一種伏生紫堇總鹼及其製備方法和其藥物組合物的製作方法
2023-04-26 05:14:46
專利名稱：一種伏生紫堇總鹼及其製備方法和其藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種伏生紫堇總鹼及其製備方法和其藥物組合物，以及在製備治療和預防急性腦缺血藥物中的應用。
背景技術：
罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb)pers的乾燥塊莖，為一常用的行氣活血、通絡止痛藥，中藥名夏天無。可用於中風偏癱、跌打損傷、風溼性關節炎、坐骨神經痛等諸多血液循環障礙疾病的治療。目前國內外已有夏天無片和夏天無注射液生產上市，夏天無片是由原藥材夏天無打粉與其醇提浸膏混合、制粒、壓片而成；其注射液則是由原藥材夏天無經水提醇沉工藝，按常規方法經灌裝、封口等步驟製得，但不可靜脈給藥。這些製劑，工藝粗糙，且內含物不明確，內在質量很難控制，因此不符合現代中藥製劑發展之趨勢。
1982年《江西省藥品標準》首先使用稀鹽酸以滲濾法提取，然後收集濾液並通過陽離子交換樹脂進行離子交換，用氨水的醇溶液(PH9-10)分次回流洗脫後，收集洗脫液即得到夏天無生物鹼提取物。該方法的缺點在於其中使用了對人體和環境有害的試劑，而且生物鹼的回收率較低。
中國專利02111103.0所述夏天無總生物鹼的成分為夏天無鹼、比枯枯靈鹼、藥根鹼、a-四氫掌葉防已鹼和原阿片鹼等多種生物鹼。所說的夏天無總生物鹼的純度在80％以上。但其中主要是原阿片鹼，並且其含量約佔總生物鹼的50％以上。該專利對其他組分的比例無明確說明。劇毒性成分比枯枯靈鹼的限量無明確規定，故其安全性存在質疑。提取方法稱取並清洗夏天無藥材後，加入10倍以上過量的稀鹽酸(0.1-1％)水溶液浸泡並煮沸0.5-2小時。簡單過濾後，收集藥渣並向其中加入5-10倍體積的稀鹽酸(0.05-5.5％)水溶液，繼續煮沸0.5-2小時。常規過濾後，收集濾液並將上述濾液合併。用氫氧化鈉溶液將濾液的PH值調到7，然後過大孔吸附樹脂柱(流速5ml/分)。按常規方法監測流出液生物鹼為陽性時吸附即已飽和，水洗至無色後，依次用中濃度(30-60％)和高濃度(60-90％)乙醇洗脫。監測生物鹼內容物呈陰性反應後，收集並合併洗脫液。然後將洗脫液過氧化鋁層板柱(流速5ml/分)以吸附除去雜質。減壓回收乙醇後，在酸性條件(PH1-5)下溶出所需的產物並常規過濾。然後使用氫氧化鈉溶液將洗脫物的PH值調到8-11，以析出沉澱。合併沉澱物後即得到用於本發明的夏天無總鹼。
中國專利03118261.5所述夏天無總生物鹼的成分為原阿片鹼、比枯枯靈鹼、藥根鹼、a-四氫巴馬汀和巴馬汀等多種生物鹼。所說的夏天無總生物鹼的純度在80％以上。總生物鹼組分的比例明確原阿片鹼25-65％，延胡索乙素10-25％，比枯枯靈5-10％，巴馬丁10-25％，其他生物鹼及提取物5-20％。劇毒性成分比枯枯靈鹼的限量為5-10％。提取方法以夏天無為原料，加入適量的極性溶劑滲漉提取，收集滲漉液至無生物鹼反應，合併濾液，濃縮得到濃縮液，把經上述步驟得到的濃縮液進行大孔吸附樹脂吸附層析，以鹼水洗脫除去雜質；或以樹脂吸附雜質，再以極性洗脫液洗脫夏天無總生物鹼，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮在醇溶液中結晶即得。
現代藥理學研究表明，伏生紫堇含有多種具有顯著生理活性的生物鹼，但其中一種名為比枯枯靈的生物鹼毒性較大，大鼠靜脈給藥，半數致死量為0.85mg/Kg；且含量約佔藥材中總生物鹼的15％以上。是提取分離時應去除的，製劑中含量越低，用藥則越安全。
以上幾種方法提取分離所得總生物鹼。因工藝不同，故內在組分也有很大差別，無論哪種提取方法都存在毒性成分比枯枯靈含量較高，且不能定量的缺點，因此使得夏天無總生物鹼儘管藥效顯著，但由於其存在安全性隱患，臨床應用受到限制。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，針對上述現有技術的不足，對夏天無中組份採用特殊提取工藝，將劇毒性成分比枯枯靈降低至5％以下，將幾種生物鹼的成分富集至純度在80％以上，並建立提取所述總生物鹼的製備方法，提出該總生物鹼製成可供靜脈給藥的凍乾粉針製劑的製備方法及其在製備治療和預防急性腦缺血藥物中的應用。
