細胞周期調節及細胞過敏性反應誘導基因的製作方法
2023-04-27 00:21:51
專利名稱：細胞周期調節及細胞過敏性反應誘導基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及植物基因及其分離技術。
利用傳統遺傳學方法，只適用於分離克隆功能產物已知的基因。即，首先要鑑定目標基因的表達產物，從而分離蛋白，通過測定胺基酸序列，推測基因的DNA序列，進而用它做探針分離目標基因。但是，絕大多數植物抗病基因產物是未知的，因此，利用傳統基因分離技術無法克隆這些基因。
分離產物未知的植物抗病基因方法主要是圖位克隆法和轉座子標籤克隆法。
1.圖位克隆法其原理是依據基因在基因圖譜中的位置，利用與目的基因緊密連鎖的分子標記，藉助於染色體步移及登陸技術克隆基因。它包括三個關鍵環節①構建高解析度的遺傳圖譜和物理圖譜，定位目標基因，獲得位於目標基因兩側，並與其緊密連鎖的分子標記；②構建大片段基因文庫；③可行的遺傳轉化技術。
目前利用該方法從西紅柿中克隆出番茄抗霜黴病基因Pto等3個基因，從擬南芥中克隆出抗細菌病RPs2等5個基因，從水稻中克隆出Xa21、Xa1兩個抗白葉枯病基因，從甜菜中克隆出抗線蟲病基因Hs1。
由於麥類基因組含量大，尚沒有緻密的遺傳圖譜。另外，小麥族植物基因組中含有大量的重複DNA序列，約佔總基因組含量的75％。很難利用染色體步移或登陸法去定位基因。
2.轉座子標籤技術其原理是誘發轉座子跳躍，插入到目的基因內部或其鄰近位點，引起表現型變異。因此，可以用轉座子為探針克隆出該突變基因，再利用突變基因做探針從正常植物中克隆出目的基因。利用這種方法已成功地克隆了菸草抗花葉病毒基因N，西紅柿抗葉黴病基因cf9，亞麻抗繡病基因L，玉米抗圓斑病基因Hm1及玉米抗條鏽基因RP1。但是，由於小麥族植物中尚沒有發現可以利用的轉座子，因此，該法不能用於小麥族植物基因克隆。
染色體顯微分離技術現狀染色體顯微分離技術是指在顯微鏡下對特定染色體進行顯微切割、分離、隨後進行DNA擴增，並將擴增產物連接到特定載體上，構建特定染色體DNA文庫。通常的基因文庫是由基因組總DNA構成的，與其相比，染色體DNA文庫是由基因組中某一特定染色體DNA構成，通過分析文庫特徵，可以直接獲得該染色體上的遺傳信息。當要分離位於特定染色體上的目的基因時，可以應用染色體顯微分離技術分離回收該染色體，構建DNA文庫，分離與目的基因相關的DNA片段，進而分離基因。該法特別適用於是基因組含量較大的植物。染色體分離技術包括(1)染色體標本製作與染色體的識別鑑定；(2)染色體顯微切割、分離；(3)DNAPCR擴增；(4)構建DNA文庫。其中關鍵技術是染色體顯微切割與分離。
目前，通常採用玻璃針切割法和顯微雷射切割分離法兩種方法(1)玻璃針切割分離法它是將細微的玻璃針裝載在顯微操縱器上，用玻璃針的端部直接挑取目標染色體。利用玻璃針法相繼構建了一些人類染色體區帶探針池，用於分離染色體特定區域的基因分子標記。1992年該技術首次應用於構建野生甜菜(Beta patellaris)特定染色體的基因文庫。此後，Schondelmaier等(1993)構建了大麥1HS的DNA文庫，Chen等(1995)構建了栽培燕麥第21號DNA文庫等等。其優點是實驗裝置簡單，只需一臺倒置顯微鏡。但是，用玻璃針直接挑取染色體，技術上要求很高，不易掌握。
(2)染色體顯微雷射分離技術為解決染色體分離回收技術要求高，不易操作的問題，日本科學家福井希一等人(1992)[Fukui K，等，Theor，Appl.Genet.，1992，84787-791]開發了染色體顯微雷射分離技術。它是採用美國Meridian公司開發的雷射共聚焦掃描系統(Cell Work Station，ACAS 470型)對水稻、大麥染色體進行顯微切割，分離。該顯微操作裝置可發射波長350-528nm的雷射，用雷射直接照射染色體標本上不要的染色體和細胞核，利用雷射產生的熱能使被照射的部分受熱蒸發，最後只保留所需要的部分。由於雷射的照射強度、時間及位置都是通過計算機控制的，容易操作。
