條失效。
`[0029]步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度優選為0.4mmol/L ；
[0030]步驟(1)中所述的甜菜鹼的終濃度優選為1.5mol/L ；
[0031 ] 步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度優選為2mmol/L ；
[0032]步驟(2)中所述的恆溫反應的時間優選為50~70min ；
[0033]步驟(2)中所述的恆溫反應的條件優選為61°C反應60min。
[0034]與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果:
[0035](I) RT-LAMP核酸試紙條檢測方法成本低廉,利用Bst DNA polymerase在61 °C實現等溫擴增，不需要複雜且昂貴的PCR儀，因此，本發明提供的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒使用成本低。
[0036](2)本發明所提供的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒反應迅速，利用AMV反轉錄酶實現一步法RT-LAMP，無需增加42°C Ih的反轉錄過程，可以在60min內完成反應，最快可以在40min內完成。
[0037](3)本發明提供的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒得到的反應結果直觀準確，無需進行複雜操作。雖然LAMP在DNA擴增過程中產生大量焦磷酸鎂沉澱使反應液呈現渾濁，在反應結束後無需瓊脂糖凝膠電泳即可直接肉眼觀察反應管中渾濁來判斷陽性與否，但弱陽性結果仍給判別帶來較大困難。如果在引物5』端進行特異性生物標記，然後再用全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置對產物進行檢測，既可以準確對結果進行直觀、快速的判讀，又可以防止汙染。
[0038](4)本發明提供的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒特異性好，對豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等都呈陰性反應；靈敏度高，最低可以檢測到30pg的RNA模板，與RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳和RT-PCR方法檢測一致，比鈣黃綠素可視化RT-LAMP方法的靈敏度高10倍(即檢測限低10倍)。即使是幾個病毒粒子，也能被快速準確的檢測出來。
[0039](5)本發明所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒可快速、靈敏地檢測日本乙型腦炎病毒，無需昂貴儀器，只需一個恆溫水浴鍋即可完成反應。該試劑盒操作簡單、成本低廉，反應結果易於觀察，特異性好，非常適用於出口檢疫、食品衛生以及畜牧養殖場的現場檢測，易於大範圍推廣應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為RT-LAMP反應檢測體系優化結果圖，其中:
[0041]A為dNTP不同終濃度與電泳亮度關係圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~6依次對應dNTP的終濃度分別為0.1mM.0.2mM,0.3mM,0.4mM,0.5mM和(λ 6mM時得到的反應
產物；
[0042]B為甜菜鹼不同終濃度與電泳亮度關係圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~5依次對應甜菜鹼的終濃度分別為0M、0.5M、1.0M、1.5M和2.0M時得到的反應產物；
[0043]C為MgSO4F同終濃度與電泳亮度關係圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~5依次對應MgSO4的終濃度分別為0mM、lmM、2mM、3mM和4mM時得到的反應產物；
[0044]D為內外引物不同濃度比例與電泳亮度關係圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~6次對應內引物(BIP+FIP)和外引物(B3+F3)按終濃度比為2:1,4:1,6:1,8:1,10:1和12:1時得到的反應產物，外引物終濃度為0.2μπι01/1 ；
[0045]E為環引物與外引物不同濃度比例與電泳亮度關係圖，泳道M為DNA MarkerDL2000，泳道I~6依次對應環引物(LoopF+LoopB)和外引物(B3+F3)按終濃度比為0:1、1:1、2:1、4:1、6:1和8:1的反應產物，外引物終濃度為0.2ymol/L。
[0046]圖2為RT-LAMP反應檢測條件優化結果圖，其中:
[0047]A為不同溫度下RT-LAMP反應的電泳亮度關係圖，泳道M為DNA Marker DL2000,泳道I~8依次對應反應溫度為59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、64°C、65°C和66°C的產物；
[0048]B為不同反應時間下RT-LAMP反應的電泳亮度關係圖，泳道M為DNA MarkerDL2000，泳道 I ~7 依次對應反應時間為 10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min的產物。
[0049]圖3為檢測本發明試劑盒特異性的瓊脂糖凝膠電泳結果圖，其中:
[0050]泳道M為DNA Marker DL2000 ;泳道I是以JEV GZ0409-31株基因組為模板的RT-LAMP反應產物；泳道2是以PRRSV⑶08_2株基因組為模板的RT-LAMP反應產物；泳道3是以布魯氏菌基因組為模板的RT-LAMP反應產物；泳道4是以PCV-2基因組為模板的RT-LAMP反應產物；泳道5是以PRV基因組為模板的RT-LAMP反應產物；泳道6是以CSFVGXW-07株基因組為模板的LAMP反應產物。
[0051]圖4為RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測結果圖；其中，
[0052]A為紫外條件下鈣黃綠素法對本發明提供的RT-LAMP產物檢測的結果圖；
[0053]B為利用本發明試劑盒得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到的結果圖；[0054]C為利用RT-PCR方法得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到的圖；
[0055]圖中均為:I的模板為JEV RNA標準品(IOng/ μ L)進行10倍稀釋；2的模板為JEVRNA標準品(IOng/ μ L)進行IO2倍稀釋；3的模板為JEV RNA標準品(IOng/ μ L)進行IO3倍稀釋；4的模板為JEV RNA標準品(IOng/ μ L)進行IO4倍稀釋；5的模板為JEV RNA標準品(IOng/ μ L)進行IO5倍稀釋；6的模板為JEV RNA標準品(IOng/ μ L)進行IO6倍稀釋；7為陰性對照。
【具體實施方式】
[0056]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0057]以下實施例中所用的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；Bst DNA聚合酶大片段購自New England公司；甜菜鹼(Betaine)和MgSO4購自Sigma公司；Trizol、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、隨機引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP (2.5mM)、瓊脂糖購自Takara公司；全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置購自杭州優思達生物技術有限公司(貨號:20120420-32)。