本專利所述伏生紫堇總鹼，由夏天無即罌粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb)pers的乾燥塊莖提取，以重量百分比計，總鹼含量80％以上，其中含有原阿片鹼(protopine)35-70％、比枯枯靈(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴馬丁(palmatine)、罌粟鹼、二氫比枯枯靈、球紫堇鹼、空褐鱗鹼等。
為有效控制伏生紫堇總鹼、原阿片鹼、比枯枯靈含量，本發明建立以下含量測定方法。
採用高效液相色譜法測定其原阿片鹼的含量色譜柱十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長290nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)測定時精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20□l，注入高效液相色譜儀，測定即得原阿片鹼的含量。
採用高效液相色譜法測定其比枯枯靈的含量儀器設備高效液相色譜儀LC-10ATvp泵、SPD-10Avp檢測器(日本島津公司)；紫外分光光度計UV-1700(日本島津公司)；2010色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究院)；超聲波清洗器CQ-10(廣州明珠電器有限公司)測定方法色譜柱十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長225nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)測定時精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20□l，注入高效液相色譜儀，測定即得比枯枯靈的含量。
採用UV法測定總生物鹼的含量儀器設備紫外分光光度計UV-1700(日本島津公司)；超聲波清洗器CQ-10(廣州明珠電器有限公司)測定時精密吸取供試品溶液適量，按標準曲線製備項下的方法依法操作，照中國藥典2000年版一部附錄VB分光光度法試驗，在415nm波長處掃描(以相應的溶液為空白)，測定最大吸收度，從相應的標準曲線上讀取總生物鹼的量。
伏生紫堇總鹼的製備方法(1)以伏生紫堇塊莖為原料，加入2-20倍的極性溶劑滲漉提取，或強制回流提取，收集提取液至無生物鹼反應，合併提取液，用鹼液調PH至6-7，濃縮至適量，得到提取濃縮液；(2)把上述步驟得到的提取濃縮液進行大孔樹脂吸附層析，以溫度40℃以上的1-8mol/l強鹼溶液洗滌，用量為柱體積的1-10倍，再50-60％的乙醇溶液洗滌去雜及劇毒性成分比枯枯靈。
(3)以極性洗脫液洗脫伏生紫堇生物鹼，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮至小體積。
(4)用鹼液調PH值至鹼性，析出沉澱，濾取沉澱，飽和食鹽水洗至中性，乾燥。
(5)沉澱用有機溶劑溶解，過濾，濾液回收溶劑至小體積，放置析晶，濾取結晶乾燥，即得伏生紫堇總鹼。
其中步驟(1)中所用極性溶劑選自1-10％的磷酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸溶液，或75-95％的乙醇或甲醇溶液；更好的極性溶劑選用2-3％的磷酸；其中步驟(2)中所用大孔吸附樹脂為D101A、DM201、DM301、D301中的一種。
其中步驟(3)中所用的用於洗脫伏生紫堇鹼的極性洗脫液酸水為0.1-10％的鹽酸、磷酸、乳酸、琥珀酸溶液或濃度為60-95％酸性乙醇或酸性甲醇溶液。
其中步驟(4)中所用鹼液是濃度為5-20％的NaOH或KOH溶液。
其中步驟(5)中所用有機溶劑是氯仿或≤C4低級脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯。
含有伏生紫堇總鹼的藥物組合物
採用本方法提取得到的伏生紫堇總鹼，填加常規藥用賦形劑，即可製成口服、注射劑型。
一種注射用伏生紫堇總鹼凍乾粉針的製備方法為1)伏生紫堇總鹼凍乾粉針處方組成伏生紫堇總鹼1～5g，加0.5～10％(重量百分比)酸溶液5～10ml(選自鹽酸、磷酸、乳酸或琥珀酸)，賦形劑20～5000g(選自甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖或氯化鈉中的一種或兩種或兩種以上)，加注射用水適量製成1000ml。
