通過結晶選擇性分離肽和蛋白質的方法

2023-04-26 07:20:11

專利名稱：通過結晶選擇性分離肽和蛋白質的方法
通過結晶選擇性分離肽和蛋白質的方法本發明涉及用於結晶肽和蛋白質的方法。用於沉積(Abscheidimg)和分離肽或蛋白質的方法在例如從細菌細胞培養或動 物細胞培養的身體組織中分離肽和蛋白質中具有重要的作用。在蛋白質的臨床使用領域 中，僅有幾種工業方法(例如用於溶菌酶、胰島素、Trasylof)，其中作為分批法進行沉積並 通過離心或過濾進行隨後蛋白質的分離。對於許多應用能夠顯示出在其中在單個攪拌反應器中進行沉澱劑的添加和/或 溫度的改變以沉積肽/蛋白質以及其本身的沉積和顆粒生長的常規間歇式反應器對於沉 積肽和蛋白質不是優選的。原因是由於混合不充分而導致的不均勻性。由於混合不充分導 致溶液的過飽和導致產品品質的降低。另一方面，對強化混合有限制，因為混合太劇烈能夠 導致在沉積的蛋白質/肽上的機械應力過高。可能破壞蛋白質/肽。用均勻的粒度和純顆粒提高了可分離性和產率。具有均勻粒度分布的小顆粒特別 對於製備藥物是必需的。出於上述原因，在間歇式反應器中，通過使僅一種蛋白質/肽選擇性分離而將各 種蛋白質/肽彼此分離也是困難的。因此，目的是提供用於沉積和/或分離肽和蛋白質的方法，其能夠對多種應用設 定受控條件以得到高產率、高純度和具有儘可能窄分布的特定粒度。令人驚奇地發現能通過受控結晶而沉積蛋白質/肽實現了該目的，其中該肽/蛋 白質溶液與結晶劑的混合和/或在通過冷卻/溫熱進行結晶時任選地冷卻/溫熱和實際結 晶在空間上彼此分隔開。因此，本發明提供了用於從溶液中沉積和/或選擇性分離肽/蛋白質的方法，其至 少包括以下步驟
a)將蛋白質/肽溶液與結晶劑混合，
b)任選地冷卻或溫熱，
c)使蛋白質/肽結晶，
其中a) c)在空間上彼此分隔開地進行。下面，術語「肽」也將用於同義地表示蛋白質。該術語「肽」將進一步理解為表示 取代和未取代的肽和/或蛋白質，其中可能的取代基能夠是例如糖苷、核酸、烷基、芳基及 其混合物。該取代基能夠出現在該肽的主鏈上或該側基上。「混合」理解為表示用於使得待混合相的局部存在的組分之間的濃度或溫度梯度 平衡化的工藝。目的是實現新材料的非常高均勻性。當來自該混合物的隨機樣本以特定精 度反映出初始材料(待混合材料)之比時實現了該目的。「混合」在宏觀水平上通過對流發 生且在分子水平上作為擴散的結果發生。該混合工藝以三個子步驟發生，其連續並同時進 行。在宏觀混合的第一子步驟中，通過對流傳送在整個混合機中分布由其濃度表徵的子體 積。在此情況下，局部濃度波動和該子體積的廣度基本上保持不變。僅發生由於粘滯摩擦 造成的形變。在宏觀混合的第二子步驟中，根據該流體的粘度通過分子或湍流動量交換降 低該子體積的尺寸。由均勻濃度表徵的子體積的尺寸降低到閾值。該值表徵從宏觀混合到微觀混合的轉變。在該閾值尺寸之下，該體積單元不再能被紊流波動所驅散。進一步的濃度平衡是 僅由分子擴散造成的。宏觀混合程序和微觀混合程序各自分配時間常數。從文獻中能夠 得到關於微觀混合和宏觀混合的更特別細節，例如K. Kling, Visualisieren des Mikro-und Makromischens mit Hilfe zweier fluoreszierender und chemisch reagierender Farbstoffe (藉助於兩種螢光和化學活性染料的微觀混合和宏觀混合的可視化)、2004年為 了獲得由漢諾瓦大學的機械工程專業授予的工學博士學位的學位論文。