通過檢索GenBank，表明在哺乳動物(如人、鼠)基因組中，已經發現癌抑制基因P53基因，該基因序列同本發明的基因具有一定的同源性。
P53基因是一類轉錄因子，它可以激活下遊基因表達。1984年該基因被克隆。該基因的cDNA由1179個鹼基對組成，編碼393個胺基酸，包括N末端區域(轉錄活性區)、中央區域(DNA結合區域)和C末端區域(核內轉移區)。我們獲得的pMAg139的序列與P53基因序列比較發現，P53基因第321鹼基到第1125鹼基區域與pMAg139存在著一定的同源性。從編碼胺基酸上看，pMAg139編碼了中央區域及C末端區域一部分(缺少18個胺基酸)(圖2)。
P53基因功能在正常細胞中，P53基因產物含量很低，沒有活性。當細胞受到如病原菌感染，紫外線照射，高溫等生物及非生物脅迫作用，造成基因組內DNA受損時，P53基因被激活，其產物在細胞內大量積累，並逐漸轉移到細胞核內，與靶基因的啟動子結合，激活靶基因。P53基因的信號傳遞模式如圖3所示，其功能之一是調控細胞周期。首先，當基因受損較輕時，P53蛋白將與P21基因結合，使其表達。該基因產物是細胞周期調節因子CDK(cyclin dependent kinase)阻遏蛋白，轉錄因子E2F可以激活DNA合成基因轉錄，使細胞周期由G1期向S期過渡。Rb因子是調控E2F活性的。通常在細胞周期過程中，在G1前期低磷酸化型Rb因子與E2F結合，但到了G1後期Rb因子將變成高磷酸化型，並與E2F脫離，誘導DNA合成基因表達，向S期過渡。當P21基因表達，阻遏CDK基因表達，低磷酸化Rb大量積累，與E2F結合使其失活，從而抑制了細胞由G1期向S期過渡。細胞周期一旦停止，遭受損傷的DNA將得到修復，細胞周期將再次恢復。如果P53基因失活，細胞周期不能暫停，受損的基因得不到及時修復，受損的細胞就會繼續增殖產生病變(表1)。
P53基因的另一功能是誘導細胞主動死亡，表現出抗病性。當基因受損嚴重無法修復時，P53基因將啟動細胞主動死亡系統，從組織中排除受損細胞，保證鄰近細胞不受影響。P53基因產物與BAX基因(Bcl 2Associated X Protein)或Fas/Apol基因的啟動子結合，誘導基因表達。這兩種基因產物都具有抑制Bcl-2、促進Caspase基因活性的作用。Caspase基因可以誘導細胞主動死亡，使細胞表現抗病性。近年來，在醫學上利用P53基因治療癌症已進入臨床實驗。
在糧食作物玉米中，利用人類P53蛋白抗體，進行免疫反應分析，發現了P53基因編碼蛋白(Georgieva，E等，plana，1994，192(1)125-129)。說明植物中也含有與哺乳動物的P53基因類似的功能基因。但是，迄今為止，國內外尚沒有在植物基因組中發現與P53基因同源的DNA序列。目前還沒有應用哺乳動物P53基因進行植物抗病育種的報導。
本發明的目的是採用染色體顯微雷射分離技術，分離回收中間偃麥草染色體2Ai-2染色體，構建DNA文庫，從中篩選與抗病基因有關的基因片段，進而克隆抗病基因。
本發明的方案是這樣實現的一種細胞周期調節及細胞過敏性反應誘導基因，該基因為pMAg139基因，由804個鹼基對組成，其序列如
圖1。
本發明的優點和積極效果為最近的研究表明動植物可能採用相同的調控機制誘導過敏性反應(Pazo，O.，Lam，E1998 Current Biol.，8，1129-1132)。過敏性反應是動植物體內抵禦病原菌侵染的一種防衛反應。它是通過誘導細胞主動死亡，將病原菌限制在局部組織細胞內，阻止其進一步向周邊組織細胞擴展，從而起到自身防禦作用。
哺乳動物中的P53基因其功能主要有二個，(1)具有調節細胞周期，使受損傷的基因得以修復。(2)癌抑制作用。當人體內P53基因失活，就會產生各種癌變(見表1)。