最佳配方為伏生紫堇總鹼2g，1％酸(磷酸)溶液10ml，甘露醇50g，加注射用水適量製成1000ml。
2)製備工藝取伏生紫堇總鹼提取物，用酸溶液溶解，加注射用水適量，攪拌使充分溶解，另取甘露醇加入適量注射用水中攪拌溶解後，合併兩溶液，混均用1％NaOH溶液調PH至3～5，再加適量注射用水並定容至1000ml，加入適量針用活性炭攪拌煮沸30min，微孔濾膜分級濾過，濾液定量無菌分裝於經無菌處理好的管制抗生素玻璃瓶中，真空冷凍乾燥，加塞、軋蓋即得。每瓶規格為1mg或2mg。
本發明還提出一種伏生紫堇總鹼在製備治療和預防缺血性腦血管疾病藥物中的應用。
1、注射用伏生紫堇總鹼對大鼠局灶性腦缺血的影響試驗用電凝法阻斷大鼠腦中動脈，造成局灶性腦缺血模型，靜脈給藥，觀察注射用伏生紫堇總鹼對局灶性腦缺血的治療作用。結果表明，與模型組比較，注射用伏生紫堇總鹼組大鼠梗塞灶明顯縮小，腦梗塞後動物的神經行為障礙明顯減輕，血清SOD活性明顯增強，病理學檢查表明給藥組大鼠腦水腫明顯減輕，神經組織病變明顯改善。說明注射用伏生紫堇總鹼對大鼠局灶性腦缺血有治療作用。
2、注射用伏生紫堇總鹼對大鼠全腦缺血的影響試驗用結紮雙側頸總動脈合併放血降低血壓的方法，造成大鼠全腦缺血模型，觀察注射用伏生紫堇總鹼對大鼠腦指數、腦含水量的影響。結果表明，靜脈注射該藥後，大鼠腦指數、腦含水量明顯降低，與模型組比較差異顯著(p＜0.05-0.01)。說明注射用伏生紫堇總鹼對大鼠腦缺血有保護作用。
3、注射用伏生紫堇總鹼對麻醉犬腦血流量的影響本試驗以頸內動脈血流量為主要觀測指標，觀察注射用伏生紫堇總鹼對動物腦血流量的影響。結果表明，注射用伏生紫堇總鹼可顯著增加犬腦血流量，降低腦血管阻力，對動脈血壓、心率、心電圖無明顯影響。
4、注射用伏生紫堇總鹼對小鼠急性腦缺血的影響試驗用斷送法造成小鼠急性腦缺血模型，觀察藥物的作用。試驗結果表明，靜脈給予注射用伏生紫堇總鹼後，小鼠呼吸時間明顯延長。提示該藥對急性腦缺血有保護作用。
5、注射用伏生紫堇總鹼對小鼠軟腦膜微循環的影響試驗通過注射15％高分子右旋糖酐造成大鼠軟腦膜微循環障礙，觀察注射用伏生紫堇總鹼對大鼠微循環障礙的影響。結果表明，注射用伏生紫堇總鹼靜脈注射給藥後0.4mg/kg、0.2mg/kg組在所觀察10、20、30min時間點均可明顯增加血液流速，改善血液流態，0.1mg/kg組在30min有明顯改善血液流速和流態作用，呈現出一定的量效關係。提示注射用伏生紫堇總鹼具有改善大鼠軟腦膜微循環障礙的作用。
6、注射用伏生紫堇總鹼對家兔血小板聚集的影響試驗採用Born氏比濁法，觀察注射用伏生紫堇總鹼對家兔血小板聚集的影響。結果表明連續3天給家兔耳緣靜脈注射給藥，注射用伏生紫堇總鹼明顯降低二磷酸腺苷(ADP)和膠原誘導的家兔血小板聚集率(P＜0.05～0.01)，對花生四烯酸(AA)誘導的家兔血小板聚集率有降低趨勢。提示注射用伏生紫堇總鹼具有抑制血小板聚集的作用。
7、注射用伏生紫堇總鹼對大鼠體外血栓形成及血液粘度的影響試驗觀察注射用伏生紫堇總鹼對大鼠體外血栓形成及血液粘度的影響。結果表明大鼠連續3天尾靜脈注射給藥，注射用伏生紫堇總鹼可明顯縮短血栓長度(P＜0.05～0.01)、明顯減輕血栓溼重和乾重(P＜0.01～0.001)；明顯降低切變率30S-1和5S-1下的全血粘度(P＜0.05)。提示注射用伏生紫堇總鹼具有抑制血栓形成、降低血液粘度的作用。
本發明採取1-10％酸水提取或75-95％乙醇、甲醇提取，大孔吸附樹脂吸附，40℃以上5％左右的鹼液洗脫去除比枯枯靈和雜質後，製得一純度較高的伏生紫堇總鹼。它們可有效地除去胺基酸及糖類、鞣質等雜質，特別是降低有毒成分比枯枯靈的含量，明顯提高了伏生紫堇總鹼的純度，本發明的方法製備所得的伏生紫堇總生物鹼均無胺基酸和游離糖及鞣質反應，採用UV法及HPLC法測得其含量≥80％；其薄層色譜圖均可見與對照品原原阿片鹼、延胡索乙素、巴馬丁、罌粟鹼、二氫比枯枯靈、球紫堇鹼等相應位置輪廓清晰的斑點，比枯枯靈鹼≤5％，提示本發明的伏生紫堇總鹼純度高，劇毒成分含量低，用藥更安全，應用更廣泛，且此法操作簡便，易於掌握，是有效、可行的伏生紫堇總鹼製備方法。
圖1和圖2是表明本發明(實施例1)總生物鹼有效成份存在的指紋圖，其中圖1是伏生紫堇總鹼薄層色譜，圖2是高效液相HPLC指紋圖。
圖1中1-原阿片鹼，2-比枯枯靈，3-延胡索乙素，4-伏生紫堇總鹼，5-巴馬丁，6-二氫比枯枯靈，7-球紫堇鹼.