術語「在空間上分隔開」表示步驟a) C)是在不同容器(其通過例如管彼此連接) 中進行的。然而，術語「在空間上分隔開」也應當理解為表示步驟a) c)是在容器的不同 區域/區段中(例如在管狀反應器的不同部分中)進行的。術語「結晶劑」應當理解為表示造成或促進肽以晶體的形式從溶液中(例如從水溶 液中)的沉積出來的任何化合物或化合物的混合物。在本發明的優選實施方案中，該結晶劑 包括選自以下組的至少一種化合物肽、蛋白質、醇、鹽溶液、酸、PH緩衝液、酚、非離子聚合 物、離子聚電解質。「結晶」與沉澱(Rillimg)不同。結晶理解為表示其中肽在受控條件下成核(即形 成以受控方式形成晶體)的工藝。結晶的結果是具有特定形態的晶體。進一步地，結晶肽顯 示出比沉澱肽更窄的粒度分布。結晶通常是比沉澱更慢的工藝。沉澱(Rillimg)理解為表示其中通過添加沉澱劑和/或作為溫度改變的結果從溶 液中以快速工藝沉澱肽的工藝。沉澱的結果是下面稱作沉澱物的沉積物。沉澱物的特點在 於寬的粒度分布。顆粒的大部分是無定形的和/或多晶型的(不均勻晶體)。該沉澱物包含 引入溶劑和沉澱劑，並因此與結晶的結果相比更不純。該沉澱物任選的是凝膠狀的且難於 過濾。儘管通過添加過量的沉澱劑實現沉澱是簡單的，但結晶需要其中晶體能夠形成並生 長的受控條件。結晶在技術上比沉澱更複雜。結晶和沉澱在下文中包括在術語沉積之下。依照本發明的方法的步驟a)是在混合元件中進行的。在依照本發明的方法的優 選實施方案中，步驟a)是在具有至少兩個入口的噴射混合器中進行的，其中一個入口用於 引入該肽溶液，第二入口用於引入沉澱劑。出口位於該混合元件的末端。混合腔和孔板在 入口和出口之間。這種結構能夠非常好地混合該料流，甚至在非常小的通過量比Q2Ai1的情 況下也行，其中Cl1和q2表示通過入口 1和2的料流。在依照本發明的方法的優選實施方案中，步驟a)中的宏觀混合時間tMs為 Ims彡tMs彡IOOOms ；在特別優選的實施方案中，步驟a)中的混合時間為IOms彡tMs彡100
mso在依照本發明的方法的優選實施方案中，步驟a)中的平均混合速度ν(在該混合腔 中的平均混合速度)為0.05m/s彡ν彡5 m/s。結果，步驟a)的時間保持儘可能短。在優選 實施方案中，步驟a)中的混合速度為0. 2m/s ^ ν ^ 1. 5 m/s，尤其優選0. 3m/s ^ ν ^ lm/
So在依照本發明的方法的優選實施方案中，該步驟a)中跨混合元件的壓降Δρ為 0. 05巴彡Δρ ( 20巴。該壓降優選為0. 1巴彡Δρ彡2. 5巴，尤其優選為0. 2巴彡Δρ彡1 巴。Cl1 (用於肽溶液的入口 1的直徑)與Ds (該混合腔的寬度)之比優選為0. 1彡Cl1/Ds ( 0. 4，尤其優選為0. 2 ( Cl1ZDs ( 0. 3。d2 (用於沉澱劑的入口 2的直徑)與Ds (該混合 腔的寬度)之比優選為0. 05 ( d2/Ds ( 0. 3，尤其優選為0. 08 ( d2/Ds < 0. 13。該混合腔的尺寸(Ds)經選擇使得佔主導地位的是湍流狀態。根據流速Ql/q2優選 如此選擇直徑比屯/屯使得該碰撞料流的動量幾乎相同。