高效抑制血管生成多肽及其製備方法和應用的製作方法
2023-04-26 05:25:21
專利名稱：高效抑制血管生成多肽及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程製藥技術領域或蛋白質多肽類藥物領域。
二.
背景技術：
腫瘤血管生成抑制劑是近年來在腫瘤治療中引起重視的一類藥物，這方面的研究已經取得一些進展，可望在今後成為一類新的有希望的腫瘤治療藥物。腫瘤新生血管形成的概念是Algureza在1947年提出的，他指出增長的腫瘤的一個重要特徵是能夠從宿主引發新的毛細血管內皮細胞形成。1971年，Folkman提出假設，認為腫瘤生長和轉移依賴於新生血管生成，並認為實體瘤早期可分泌腫瘤血管生成因子，刺激宿主毛細血管增生。新生血管不僅可以提供腫瘤所需要的營養和氧氣，排除代謝產物，而且是遠處轉移的途徑(Folkman，J.，J.Natl.CancerInst.1990；824-6)。因此，阻斷新生血管形成可能成為阻止腫瘤生長和轉移的手段，從而激發了對促血管生成分子和抗血管生成分子的廣泛研究。在這些血管生成抑制劑中，尤其以血管抑素(angiostatin)和內皮抑素(endostatin)最引人注目，兩者均已在美國進入臨床試驗，儘管這些血管抑制劑呈現出非常誘人的前景，但其缺陷也非常明顯迄今為止的血管生成藥物，如內皮抑素、血管抑素等作用靶點不明確，它們對血管的專一性和選擇性還不夠好，效果有限，導致實驗中用量很高，在小鼠動物模型實驗時，血管抑素用量達數百毫克/公斤體重，內皮抑素達到數十毫克/公斤體重，當這些血管生成抑制劑在人體內使用時，使用劑量至少要達到幾克/人的劑量。這樣大的藥物使用劑量勢必增加日後該類藥物毒副作用發生的可能性，造成該類藥物質量控制難度加大、生產規模和生產成本增大、藥物價格居高。
因此，一個好的抗血管生成藥物應該有對新生血管的標記分子具有選擇性，這樣才能達到對新生血管的導向性作用，從整體上提高藥物對血管生成的抑制作用作到只使用很低劑量的藥物，就能達到高效的抑制血管生成效果。
整合素是由α亞基和β亞基組成的跨膜蛋白異二聚體，研究表明，腫瘤細胞表面的整合素是腫瘤轉移發生的關鍵所在，它們通過連接胞內細胞骨架蛋白和細胞外基質分子的相互作用控制細胞的遷移、分化和增殖(Schoenwaelder SM等，Curr Opin Cell Biol，1999274-286)。20多種整合素中大多數都識別含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的細胞外基質配基(Dennis MS等，Proc Natl AcadSci 1990；872471-2475)，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗劑作用，能減少細胞表面黏附分子的表達，調節細胞內信號轉導，在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景。
三.
發明內容
目前發現，有的編碼血管生成抑制劑的小肽具有抑制血管生成和抗腫瘤效果，本研究是將抑制血管生成的小肽兩端加上不同的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，構建了一種對整合素具有結合作用和親和性的血管生成抑制劑。
本發明的目的是提供一種與整合素有親和性或結合能力的高效血管生成抑制劑，本發明的高效血管生成抑制劑可以合成。本發明還應用PCR擴增得到目的基因，克隆於原核表達載體，用基因工程手段獲得產物，所得產物與同類產品比較，具有高效、特異性抑制內皮細胞增殖和抗腫瘤效果，並且用量小，相應減少了藥物治療的副作用。
本發明的技術方案1.本發明所述血管生成抑制多肽為(1)在血管生成抑制多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端分別連接含有Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly的序列，即多肽序列Arg-Gly-Asp-Gly-Oly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp序列。
(2)在高效抑制血管生成多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端連接含有Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Oly-Asp-Cys-Phe-Cys的多肽，即序列Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
2.本發明所述血管生成抑制多肽的製備方法(1)本發明的多肽序列及其編碼此多肽序列的鹼基序列可以直接進行合成。
(2)合成含有Arg-Gly-Asp整合素結合序列肽段的血管生成抑制劑基因序列，以此序列為模板，設計上下遊引物，在引物序列的5』端和3』端加上適合克隆的酶切位點，PCR擴增，獲得RGD-ED基因。將基因克隆於載體中，篩選陽性克隆，核苷酸序列分析鑑定。
(3)RGD-ED基因與原核表達載體重組，形成表達質粒，轉化大腸桿菌，IPTG誘導表達RGD-ED，表達產物以包涵體形式存在。
(4)進行包涵體蛋白分離、溶解和復性，並進行離子交換層析分離純化RGD-ED蛋白產物，收集穿過液，凍幹。
3.本發明所述血管生成抑制多肽的活性測定方法進行內皮細胞增殖實驗和雞胚尿囊絨膜(CAM)分析、小鼠體內抗腫瘤實驗。
4.本發明與現有技術相比其有益效果為產物在體內外實驗中都能夠大幅度改善和提高現有血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長和抗腫瘤效果，副作用小，並且用量小，降低了成本，說明本發明設計的高效血管生成抑制劑科學、合理、可行有效，能夠作為腫瘤和風溼性關節炎治療藥物。
四.