薄層色譜條件吸附劑矽膠G板；展開劑環己烷-乙酸乙酯-二乙胺(16∶3∶1)；顯色劑碘化鉍鉀試液圖2中a-原阿片鹼，b-巴馬丁，c-比枯枯靈，d-延胡索乙素，e-球紫堇鹼，f-二氫比枯枯靈液相色譜條件十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相乙睛-甲醇-0.1％磷酸溶液(15∶10∶75)，用三乙胺調pH3.0。
檢測波長282nm色譜峰結果
具體實施例方式
實施例1 製備伏生紫堇總鹼(1)取1千克伏生紫堇塊莖生藥粗粉，加2％的磷酸溶液3千克浸泡過夜，裝入滲濾筒，用2％的磷酸溶液滲濾，收集滲濾液至生物鹼反應呈陰性反應為止。滲濾液用10％的氫氧化鈉調PH值至6左右，濃縮至1克生藥/毫升即可。以備分離用；(2)取濃縮液，上柱床體積為2000毫升的大孔吸附樹脂DM301，以45℃2N NaOH的溶液(2000-4000ml)洗滌至色淺，再用蒸餾水(5000-10000ml)洗至中性。再改用50％乙醇(1000-3000ml)洗滌至無比枯枯靈下來；(3)再用含0.3％的磷酸的95％乙醇洗脫(2000-3000ml)，收集洗脫液洗至生物鹼反應為陰性即可，洗脫液回收乙醇至無醇；(4)用10％的氫氧化鈉溶液調PH至12左右，並加NaCl使成飽和食鹽水溶液，放置使完全沉澱，收集沉澱，飽和食鹽水溶液至中性，乾燥粉碎。
(5)用粗品量4-8倍的無水乙醇精製，即得伏生紫堇總鹼精品。
精密稱取原阿片鹼對照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述對照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分別置100ml具塞錐形瓶中，水浴揮幹甲醇。依次精密加入溴鉀酚綠溶液2.0ml及醋酸-醋酸鈉緩衝溶液5.0ml，75℃水浴加熱30分鐘，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。強力振搖2分鐘，放置5分鐘，移至分液漏鬥中，稍放置使分層，取三氯甲烷液，通過一裝有2g無水硫酸鈉的小漏鬥。取三氯甲烷液，照中國藥典2000年版一部附錄VB分光光度法試驗，進行光譜掃描(狹縫2.0，中速掃描)。以相應的溶液為空白。結果對照品溶液在415nm波長處有最大吸收。以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準曲線。
取本品約17mg，精密測定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得，精密量取上述供試品溶液0.50ml，置100ml具塞錐形瓶中，照標準曲線的製備項下的方法，自「依次加入溴鉀酚綠溶液2.0ml」起，依法在415nm波長處測定吸收度，從標準曲線讀取生物鹼的量，計算，即得伏生紫堇總生物鹼含量為85.6％。
用高效液相色譜法選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長290nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)測定原阿片鹼含量取本品約40mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，得原料供試品溶液。精密稱取原阿片鹼對照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得對照品溶液為(20μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得原阿片鹼含量為38.1％。
用高效液相色譜法選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長225nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)測定比枯枯靈含量取本品約40mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，即得原料供試品溶液.精密稱取比枯枯靈對照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得比枯枯靈儲備溶液(0.6mg/ml)；精密量取儲備溶液1ml至100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(6μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得比枯枯靈含量為3.6％。
實施例2 製備伏生紫堇總鹼將實施例1中步驟(1)所用極性溶劑改用2％的鹽酸溶液，其他步驟(2)、(3)、(4)、(5)完全同實施例1。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為84.2％，原阿片鹼含量為35.6％，比枯枯靈含量為4.5％
實施例3 製備伏生紫堇總鹼將實施例1中步驟(1)所用極性溶劑改用2％的硫酸溶液，其他步驟(2)、(3)、(4)、(5)完全同實施例1。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為82.5％，原阿片鹼含量為35.7％，比枯枯靈含量為4.8％實施例4 製備伏生紫堇總鹼將實施例1中步驟(1)所用極性溶劑改用2％的醋酸溶液，其他步驟(2)、(3)、(4)、(5)完全同實施例1。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為83.4％，原阿片鹼含量為35.1％，比枯枯靈含量為4.6％實施例5 製備伏生紫堇總鹼步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同實施例2，其中步驟(2)中的大孔吸附樹脂改用DM201。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為79.5％，原阿片鹼含量為33.8％，比枯枯靈含量為5.1％。
實施例6 製備伏生紫堇總鹼步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同實施例4，其中步驟(2)中的大孔吸附樹脂改用D101A。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為79.1％，原阿片鹼含量為31.5％，比枯枯靈含量為4.2％。
實施例7 製備伏生紫堇總鹼步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同實施例1，其中步驟(2)中的大孔吸附樹脂改用D301。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為80.9％，原阿片鹼含量為36.3％，比枯枯靈含量為4.9％實施例8 製備伏生紫堇總鹼步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同實施例1，其中步驟(1)中的極性溶劑改用95％的乙醇溶液，步驟(2)中的大孔吸附樹脂改用DM201。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為75.3％，原阿片鹼含量為31.4％，比枯枯靈含量為4.2％。