在其中通過冷卻或溫熱誘導或輔助結晶的依照本發明的方法的優選實施方案中， 在步驟b)中使用在線熱交換器(Inline-Wkmetauscher)以冷卻或溫熱。優選地，使用螺 旋管式熱交換器，因為其提供非常好的傳熱性且易於清洗。在依照本發明的方法的優選實施方案中，在步驟C)期間連續攪拌該混合物。其優 選使用至少一個葉輪用於攪拌，其僅對顆粒造成小的機械應力。優選使用具有大直徑的葉 輪，其中該葉片優選徑向設置使得主要得到徑向流。優選使用葉片葉輪，其中將該葉片固定 到共用軸上，具有各種徑向定位，且表現出沒有或者僅低的垂直傾斜度。該葉片的數量ζ優 選為3 < ζ < 9，尤其優選為4 < ζ < 6。該攪拌速度優選接近形成的晶體正好懸浮的值。在依照本發明的方法的優選實施方案中，該攪拌容器裝備有折流板，例如具有四 個寬度為0. ID的折流板，其中D是在其中進行步驟c)的容器或容器區段的直徑。也可以 將該攪拌器偏心設置，在這種情況中偏心率e/D優選為0 < e/D < 0. 15，其中e是攪拌器 外邊緣與其中進行步驟c)的容器或容器區段的壁之間的間距。對於多種應用，該攪拌器的 混合質量有利地受到該實施方案的影響。使用偏心攪拌器尤其提高了該結晶容器的可清潔 性。在依照本發明的方法的優選實施方案中，該攪拌葉片直徑d與在其中進行步驟C) 的該容器或容器區段的直徑D之比為0.40.7。因此實現了小顆粒應力。該比值 優選在0. 45 ( d/D ( 0. 65的範圍，尤其優選在0. 5 ^ d/D ^ 0. 6的範圍。該攪拌葉片高度h與攪拌葉片直徑d之比在0. 15 ( h/d ( 1. 3的範圍。在使用具有多個葉輪的葉輪系統時，所有葉輪的h/d比在0. 25彡h/d彡0. 25的 範圍。尤其優選所有葉輪具有相同的尺寸。在依照本發明的方法的優選實施方案中，在其中進行步驟a)的容器或容器區段的 容積與在其中進行步驟c)的容器或容器區段的容積之比大於或等於0. 01且小於或等於 0. 1。令人驚奇地發現對於多種應用，使用與結晶容積相比小的混合容積能夠是有利的，因 為通過這種方式步驟a)中的沉澱劑能夠以較大的過量存在而不會發生不受控制的沉積。在依照本發明的方法的優選實施方案中，在其中進行步驟a)的容器或容器區段的 容積與在其中進行步驟b)的容器或容器區段的容積之比大於或等於0. 02且小於或等於 0. 08。由於步驟a)和b)，步驟C)以受控方式進行。通過進行步驟a)和b)，步驟C)優 選是自動進行的，即優選不需要外部激勵以引發結晶。優選僅攪拌以維持均勻狀態，等待用 於能使晶體形成和生長的時間。依照本發明通過結晶進行肽從溶液中的沉積和/或分離。在依照本發明的方法的 優選實施方案中，通過沿該肽的溶解度曲線逐步添加結晶劑進行肽從溶液中的沉積和/或 分離。結晶劑總是逐步以使得該溶液對該待沉積的肽過飽和且因此該肽結晶出來的量添加 的。優選地，在各步驟中僅添加略微過量的結晶劑，以防止肽不受控制地沉澱。依照本發明， 肽溶液和結晶劑的混合在空間上與實際結晶是分隔開的。