圖1 HPLC純化RGD-ED分析結果圖2雞胚尿囊絨膜(CAM)分析RGD-ED抑制新生血管生成A，空白對照B，C，D分別為0.05μg，0.1μg和0.2μg給藥組圖3 RGD-ED體內抑制腫瘤效果
五.
具體實施例方式1.RGD-ED基因的克隆及其原核表達載體的構建合成編碼RGD-ED多肽序列的鹼基，作為模板；合成上遊引物和下遊引物，其中上遊引物加入了NdeI酶切位點；下遊引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位點。進行PCR擴增，擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳回收、純化後，進行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表達載體pw，PCR篩選陽性克隆，核苷酸序列分析證實序列發生了設計的突變。
合成的引物15』GGAATTCCATATG ATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3』合成的引物25』CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3』其中，引物1編碼了NdeI位點和Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的部分序列，引物2編碼XhoI位點和含有Arg-Gly-Asp序列的基因。
2.為了比較本發明所設計的血管生成抑制劑RGD-ED的實際效果，本實例中我們同時委託公司合成了不含Arg-Gly-Asp序列的多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ED)。
3.重組菌的誘導表達將表達質粒轉化大腸桿菌，重組菌經過1mMIPTG誘導表達3小時後，收穫細胞並超聲破菌，離心分離上清和沉澱，15％ SDS-PAGE電泳分析，將考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE掃描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析表達結果。
4.包涵體的分離、溶解與復性超聲破菌，離心分離，將包涵體沉澱用0.1Mtris和脫氧膽酸鈉洗滌，沉澱溶解於月桂基肌氨酸鈉(SLS)中，4℃，10000rpm離心5min，上清液4℃透析，透析液為buffer A(10mM Tris-HCl，0.1mM氧化型穀胱甘肽和1mM還原型穀胱甘肽，pH7.4)，6-8h換液一次，共換液3次，最後透析一次，透析液為buffer B(10mM Tris-HCl，pH7.4)，樣品直接進行SP-Sepharose Fast Flow(AmershamPharmacia Biotech)層析。柱床平衡洗滌均用buffer B，用0.6M NaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脫，將洗脫液混合，buffer B透析後凍幹濃縮。層析結果如圖1所示。
5.內皮細胞增殖分析培養BCE細胞和NIH 3T3細胞，方法培養液DMEM含10％滅活小牛血清(BCS)，1％抗生素及3ng/ml bFGF。細胞增殖分析方法如下PBS洗滌細胞，胰蛋白酶消化，加入培養液懸浮細胞並離心收集細胞，調整細胞濃度至25,000cells/ml。將細胞移入6孔板(0.5ml/well)，培養24h.，更換培養基為1mlDMEM，5％BCS，1％抗生素，1ng/ml bFG F，每孔加入不同劑量的樣品，進一步培養48h，胰蛋白酶消化細胞，重懸於PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式細胞儀進行分析。
結果顯示重組RGD-ED能夠特異性抑制內皮細胞-BCE細胞的增殖，而對非內皮細胞-NIH 3T3則沒有抑制作用。抑制BCE增殖的ED50大約為0.1μg/ml，而沒有Arg-Gly-Asp序列的多肽ED50大約為0.8μg/ml，內皮抑素的ED50大約為0.5μg/ml。以上實驗說明本發明所設計的高效血管生成抑制劑確實顯著提高了現有的血管生成的生物活性。
6.雞胚尿囊絨膜(CAM)分析為了檢測體內抗血管生成活性，進行CAM分析。所有實驗在超淨臺中進行無菌操作，將消毒的6天的雞胚在37℃、90％溼度下進行培養。兩天後，每個雞蛋頂端打孔，將試劑滴到滅菌的Whatman濾紙，放入CAMs上血管密集區，培養48小時後，觀察雞胚和CAMs並拍照。