實施例9 製備伏生紫堇總鹼步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同實施例8，其中步驟(1)中的極性溶劑改用95％的甲醇溶液。
按實施例1中含量測定方法測定計算得伏生紫堇總生物鹼為74.8％，原阿片鹼含量為32.6％，比枯枯靈含量為4.3％。
實施例10 注射用伏生紫堇總鹼製備及含量測定伏生紫堇總鹼(實施例1) 2克甘露醇 100g製成1000瓶製法取伏生紫堇總鹼提取物2g，用1％HCI溶液溶解，加注射用水適量，攪拌使充分溶解，另取甘露醇100g加入適量注射用水中攪拌溶解後，合併兩溶液，混均用1％NaOH溶液調PH至3～5，再加適量注射用水並定容至1000ml，加入適量針用活性炭攪拌煮沸30min。微孔濾膜分級濾過，濾液定量無菌分裝於經無菌處理好的安瓿中。凍幹、加塞、軋蓋即得。每瓶規格為2mg。同樣的製備方法，在合理調整處方的情況下製得每瓶規格為1mg。
含量測定總生物鹼精密稱取原阿片鹼對照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述對照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分別置100ml具塞錐形瓶中，水浴揮幹甲醇。依次精密加入溴鉀酚綠溶液2.0ml及醋酸-醋酸鈉緩衝溶液5.0ml，75℃水浴加熱30分鐘，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。強力振搖2分鐘，放置5分鐘，移至分液漏鬥中，稍放置使分層，取三氯甲烷液，通過一裝有2g無水硫酸鈉的小漏鬥。取三氯甲烷液，照中國藥典2000年版一部附錄VB分光光度法試驗，進行光譜掃描(狹縫2.0，中速掃描)。以相應的溶液為空白。結果對照品溶液在415nm波長處有最大吸收。以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準曲線。
取本品數瓶，研細，取約0.2g，精密測定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得，精密量取上述供試品溶液0.50ml，置100ml具塞錐形瓶中，照標準曲線的製備項下的方法，自「依次加入溴鉀酚綠溶液2.0ml」起，依法在415nm波長處測定吸收度，從標準曲線讀取生物鹼的量，計算，即得伏生紫堇總生物鹼含量為85.1％。
原阿片鹼選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長290nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定製劑中原阿片鹼含量取本品數瓶，研勻，取約0.1g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，得原料供試品溶液。精密稱取原阿片鹼對照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得對照品溶液為(20μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得原阿片鹼含量為36.8％。
比枯枯靈選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長225nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定製劑中比枯枯靈含量取本品數瓶，研勻，取約0.1g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，即得原料供試品溶液.精密稱取比枯枯靈對照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得比枯枯靈儲備溶液(0.6mg/ml)；精密量取儲備溶液1ml至100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(6μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得比枯枯靈含量為3.8％。
實施例11(注射用伏生紫堇總鹼製備及含量測定)伏生紫堇總鹼(實施例1)1克(2g)甘露醇 50克製成 1000瓶製法取伏生紫堇總鹼提取物2g，用1％H3PO4溶液溶解，加注射用水適量，攪拌使充分溶解，另取甘露醇50g加入適量注射用水中攪拌溶解後，合併兩溶液，混均用1％NaOH溶液調PH至3～5再加適量注射用水並定容至1000ml，加入適量針用活性炭攪拌煮沸30min。微孔濾膜分級濾過，濾液定量無菌分裝於經無菌處理好的安瓿中。凍幹加塞、軋蓋即得。每瓶規格為1mg或2mg。
含量測定總生物鹼精密稱取原阿片鹼對照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述對照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分別置100ml具塞錐形瓶中，水浴揮幹甲醇。依次精密加入溴鉀酚綠溶液2.0ml及醋酸-醋酸鈉緩衝溶液5.0ml，75℃水浴加熱30分鐘，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。強力振搖2分鐘，放置5分鐘，移至分液漏鬥中，稍放置使分層，取三氯甲烷液，通過一裝有2g無水硫酸鈉的小漏鬥。取三氯甲烷液，照中國藥典2000年版一部附錄V B分光光度法試驗，進行光譜掃描(狹縫2.0，中速掃描)。以相應的溶液為空白。結果對照品溶液在415nm波長處有最大吸收。以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準曲線。
取本品數瓶，研細，取約0.2g，精密測定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得，精密量取上述供試品溶液0.50ml，置100ml具塞錐形瓶中，照標準曲線的製備項下的方法，自「依次加入溴鉀酚綠溶液2.0ml」起，依法在415nm波長處測定吸收度，從標準曲線讀取生物鹼的量，計算，即得伏生紫堇總生物鹼含量為86.3％。
原阿片鹼選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長290nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定製劑中原阿片鹼含量取本品數瓶，研勻，取約0.1g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，得原料供試品溶液。精密稱取原阿片鹼對照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得對照品溶液為(20μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得原阿片鹼含量為37.6％。