在依照本發明的方法的另一實施方案中，通過逐步溫熱或冷卻(即通過逐步升高 或降低溫度，取決於是溫熱還是冷卻對該結晶起到促進/誘發作用)進行肽從溶液中的沉積 和/或分離。該溫度改變是沿該肽的溶解度曲線進行的該溫度逐步改變到使得該溶液對 待去除的肽過飽和因此該肽結晶出來的程度。優選地，以小的步長改變溫度以防止該肽不 受控制地沉澱。依照本發明，該溫度改變在空間上與實際結晶是分隔開的。圖2、3和7中給出了溶解度曲線的實例。肽的溶解度曲線能夠是經驗確定地(例 如參見實施例1)。通過例如蒸發特定量的溶液並稱重剩餘的肽以重量分析、光譜分析、或通 過本領域技術人員已知的其它常用的用於測定濃度的方法進行溶解肽的濃縮。在優選實施方案中，因此，依照本發明的方法在步驟a)和C)或a)、b)和C)之後 包括額外的步驟d)
d)在通過冷卻結晶或溫熱結晶時，將來自步驟c)的結晶懸浮液的一部分溶液添加到步 驟a)的混合物中或步驟b)的混合物中。步驟d)能夠連續或不連續地進行。通過步驟d)的另外引入，該結晶能夠連續或 不連續地進行，並對於一系列應用，提高了該結晶狀態，導致產物質量的提高。步驟d)優選是在其中將各種混合物/溶液匯聚到一起的混合腔中進行的。在優選實施方案中，依照本發明的方法在步驟a)和C)或a)、b)和C)之後包括步 驟&1)和 El2)
混合額外的結晶劑， a2)任選地重複步驟a》和 )。步驟ai)優選是在其中將各種混合物/溶液匯聚到一起的混合腔中進行的。下面通過示例性的方式藉助於附圖對本發明進行詳細闡述，然而並不將本發明限 定於這些附圖。

圖1顯示了在優選實施方案中用於進行依照本發明的方法的裝置的示意圖。該裝 置包括用作結晶劑的儲存器的容器10、用作肽溶液的儲存器的容器20、混合元件30、熱交 換器40和用於結晶的容器50。該容器10和20具有攪拌器。容器10通過第一泵15與該 混合元件30連接。容器20也通過第二泵25與該混合元件30連接。依照本發明的方法的 步驟a)是在混合元件30中進行的。在通過冷卻結晶或加熱結晶時，通過熱交換器40改 變該混合物的溫度，並將該混合物引入用於結晶的容器50中。在優選實施方案中，通過其 將該混合物引入該容器50中的管具有漏鬥狀設計，如圖1中圖示。該漏鬥的開度角α在 2° ^ α 的範圍。葉片式攪拌器偏心設置在該容器50中。圖2示意性地顯示了肽的溶解度曲線和兩種沉積變型方案的實施方式(即反饋模 式B和批次模式Α)。在該圖中，將肽在溶液中的濃度C*相對於已經添加到溶液中的結晶劑的量aK繪 制。隨著結晶劑的量aK的提高，溶解的肽的濃度c*降低，因為肽的一部分量已經由該結晶 劑造成結晶並因此從溶液中沉積出來。在該圖中，描繪了兩種可能的沉積工藝。在工藝A 的情況中，一次添加大量的結晶劑。結晶劑的添加量在圖2的圖中的溶解度曲線的右邊，因 此肽應當沉澱出來。通過突然添加結晶劑，該肽溶液對肽過飽和。該肽快速沉積。通過工藝B，受控結晶是可行的。在工藝B的情況中，添加與工藝A的情況相同量 的結晶劑，但以多個更少的劑量添加，它們在時間上間隔開先後添加。優選沿該溶解度曲線C*移動，即總是添加僅略微過量的結晶劑。在結晶劑的首次添加中，該肽溶液僅變得略微過 飽和。肽沉積且溶解肽的濃度降低(Ac)直到再次位於溶解度曲線處的濃度。再次添加結 晶劑，該溶液對肽過飽和，肽沉積(Ac)。該溶液的肽濃度下降直到位於該溶解度曲線處的 濃度，依此類推。通過以多個小劑量逐步添加結晶劑，產生受控結晶的狀態。在各步驟中僅 進行溶液的少量過飽和Ac/c*。該肽具有結晶和晶體生長的時間。該沉積的肽具有特定的 形式和組成且由具有窄粒度分布的晶體構成。該結晶過程優選是由攪拌和/或溫度控制輔 助的。代替添加結晶劑，還能夠通過受控溫熱或冷卻進行該肽沉積。在這種情況中，該χ軸 將不再表示結晶劑的添加量aK而是表示溫度T的升高或降低。反饋模式B是依照本發明 的方法的優選實施方案，其中肽溶液/懸浮液與結晶劑的混合以及其結晶本身依照本發明 是在分開的容器或容器區段中發生的。其中逐步進行該溶液的僅略微過飽和Ac/c*的受控工藝B與工藝A相比在多種 應用中具有以下優點