如圖2所示，為了評價RGD-ED體內抗新生血管生成活性，採用了不同劑量的RGD-ED來進行CAM實驗，其中0.05μg，0.1μg和0.2μg的RGD-ED都能夠顯著抑制新生血管和血管生成，0.5μgRGD-ED能夠完全抑制血管生成並導致雞胚死亡。RGD-ED具有潛在的抑制血管生成的作用。
7.動物體內抗腫瘤實驗將培養的B16F10黑色素瘤細胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm離心5min，重懸於PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠體側皮下接種5×105細胞0.1ml。當腫瘤平均體積達到200mm3-300mm3，隨機將小鼠分組，每組7隻，其中一組接受RGD-ED治療，一組用不含Arg-Gly-Asp的ED治療，以上兩組劑量均為5mg/kg/d，對照注射PBS。治療採用在接種腫瘤對側皮下注射方法。每天用遊標卡尺測量腫瘤大小，計算腫瘤體積，採用公式腫瘤體積＝長×寬2×0.52，治療效果用給定時間內的腫瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治療組腫瘤體積，C＝對照組腫瘤體積。
如圖3所示，結果表明，在第9天時，RGD-ED的腫瘤抑制率為58％，而沒有Arg-Gly-Asp序列的多肽ED的腫瘤抑制率為28％。以上實驗說明本發明所設計的高效血管生成抑制劑能夠顯著抑制小鼠體內的腫瘤生長。
權利要求
1.一種高效抑制血管生成多肽，其特徵在於該高效抑制血管生成多肽是具有整合素、肝素親和性和結合能力的多肽，其序列為Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro。
2.根據權利要求1所描述的高效抑制血管生成多肽，其特徵在於在多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或兩端分別連接有對整合素家族具有親和性和結合能力的多肽。
3.根據權利要求2所描述的高效抑制血管生成多肽，其特徵為在血管生成抑制多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端分別連接含有Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly，即多肽序列Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp序列。
4.據權利要求3所述的高效抑制血管生成多肽，其特徵在於在多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端連接含有Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys的多肽，即序列Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
5.據權利要求1或2或3或4所述，高效抑制血管生成多肽的生產方法，其特徵在於構建含有Arg-Gly-Asp序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro基因，進行基因工程表達，分離純化重組蛋白質。
6.根據權利1或2或3或4要求所述，其特徵在於採用多肽合成方法合成含有Arg-Gly-Asp序列的Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro多肽。
7.根據權利要求1或2或3或4所述高效抑制血管生成多肽，在製備治療人類新生血管生成有關疾病，如實體瘤、類風溼性關節炎中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物工程製藥技術領域或蛋白質多肽類藥物領域，具體涉及高效血管生成抑制劑及其生產方法與應用。本發明設計了具有整合素親和性的高效血管生成抑制劑RGD－ED，該抑制劑含有血管生成抑制多肽異亮氨酸－纈氨酸－精氨酸－精氨酸－丙氨酸－天冬氨酸－精氨酸－丙氨酸－丙氨酸－纈氨酸－脯氨酸，在其一端或兩端分別連接含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的多肽。本發明的RGD－ED可以合成。本發明還通過基因工程方法在大腸桿菌中表達了其中一種RGD－ED，進行包涵體蛋白分離、溶解和復性、離子交換層析分離純化得到RGD－ED，產物在體內外實驗中都能夠顯著提高現有血管生成抑制劑抑制內皮細胞生長、抑制新生血管生成和抗腫瘤效果，能夠作為實體瘤、類風溼性關節炎治療藥物。
文檔編號C07K7/00GK1699408SQ200510040378
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者徐寒梅, 奚濤 申請人:中國藥科大學