比枯枯靈選擇十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色譜柱(美國)檢測波長225nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃流動相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定製劑中比枯枯靈含量取本品數瓶，研勻，取約0.1g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，即得原料供試品溶液.精密稱取比枯枯靈對照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流動相超聲處理使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得比枯枯靈儲備溶液(0.6mg/ml)；精密量取儲備溶液1ml至100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(6μg/ml)。分別取上述溶液各20ul進樣，記錄色譜圖，計算即得比枯枯靈含量為3.7％。
實施例12小鼠尾靜脈注射及腹腔注射注射用伏生紫堇急性毒性試驗摘要本實驗研究了小鼠尾靜脈注射及腹腔注射注射用伏生紫堇的急性毒性。結果表明小鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
目的觀察小鼠尾靜脈注射和腹腔注射注射用伏生紫堇後，所產生的急性毒性反應及死亡情況，測定LD50值，為臨床應用提供安全性依據。
1 實驗材料1.1 動物NIH小鼠120隻，雌雄各半，廣東省衛生廳實驗動物中心提供，合格證號SCXK(粵)2003-0002，粵監證字2005A011。
1.2 藥物注射用伏生紫堇，來源於實施例10，試驗前用生理鹽水稀釋至所需濃度。注射用生理鹽水，廣西裕源藥業有限公司，批號C20050520。
2.方法2.1 尾靜脈給藥急性毒性取體重18～22g NIH小鼠60隻，雌雄各半，隨機分為6組，即I、II、III、IV、V組(劑量分別為10.00mg/kg，8.50mg/kg，7.22mg/kg，6.14mg/kg，5.22mg/kg)和空白對照組，每組10隻。尾靜脈注射給藥，給藥容量均為0.2ml/10g體重，空白對照組給等容量的生理鹽水。給藥後觀察小鼠體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排洩物、死亡情況及中毒反應(中毒反應的症狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等，觀察時間14天。對瀕死及死亡動物及時進行屍檢，其他動物在觀察期結束之後進行屍檢，觀察內臟器官體積、顏色及質地有無改變，若有肉眼可見病變需進行病理組織學檢查。
2.2 腹腔注射給藥急性毒性取體重18～22g NIH小鼠60隻，雌雄各半，隨機分為5組，即I、II、III、IV、V組(劑量分別為60.00mg/kg，54.00mg/kg，48.60mg/kg，43.74mg/kg，39.37mg/kg)和空白對照組，每組10隻。腹腔注射給藥，給藥容量均為0.2ml/10g體重，空白對照組給等容量的生理鹽水。給藥後觀察小鼠體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排洩物、死亡情況及中毒反應(中毒反應的症狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等，觀察時間14天。對瀕死及死亡動物及時進行屍檢，其他動物在觀察期結束之後進行屍檢，觀察內臟器官體積、顏色及質地有無改變，若有肉眼可見病變需進行組織病理學檢查。
3 數據處理數據統計採用新藥統計軟體(NDST，5.1版本)處理，Bliss法計算LD50及95％的可信限。
4 結果4.1 尾靜脈給藥急性毒性小鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇後，可見劑量相關性活動減少、豎毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、小便失禁、驚厥、抽搐、肌肉強直性收縮、最後出現跳躍性死亡，動物死亡開始於給藥後5秒，動物死亡大多發生於給藥後1min以內。動物中毒反應和死亡率與性別無明顯相關。生理鹽水組小鼠未見明顯異常。死亡動物及觀察期結束處死動物經屍檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等器官，未見明顯病理改變。結果見表1。
表1注射用伏生紫堇尾靜脈注射給藥急性毒性實驗結果
LD50為6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；4.2 腹腔注射給藥急性毒性小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇後，可見劑量相關性活動減少、豎毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、小便失禁、驚厥、抽搐、跳躍性死亡，動物死亡開始於給藥後2分鐘，動物死亡大多發生於給藥後1小時以內。動物中毒反應和死亡率與性別無明顯相關。生理鹽水組小鼠未見明顯異常。死亡動物及觀察期結束處死動物經屍檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等器官，未見明顯病理改變。結果見表2。
表2注射用伏生紫堇腹腔注射給藥急性毒性實驗結果
LD50為48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
5 結果分析5.1 小鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為6.889mg/kg，按公斤體重計算，相當於70kg成人每日用量(0.057mg/kg)的120倍以上。
5.2 小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為48.015mg/kg，按公斤體重計算，相當於70kg成人每日靜脈給藥量(0.057mg/kg)的842倍以上。
6 結論小鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
參考文獻1.國家食品藥品監督管理局藥品審評中心.中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則.2005.32.王北嬰，李儀奎.中藥新藥研製開發技術與方法.上海上海科學技術出版社，2002788～790.