-防止不受控制地成核，
-通過比值Ac/c*的變化，能夠影響顆粒生長與成核速率之比並由此改善結晶結果， -產生具有窄粒度分布的較大晶體， -肽能夠選擇性地從肽混合物中結晶(例如參見圖3)， -水的引入更少且在沉積產物中雜質夾雜更少， -更低的形成多晶型沉積物的趨勢， -避免沉澱物，
-更純的產物，因為可避免共沉澱， -提高再現性。圖3在一副圖中顯示了兩種肽Pl和P2的溶解度曲線。在該圖中，將肽Pl和P2在 溶液中的濃度c*相對於已經添加的結晶劑的量aK繪製。圖3示意性地顯示了通過受控添 加結晶劑和受控結晶肽Pl能夠選擇性地從該溶液中沉積，而肽P2完全保持在溶液中。如 果將圖3中逐步添加的結晶劑的量一次性添加到溶液中，那麼將會將肽Pl和P2 —起沉積 出，分離將會不可能。代替添加結晶劑，通過受控溫熱或冷卻也能夠選擇性沉積肽。在這種 情況中，該χ軸將不再表示結晶劑的添加量aK而是表示溫度T的升高或降低。在至少一種另外的肽存在下肽的所述逐步選擇性沉積是依照本發明的方法的優 選實施方案，其中肽溶液/懸浮液與結晶劑的混合以及其結晶本身依照本發明是在分開的 容器或容器區段中發生的。在圖4中，圖示了依照本發明的方法的步驟a)的優選混合元件。該圖顯示了噴射 混合器100的橫截面。該混合器包括兩個用於肽溶液(料流Q1)和結晶劑(料流q2)的入口 110、120。該入口的直徑為屯和屯。該噴射混合器優選設計為具有直徑Ds的管式。該屯/ Ds比優選在0. 1 ( VDs彡0. 4的範圍，尤其優選在0. 2 ( VDs彡0. 3的範圍。該d2/Ds比 優選在0. 05 ^ d2/Ds ^ 0. 3的範圍，尤其優選在0. 08 ^ d2/Ds彡0. 13的範圍。混合腔150在該噴射混合器內，用孔板(Blende) 160將其分隔成混合區130和出 口區140。該混合區的容積優選約為該混合腔容積的74，因此該出口區的容積為該混合腔 容積的74。如圖中箭頭130所示，在該混合區中佔主導地位的是具有由碰撞料流Ql和七造 成的高湍流度的宏觀對流。與此相比，在出口區中的流動為從遠更小的湍流度到根本沒有湍流度。將肽溶液和結晶劑的混合物通過噴射混合器的出口添加到熱交換器和/或用於結 晶的容器/容器區段中(料流q)。圖5顯示了用於實施依照本發明的方法的裝置的優選實施方案。該裝置包括用於 接收結晶劑的容器10、用於接收肽溶液的容器20、通過泵15與容器10連接且通過泵25與 容器20連接的混合元件30、與該混合元件30連接的用於結晶的容器50。在優選實施方案 中，容器50與容器20和混合元件30之間的連接通過連接件70連接。該連接70能夠具有 例如管狀設計，允許(連續)從該容器50中取出結晶懸浮液並將該懸浮液添加到依照本發明 的方法的步驟a)中，其是在該混合元件30中進行的。連接件70使得此處稱作反饋方式1的操作形式為可行的在第一次將來自容器 10的結晶劑與來自容器20的肽溶液在該混合元件30中混合之後，將容器50中的混合物 保持特定的時間間隔用於該第一晶體的熟化。