在玉米中已發現有P53基因的表達產物，在豌豆發現由P53基因產物誘導的P21基因與人體內的P21基因之間具有高度的同源性。說明植物體內存在與P53基因相似的P53類似功能基因，該基因在植物細胞內應具有調節植物細胞周期，和誘導植物細胞產生過敏性反應的功能，從而使植物表現出抗病性。
有實驗證明，病原菌侵入植物細胞內，會導致核內DNA受損(Hadwiger，LA and Adams MJ.1978，Physiological Plant Pathology，1263-72)。因此，可以推測，當植物感染病原菌時，P53類似基因將被激活，其產物不斷積累，進入細胞核內，誘導細胞周期調節系統活化，修復受損的DNA，或者是誘導細胞內產生過敏性反應，將病原菌限制在局部範圍內，防止其繼續擴展，表現出抗病性。
本發明得到的pMAg139基因是來自小麥近緣種中間偃麥草，已經證實，中間偃麥草具有抗條銹病(Puccinia striiformis f.)、葉銹病(Puccinia recondita f.)、稈銹病(Puccinia striiformis f.)、小麥黃花葉病毒病WYMV等抗性基因，這些抗性都是通過產生過敏性反應體現的，pMAg139基因可能就是誘導這些過敏性反應的轉錄因子。
小麥銹病(條鏽、葉鏽、稈鏽)及小麥黃花葉病毒病是小麥的重要病害，對小麥的產量影響很大，常年損失5-10％。在我國小麥條銹病主要分布在華北、西北、淮北等北方冬麥區。稈銹病主要發生在東南沿海，長江流域中下遊冬麥區，東北、西北、內蒙古等春麥區。葉銹病主要發生在西南及長江中下遊冬麥區。小麥黃花葉病毒病主要分布在長江中下遊地區，特別是近年來有逐年上升趨勢。
本發明獲得的pMAg139基因，可能就是誘導小麥細胞體內產生過敏性反應的轉錄因子，可做為一種廣譜抗病基因加以利用。將該基因導入當地主栽品種，可選育出抗銹病、抗黃花葉病毒病小麥新品種。由於抗病品種育成和推廣，還可大量減少農藥的使用，因此，該基因的應用，可產生巨大的經濟和社會效益。
圖1為本發明的pMAg139基因序列2為本發明pMAg139基因與P53基因的蛋白質一級結構比較圖3為P53基因誘導的細胞周期停止及細胞主動死亡模式下面敘述
具體實施例方式本發明申請人是最早利用染色體顯微雷射切割技術構建小麥近緣種中間偃麥草染色體2Ai-2 DNA文庫的。通過對DNA文庫的篩選，獲得了一個能夠在2Ai-2染色體附加系(即2Ai-2染色體附加到普通小麥品種中)與普通小麥品種之間出現多態性的探針pMAg139，序列分析結果表明pMAg139由804個鹼基對組成(如圖1)。具體分離技術如下一、材料(一)植物材料①中間偃麥草，它是小麥的近緣野生種，具有小麥抗黃矮病、小麥黃花葉病毒病、銹病等抗性基因。
②附加系Z2攜帶有黃矮病抗性基因的中間偃麥草染色體2Ai-2添加到普通小麥品種宛7107，其染色體數2n＝44(包括普通小麥21對染色體和1對2Ai-2染色體)。
③2Ai-2染色體受體品種宛7107。
(二)質粒與菌種採用質粒pUC18及宿主大腸桿菌DH5α，構建2Ai-2染色體DNA文庫。
二、方法(一)利用染色體顯微切割技術構建染色體DNA文庫主要包括以下步驟1.染色體標本製備從孕穗期小穗上採集的花葯，分別用新鮮配製的卡諾固定液(乙醇∶冰醋酸＝3∶1)固定，通常要固定12小時以上，為了保證染色體DNA不受損傷，將固定時間減少到10-15分鐘，然後轉到70％乙醇置-20℃保存。採用2.5％纖維素酶/2.5％果膠酶，37℃酶解40-60分鐘，蒸餾水中低滲10-20分鐘後，將花葯移到底部粘有薄膜的培養皿上，塗片。
2.染色體識別為了便於識別目標染色體，以附加系Z2作母本，與其小麥親本宛7107雜交，雜種F1減數分裂中期I染色體構成為2n＝21II+I，其中配對的21對二價體是普通小麥染色體，而剩下一條未能配對的染色體是2Ai-2染色體。此外，後期I停滯在赤道板附近的單條染色體2Ai-2也很容易從小麥遺傳背景中識別出來。