3.中華人民共和國衛生部藥政管理局.中藥新藥研究指南.1993203.
實施例13、大鼠尾靜脈注射及腹腔注射注射用伏生紫堇急性毒性試驗摘要本實驗研究了大鼠尾靜脈注射及腹腔注射注射用伏生紫堇的急性毒性。結果表明大鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
目的觀察大鼠尾靜脈注射和腹腔注射注射用伏生紫堇後，所產生的急性毒性反應及死亡情況，測定LD50值，為臨床應用提供安全性依據。
1 實驗材料1.1 動物SD大鼠120隻，雌雄各半，廣東省衛生廳實驗動物中心提供，合格證號SCXK(粵)2003-0002，粵監證字2005A010。
1.2 藥物注射用伏生紫堇，來源於實施例10，試驗前用生理鹽水稀釋至所需濃度。注射用生理鹽水，廣西裕源藥業有限公司，批號C20050520。
2.方法2.1 尾靜脈給藥急性毒性取體重130～150g SD大鼠60隻，雌雄各半，隨機分為6組，即I、II、III、IV、V組(劑量分別為12.00mg/kg，9.60mg/kg，7.68mg/kg，6.14mg/kg，4.92mg/kg)和空白對照組，每組10隻。尾靜脈注射給藥，給藥容量均為0.5ml/100g體重，空白對照組給等容量的生理鹽水。給藥後觀察大鼠體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排洩物、死亡情況及中毒反應(中毒反應的症狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等，觀察時間14天。對瀕死及死亡動物及時進行屍檢，其他動物在觀察期結束之後進行屍檢，觀察內臟器官體積、顏色及質地有無改變，若有肉眼可見病變需進行病理組織學檢查。
2.2 腹腔注射給藥急性毒性取體重130～150g SD大鼠60隻，雌雄各半，隨機分為6組，即I、II、III、IV、V組(劑量分別為70.00mg/kg，59.50mg/kg，50.58mg/kg，42.99mg/kg，36.54mg/kg)和空白對照組，每組10隻。腹腔注射給藥，給藥容量均為0.5ml/100g體重，空白對照組給等容量的生理鹽水。給藥後觀察大鼠體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排洩物、死亡情況及中毒反應(中毒反應的症狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等，觀察時間14天。對瀕死及死亡動物及時進行屍檢，其他動物在觀察期結束之後進行屍檢，觀察內臟器官體積、顏色及質地有無改變，若有肉眼可見病變需進行組織病理學檢查。
3 數據處理數據統計採用新藥統計軟體(NDST，5.1版本)處理，Bliss法計算LD50及95％的可信限。
4 結果
4.1 尾靜脈給藥急性毒性大鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇後，可見劑量相關性活動減少、豎毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、眼眶出血、小便失禁、驚厥、抽搐、肌肉強直性收縮、最後出現跳躍性死亡，動物死亡開始於給藥後25秒，動物死亡大多發生於給藥後30分鐘以內。動物中毒反應和死亡率與性別無明顯相關。生理鹽水組大鼠未見明顯異常。死亡動物及觀察期結束處死動物經屍檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等器官，未見明顯病理改變。結果見表1。
表1 注射用伏生紫堇大鼠尾靜脈注射給藥急性毒性實驗結果
LD50為8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；4.2 腹腔注射給藥急性毒性大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇後，可見劑量相關性活動減少、豎毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、眼眶出血、小便失禁、驚厥、抽搐、跳躍性死亡，動物死亡開始於給藥後5分鐘，動物死亡大多發生於給藥後1小時以內。動物中毒反應和死亡率與性別無明顯相關。生理鹽水組大鼠未見明顯異常。死亡動物及觀察期結束處死動物經屍檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦等器官，未見明顯病理改變。結果見表2。
表2注射用伏生紫堇大鼠腹腔注射給藥急性毒性實驗結果
LD50為55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
5 結果分析5.1 大鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為8.617mg/kg，按公斤體重計算，相當於70kg成人每日用量(0.057mg/kg)的150倍以上。
5.2 大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為55.079mg/kg，按公斤體重計算，相當於70kg成人每日靜脈給藥量(0.057mg/kg)的966倍以上。
6 結論大鼠尾靜脈注射注射用伏生紫堇的LD50為8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50為55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
參考文獻1.國家食品藥品監督管理局藥品審評中心.中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則.2005.32.王北嬰，李儀奎.中藥新藥研製開發技術與方法.上海上海科學技術出版社，2002788～790.