在第二和任選的另外步驟中，將結晶劑與來 自容器50的懸浮液或上清溶液混合，將其通過管線70與結晶劑一起添加到該混合元件中。 作為結果，可以有針對性地逐步並以特定的間隔計量添加結晶劑。因此該結晶劑的量並不 一次性添加，而是逐步添加。在該混合元件中，進行來自容器50的懸浮液或上清溶液與來 自容器10的結晶劑的劇烈混合。依照反饋方式1的所述方法是依照本發明的方法的優選 實施方案。在用於實施依照本發明的方法的裝置的另一實施方案中，將熱交換器40和容器 50之間的連接另外通過連接件80與容器20相連接。該連接件80能夠具有管式設計，允許 將來自該混合元件的混合物(連續)取出到該容器20中。連接件80使得此處稱作反饋方式2的操作形式為可行的在第一步驟中，將來自 容器10的結晶劑與來自容器20的肽溶液在該混合元件30中劇烈混合，然後將該混合物料 添加到結晶容器50中。在第二步驟中，將來自容器50的懸浮液或上清溶液通過管線70與 來自容器10的結晶劑一起添加到該混合元件30中。在劇烈混合和任選地溫熱或冷卻之後， 將該混合物通過該連接件80引入該空容器20中。在第三步驟中，進行該容器20中的內容 物與額外的結晶劑的混合和將該混合物引入容器50中。該第二和第三步驟任選地重複一 次或多次。該操作方式具有均勻並同時將結晶劑添加到溶液中的優點。該容器50的容積大於混合元件和該混合元件與容器50之間的連接件的容積總 和。在將反饋方式1中來自容器50的懸浮液或上清溶液通過該連接件70和該混合元件30 返回供給到該容器50中時，將其在容器50中混合，更特別地在具有尚未返回的懸浮液的容 器50中的入口位置。由此，反饋方式1中的反饋任選地導致容器50中的濃度波動。這些 波動能夠不利地影響該產物品質。在反饋方式2中避免了這種濃度波動。在反饋方式2中，依照本發明的用於沉積和/或分離肽的方法能夠比反饋方式1 中更窄地(enger)沿該溶解度曲線進行。依照反饋方式2的所述方法是依照本發明的方法 的尤其優選的實施方案。圖6顯示了用於執行依照本發明的方法的圖5中所示裝置的變型方案。除了已經 在圖5中呈現的元件之外，還呈現了熱交換器40和連接件90。在僅通過冷卻或溫熱進行結 晶時(在這種情況下僅通過冷卻或溫熱該肽溶液實現結晶)，能夠省去混合元件。在這種情 況中，將反饋方式1中來自容器50的肽溶液/懸浮液再次通過連接件70、連接件90和熱 交換器40返回供給到容器50。在該熱交換器中，進行該肽溶液/懸浮液的逐步冷卻或溫熱以實現受控結晶。如圖5中的描述已經解釋的那樣，該容器50的體積大於該連接件70、 90和熱交換器的容積總和，因此任選地經冷卻或溫熱的溶液/懸浮液返回供給到該容器50 中，並在此遇到尚未返回的具有不同溫度的懸浮液。在該情況中，這能夠導致溫度波動，其 負面影響產品品質。此處，反饋方式2設法解決了這一問題，其中將來自容器50的懸浮液 /溶液通過連接件70供給到該熱交換器中以調節另外的溫度，且將其從該熱交換器中通過 連接件80供給到該空容器20中。從該容器20中，然後將該溶液通過管線90供給到該熱 交換器中以再次調節到另外的溫度並然後返回到容器50中。根據需要，該工藝能夠重複一 次或多次。此處描述的方法是依照本發明的方法的優選實施方案。圖7示意性地顯示了溶菌酶水溶液的溶解度行為。將溶菌酶的濃度相對結晶劑 NaCl的濃度繪製。