3.目標染色體的分離利用紫外雷射共聚焦掃描系統(ACAS570UVA)，採用消除法進行目標染色體的分離回收。將染色體標本置於倒置顯微鏡下，尋找到合適的中期I或後期I分裂相後，以90-110mW功率的雷射(波長488nm)切出一個以目標染色體為中心的長方形膜，然後再用雷射(波長488nm，功率80-90mW)照射長方形膜內不要的細胞和染色體，使其蒸發，最後只保留所需要的染色體。用鑷子回收長方形膜(此時，膜上附有目標染色體)，放入0.5ml離心管內。
4.回收染色體蛋白酶及內切酶處理蛋白酶處理參照Fukui等(1992)[Fukui K，等，Theor，Appl.Genet.，1992，84787-791]方法進行。限制內切酶Sau3AI處理參照夏家輝等的方法(1994，遺傳學報21(4)253-256)5.LA-PCR參照夏家輝等(1994，遺傳學報21(4)253-256)人類染色體LA-PCR擴增時採用的連接接頭與引物，與Sau3AI酶解的2Ai-2染色體DNA產物連接。
PCR擴增第一輪PCR擴增向蛋白酶處理後的染色體DNA溶液加入30μl PCR反應液，包括1.5pmol引物，0.5mM dNTP，3mM MgCl2，1XBuffer，1單位Taq DNA聚合酶。反應條件95℃，5分鐘；96℃ 1分鐘--62℃ 2分鐘--72℃ 2分鐘，30個循環。
第二輪PCR擴增取第一輪PCR擴增產物2μl做為第二輪擴增的模板，其它反應液組成與第一輪擴增相同，擴增反應條件如下94℃ 1分鐘-55℃ 1.5分鐘-72℃ 1分鐘，一個循環。94℃ 1分鐘--42℃2分鐘--72℃2分鐘，30-35個循環。第二輪擴增產物用等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)純化，供與載體pUC18連接使用。
6.DNA文庫的構建LA-PCR擴增產物經純化後與載體pUC18連接，將重組質粒轉化到宿主E.coli DH5α內。-70℃保存。
按上述方法，我們在國際上首次採用染色體雷射顯微分離技術，獲得中間偃麥草染色體2Ai-2，並構建了該染色體DNA文庫。
(二)從構建的染色體DNA文庫中篩選中間偃麥草特異基因片段分別以中間偃麥草及普通小麥品種中國春基因組DNA為探針進行常規的菌落原位雜交，篩選與中間偃麥草只有微弱雜交信號的克隆。通過RFLP分析，我們篩選出異附加系Z2、小麥品種宛7107(親本)之間出現多態性的克隆pMAg139。
(三)pMAg139的基因序列分析提取pMAg139克隆質粒DNA，利用Pharmacia公司的DNA測序儀和由該公司提供的標準方法，對pMAg139進行了DNA序列測定，表明，pMAg139基因片段由804個鹼基對組成，具體組成如圖1所示。
利用BLAST2程序，進行GenBank檢索，表明在植物基因組中沒有與pMAg139同源的DNA序列，說明該基因片段在植物基因組中是首次發現。在哺乳動物基因組中(如人、鼠)，發現癌抑制基因P53與pMAg139有極高的同源性。癌抑制基因P53基因的cDNA由1179個鹼基對組成，其中從第321對鹼基到第1125對鹼基區間與pMAg139具有99％的同源性。從胺基酸序列組成上看，pMAg139基因片段編碼P53基因的DNA結合區域和C末端一部分區域(末端缺少18個胺基酸)。
在明確pMAg139的DNA序列的基礎上，採用常規的5』-RACE和3』-RACE法，可以獲得pMAg139編碼的基因的5』端序列和3』端序列，在以它們為兩端引物進行PCR擴增，可獲得該基因的全部序列。將獲得的完整基因序列整合到植物表達載體，可得到在植物體內表達的功能基因。
(四)pMAg139基因的克隆技術1、cDNA兩端連接接頭採用《分子克隆》(科學出版社，第二版，343～407)提供的方法，提取中間偃麥草mRNA，合成雙鏈cDNA，並按下列程序在cDNA兩端連接接頭。