3.中華人民共和國衛生部藥政管理局.中藥新藥研究指南.1993203.
權利要求
1.一種伏生紫堇總鹼，由伏生紫堇乾燥塊莖提取，其特徵是以重量百分比計，總鹼含量80％以上，其中含有原阿片鹼(protopine)35-70％、比枯枯靈(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴馬丁(palmatine)、罌粟鹼、二氫比枯枯靈、球紫堇鹼、空褐鱗鹼等。
2.一種伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是(1)以伏生紫堇塊莖為原料，加入2-20倍的極性溶劑滲漉提取，或強制回流提取，收集提取液至無生物鹼反應，合併提取液，用鹼液調PH至6-7，濃縮至適量，得到提取濃縮液；(2)把上述步驟得到的提取濃縮液進行大孔樹脂吸附層析，以溫度40℃以上的1-8mol/l強鹼溶液洗滌，用量為柱體積的1-10倍，再用50-60％乙醇溶液洗滌去雜及劇毒性成分比枯枯靈；(3)以極性洗脫液洗脫伏生紫堇生物鹼，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮至小體積；(4)用鹼液調PH值至鹼性，析出沉澱，濾取沉澱，飽和食鹽水洗至中性，乾燥；(5)沉澱用有機溶劑乙醇或甲醇溶解，過濾，濾液回收溶劑至小體積，放置析晶，濾取結晶乾燥，即得伏生紫堇總鹼。
3.根據權利要求2所述的伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是步驟(1)中所用極性溶劑選自1-10％的磷酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸或琥珀酸溶液，或75-95％的乙醇或甲醇溶液。
4.根據權利要求2所述的伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是步驟(2)中所用大孔吸附樹脂為D101A、DM201、DM301、D301中的一種。
5.根據權利要求2所述的伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是步驟(3)中所用的用於洗脫伏生紫堇總鹼的極性洗脫液酸水為0.1-10％的鹽酸、磷酸、乳酸或琥珀酸溶液，或濃度為60-95％的酸性乙醇或酸性甲醇溶液。
6.根據權利要求2所述的伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是步驟(4)中所用鹼液是濃度為5-20％的NaOH或KOH溶液。
7.根據權利要求2所述的伏生紫堇總鹼的製備方法，其特徵是步驟(5)中所用有機溶劑是氯仿或≤C4低級脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯。
8.一種含有伏生紫堇總鹼的藥物組合物，其特徵是填加常規藥用賦形劑，即可製成口服、注射劑型。
9.一種含有伏生紫堇總鹼的藥物組合物，其特徵是伏生紫堇總鹼凍乾粉針，處方組成伏生紫堇總鹼1～5g，0.5～10％鹽酸、磷酸、乳酸或琥珀酸溶液5～10ml，賦形劑甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖或氯化鈉中的一種或兩種或兩種以上20～5000g，加注射用水適量製成1000ml。
10.根據權利要求9所述的含有伏生紫堇總鹼的藥物組合物，其特徵是伏生紫堇總鹼2g，1％磷酸溶液10ml，甘露醇50g，加注射用水適量製成1000ml。
11.根據權利要求9所述的含有伏生紫堇總鹼藥物組合物的製備方法，其特徵是取伏生紫堇總鹼提取物，用酸溶液溶解，加注射用水適量，攪拌使充分溶解，另取甘露醇加入適量注射用水中攪拌溶解後，合併兩溶液，混均用1％NaOH溶液調PH至3～5，再加適量注射用水並定容，加入適量針用活性炭攪拌煮沸30分鐘，微孔濾膜分級濾過，濾液定量無菌分裝於經無菌處理好的管制抗生素玻璃瓶中，真空冷凍乾燥，加塞、軋蓋即得。
全文摘要
本發明涉及一種伏生紫堇總鹼及其製備方法和其藥物組合物，以及在製備治療和預防急性腦缺血藥物中的應用。伏生紫堇總鹼由伏生紫堇乾燥塊莖提取，其特徵是以重量百分比計，總鹼含量80％以上，其中含有原阿片鹼(protopine)35－70％、比枯枯靈(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴馬丁(palmatine)、罌粟鹼、二氫比枯枯靈、球紫堇鹼、空褐鱗鹼等。該方法可有效地除去胺基酸及糖類、鞣質等雜質，特別是降低有毒成分比枯枯靈的含量，明顯提高伏生紫堇總鹼的純度。
文檔編號A61P9/10GK1785261SQ200510012978
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月15日 優先權日2005年11月15日
發明者夏彤, 魏兵, 黃國勝, 胡竹梅, 王海強 申請人:河北智源醫藥科技有限公司, 石家莊華康製藥有限公司