在4. 5的pH值和20°C的溫度，溶菌酶溶液顯示出在曲線CZ和PZ之間 的過飽和範圍。如果在上述條件下，設定位於曲線CZ和PZ之間的NaCl濃度，那麼該溶菌 酶緩慢結晶。如果NaCl的濃度提高併到達曲線PZ右邊的區域，那麼該溶菌酶以沉澱物的 形式快速沉澱出來。圖8顯示了用於實施依照本發明的方法的裝置的另一實施方案。該裝置包括用於接收結晶劑的第一容器10』、用於接收肽溶液的第二容器20』、借 助於雙葉片式攪拌器60』攪拌的用於結晶的第三容器50』。該容器20』和10』通過低剪切 泵15』、優選具有噴射混合器設計的混合元件30』和螺旋管式反應器40a、40b和40c與該 容器50』連接。這種裝置允許使肽沿該溶解度曲線逐步結晶。在第一步驟中，將來自容器 20』和10』的肽溶液和一部分結晶劑在該容器20』和容器10』之間的混合元件30』中混合。 將該混合物進入該反應器40a。在該管式反應器40a中，在非常均勻的條件下形成第一肽 附聚物。在反應器40a和40b之間的混合元件30』中，將來自反應器40a的懸浮液與來自 容器10』的額外的結晶劑混合。該混合物進入該反應器40b中。在該管式反應器40b中， 在非常均勻的條件下形成額外的肽附聚物和/或生長現有的附聚物。在反應器40b和40c 之間的混合元件30』中，將來自反應器40b的懸浮液與來自容器10』的另外的結晶劑混合。 該混合物進入該反應器40c。在該管式反應器40c中，在非常均勻的條件下形成額外的肽附 聚物和/或生長現有的附聚物。來自反應器40c的懸浮液進入該容器50』，其中在受控條件 下使結晶結束。該管式反應器40a、40b和40c也能夠起熱交換器作用，且例如吸收結晶熱或者向 溶液/懸浮液中供給熱量。所述方法是依照本發明的方法的優選實施方案。依照本發明的方法並不限定於此處所述的方法。由例如此處所述方法的組合產生 的其它變型方案也是可行的。通過依照本發明的方法，在多種應用中可實現一種或多種優點 -降低濃度波動以及在顆粒上的機械應力，
-可以有針對性設定飽和狀態並避免過飽和， -選擇性結晶且因此更好地分離包括多於一種肽的溶液中的各種肽， -具有特定性質的均勻產物且避免多晶型化合物， -可以得到具有窄粒度分布的細小晶體， -降低受損肽的部分， -縮短工藝時間，
9-更高的產率和更大量的沉積顆粒， -規模放大簡單。
實施例實施例1
該實施例描述了溶菌酶的結晶。該結晶是在依照圖5中的裝置中進行的。將具有 4. 7mol/L的濃度的NaCl水溶液作為結晶劑預先置入容器10中。溶菌酶同樣以20g/L的濃 度存在於水溶液中(容器20)。將50升容器(50)用於該結晶。將低剪切泵(例如蠕動泵=Watson Marlow)用於輸 送該溶液和懸浮液。使用依照圖4的噴射混合器，含具有直徑Cl1 = 2. 5mm和d2 = 6mm的兩 個入口。該管式混合腔具有24mm的直徑。該噴射混合器以在Re = 1500的區域中的雷諾 數湍流操作。其混合時間為65ms。該混合物的pH值為4. 5，混合溫度為20°C。該結晶容器的直徑為D = 406mm，並裝備有葉片式攪拌器，其中葉片具有h/d = 0. 5的高度與直徑比。總計，該攪拌器攜帶6個葉片，具有d/D = 0. 55的葉片直徑與該結晶 容器直徑之比。攪拌器和容器之間的相對距離為e/D = 0. 025。