[0058]實施例1
[0059]一、引物設計
[0060]根據LAMP引物設計原則，針對JEV E基因的保守區域序列，根據LAMP引物的設計原則，應用在線引物設計軟體PrimerExporer4.0進行LAMP引物設計。同時應用Larsergene7.0生物軟體的PrimerSelect工具對引物進行初步篩選,保證各引物對之間產生的二聚體較少。通過初步篩選得到理論值最優的三套引物，如表1所示(此時，未進行Biotin和FITC標記)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，合成後的引物用滅菌三蒸水稀釋成IOpmol/μ L溶液，_20°C避光保存。對這三套引物分別進行反應溫度優化後，在各自最優反應溫度下進行反應時間的優化，並對三套引物的反應時間優化結果進行比較，反應體系如表2所示，引物使用各套引物中相對應的引物。第一套引物的最優反應溫度為61°C，反應60min產物量即可達到最高。第二套引物的最優反應溫度為61°C，反應時間為80min才有產物形成。第三套引物的最優反應溫度為62°C，反應為80min才有產物形成。通過篩選，得到反應時間最短的第一套引物(如表1所示)，包括I對外部引物(F3和B3)、I對內部引物(FIP和BIP)和I對環引物(LoopF和LoopB)。FIP由Flc (Fl的互補序列)和F2序列組成；BIP由Blc和B2 (B2c的互補序列)組成。由上海生工生物工程技術服務有限公司分別對第一套引物中的FIP引物和LoopF引物的5』端進行Biotin (生物素)標記，再分別對BIP引物和LoopB引物的5』端進行FITC (異硫氰酸螢光素)標記。對FIP和BIP引物標記組以及LoopF和LoopB引物標記組分別進行RT-LAMP的空白樣品試驗，產物用核酸試紙條進行檢測。結果發現LoopF和LoopB引物標記組的空白樣品核酸試紙條檢測呈陽性，FIP和BIP引物標的空白樣品核酸試紙條檢測呈陽性，所以再嘗試選用FIP引物的5』端進行Biotin (生物素)標記，LoopF引物5』端進行FITC (異硫氰酸螢光素)標記，結果顯示此標記組的空白樣品核酸試紙條檢測呈陰性，故選擇此標記方式為最佳標記方式(如表1所示)。[0061]表1
【權利要求】
1.一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特徵在於包含如下引物組和核酸檢測試紙條: 所述的引物組的核苷酸序列如下所示:
F3:5， -CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3，；
B3:5 』 -CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3，；
FIP:5』 -Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3』 ；
BIP:5』 -AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3』 ；
LoopF:5』 -FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3』 ；
LoopB:5』 -GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3』。
2.根據權利要求1所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特徵在於:所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條。
3.根據權利要求2所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特徵在於:包含全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置和權利要求1所述的引物組；全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內得到。
4.根據權利要求1所 述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特徵在於:還包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反應緩衝液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜鹼溶液和AMV逆轉錄酶。
5.根據權利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特徵在於:包含濃度為5υ/μ L的AMV逆轉錄酶、10倍反應緩衝液、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜鹼溶液、濃度為IOOmmoI/L的MgSO4溶液、濃度為10ymol/L的引物FIP、濃度為10ymol/L的引物BIP、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物F3、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物B3、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物LoopF和濃度為10 μ mol/L的引物LoopB。
6.權利要求1~5任一項所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應用，其特徵在於包含以下步驟: (1)配製RT-LAMP反應體系，按終濃度計算，AMV逆轉錄酶為105U/L、10倍反應緩衝液為I倍、鏈置換DNA聚合酶為0.32U/L、dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜鹼為O~2mol/L、MgS04 為 O ~3mmol/L、FIP 引物為 1.6 μ mol/L、BIP 引物為 1.6ymol/L、F3 引物為0.2 μ mol/L、B3 引物為 0.2 μ mol/L> LoopF 引物為 0.8 μ mol/L> LoopB 引物為 0.8 μ mol/L,待測樣品RNA為12ng/ u L ;恆溫反應； (2)反應:將步驟(1)恆溫反應後的產物用核酸檢測試紙條檢測，IOmin觀察結果； (3)結果判讀:直接肉眼判讀； ①陰性:僅在質控區出現一條紅色條帶，在檢測區內無紅色條帶出現，證明所檢測的樣本沒有日本乙型腦炎病毒感染； ②陽性:出現兩條紅色條帶，一條位於檢測區內，另一條位於質控區內，證明所檢測的樣本為日本乙型腦炎病毒感染； ③無效:質控區和檢測區內均無紅色條帶出現，表明核酸試紙條失效。
7.根據權利要求6所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應用，其特徵在於: 步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度為0.4mmol/L ； 步驟(1)中所述的甜菜鹼的終濃度為1.5mol/L ； 步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度為2mmol/L ； 步驟(2)中所述的恆溫反應的時間為50~70min。
8.根據權利要求6所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應用，其特徵在於: 步驟(2)中 所述的恆溫反應的條件為61°C反應60min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695561SQ201310628630
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】陳金頂, 毛晶丹, 鄧潔汝, 勾紅潮, 裴晶晶, 姚俊庸, 葉佐東 申請人:華南農業大學