通過幾乎引到該容器底部的噴槍進行結晶劑和肽溶液的混合物到容器50的供 給。該噴槍具有約5°的錐形(漏鬥形狀)角。引入該容器的噴射的功率輸出小於30W/m3。在圖7中，顯示了兩種操作方式的結果。曲線PZ顯示了作為添加大量(過量)NaCl 溶液的結果的溶菌酶在該溶液中的濃度進展。曲線PZ上的圓顯示了實際測定的值。逐步 從溶液中作為沉澱物沉澱出來的該溶菌酶是多晶型的且難以過濾。曲線CZ顯示了在添加多個較少量NaCl溶液的進展。該曲線CZ上的圓顯示了依 照根據反饋方式2 (參見圖5的描述)的方法得到的實際測定值。以晶體形式逐步沉積的 溶菌酶比該沉澱物具有更高的純度，顯示出更窄的粒度分布，且更容易過濾。而且，在結晶 時純溶菌酶的產率比在沉澱時的更高。
權利要求
1.用於從溶液中沉積和/或選擇性分離肽/蛋白質的方法，至少包括以下步驟a)將蛋白質/肽溶液與結晶劑混合，b)任選地冷卻或溫熱，c)使蛋白質/肽結晶，其中步驟a) c)在空間上彼此分隔開地進行。
2.權利要求1的方法，其特徵在於步驟a)是在包括至少兩個入口和至少一個孔板的 噴射混合器中進行的，混合區在所述入口和孔板之間。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於步驟a)中的平均混合速度在0.05m/s彡ν彡5 m/s的範圍。
4.權利要求1 3中任一項的方法，其特徵在於步驟a)中的壓降在0.05巴< Δρ ^ 20 巴的範圍。
5.權利要求1 4中任一項的方法，其特徵在於步驟a)中的宏觀混合時間在 Ims ( tMs ( 1000ms 的範圍。
6.權利要求1 5中任一項的方法，其特徵在於步驟a)中的宏觀混合時間在 8ms ( tMs ( 120ms 的範圍。
7.權利要求1 6中任一項的方法，其特徵在於步驟c)是用葉片式攪拌器在連續攪 拌情況下進行的。
8.權利要求7的方法，其特徵在於該攪拌速度接近於該晶體正好懸浮的值。
9.權利要求7或8的方法，其特徵在於該攪拌器以在0< e/D < 0. 035範圍的相對偏心率設置。
10.權利要求7 9中任一項的方法，其特徵在於該葉片式攪拌器的直徑d與在其中 進行步驟c)的該容器或容器區段的直徑D之比在0. 4 < d/D ^ 0. 7的範圍。
11.權利要求1 10中任一項的方法，其特徵在於在其中進行步驟a)的容器或容器 區段的容積與在其中進行步驟c)的容器或容器區段的容積之比大於或等於0. 02且小於或 等於0. 08。
12.權利要求1 11中任一項的方法，其特徵在於在步驟a)和c)之間或a)、b)和c) 之間進行以下步驟d):d)將來自步驟c)的結晶懸浮液的一部分溶液添加到步驟a)的混合物中或步驟b)的 混合物中。
13.權利要求1 12中任一項的方法，其特徵在於在步驟a)和c)之後或a)、b)和c) 之後實施以下步驟 )和 )ai)混入額外的結晶劑，a2)任選地重複步驟a》和 )。
全文摘要
本發明涉及用於藉助於受控結晶從溶液中沉積和/或選擇性分離肽和蛋白質的方法。
文檔編號C07K1/30GK102066400SQ200980123800
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月16日 優先權日2008年6月23日
發明者哈夫科斯特 D., 亨茲勒 H-J., 考林 J. 申請人:拜爾技術服務有限責任公司