採用接頭的序列如下其中包括BamHI酶切位點，5』-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGATCCCAGGT-3』AGGTCCA-P04-5』反應液組成 雙鏈cDNA5μl(0.25～0.5μg)10μMcDNA接頭2μl5倍連接酶2μlT4 DNA連接酶 1unit合計 10μl反應條件①16℃，過夜。
②70℃，5分鐘熱處理，使T4 DNA連接酶失活。
2.5』及3』RACE反應，明確P53類似基因兩端的序列根據pMAg139的DNA序列設計、合成引物GSP-1 5』-AGTGC TCGCT TAGTG CTCCC-3』GSP-2 5』-GAGGC CCATC CTCAC CATCA T-3』5』端及3』端引物AP1序列(接頭的部分序列)5』-CACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGATCCCAGGT-3』反應成分如下帶有接頭的cDNA 0.5～1pg10pmol/μl AP1 1μl10pmol/μl GSP1或GSP2 1μl10mM dNTP混合溶液 1μl10×Taq PCR緩衝液 5μl50×Advantage klen Taq Polymerase 1μldH2O 36μl合計 50μlPCR反應條件94℃ 1分鐘 擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測後，採用promega公司提供的載體pGEM-T及由該公司提供的標準方法，將擴增產物克隆到pGEM-T上。
利用pharmacia公司的DNA測序儀和由該公司提供的標準方法，測定P53類似基因的兩末端序列，並根據測序結果設計合成P53類似基因兩端DNA序列5』GSP(5端引物)和3』GSP(3端引物)。以5』GSP，3』GSP為引物，帶接頭cDNA為模板進行PCR，即可獲得完整的pMAg139基因。
反應液組成如下帶有接頭的雙鏈cDNA 0.5-1pg10μM 5』GSP 1μl10μM 3』GSP 1μl10×Klen Tag PCR緩衝液 5μl50×Klen Taq聚合酶 1μl10mM dNTP混合液 1μldH2O36μl合計50μl反應條件 T依5』GSP，3』GSP序列組成而定。
3.將完整P53類似基因克隆到pBI121載體上，獲得可表達的P53類似基因①限制性內切酶BamHI酶切用BamHI分別酶切載體pBI121、帶接頭cDNA。
酶切反應液成分載體pBI121質粒DNA(或cDNA)4μgBamHI緩衝液2μlBamHI 20unitdH2O Xμl總反應液 20μl反應條件37℃ 1小時。②外源DNA片段與載體分子數比為3∶1，載體用量約15ng/反應反應液組成載體DNA1μl(15ng)P53類似基因2μl(45ng)連接酶緩衝液 1μl連接酶 1μl反應條件16℃過夜。
4.用於遺傳轉化的感受態細胞製備及轉化按《分子克隆》(科學出版社，第二版，49～55)提供的方法製備感受態細胞。
(五)將得到的pMAg139的基因轉移植物基因組中受體材料的準備取授粉後12-14天的未成熟胚，在75％乙醇中浸泡30秒，0.1％升汞消毒10min。經無菌水3-5次衝洗後，接種於SD2培養基上形成胚性愈傷組織，作為基因槍轉化的靶材料。
培養基誘導培養基為MS+Asp 150mg/L+2，4-D 2.0mg/L。分化培養基是1/2 MS+1.0mg/LK+0.5mg/L NAA。壯苗培養基是1/2MS無機鹽類+VB11mg /L+0.5mg/L IAA+1.5mg/L多效唑+20％蔗糖+瓊脂4.5g pH5.8。
基因槍轉化在轉化前4小時，將胚性愈傷組織塊轉移到高滲透壓培養基(SD2培養基附加0.6M甘露醇，0.6M山梨醇)上，將50-60塊愈傷組織放置在培養皿中央直徑約2.5cm範圍內。用目的基因包裹直徑1.0μm金粉，採用PDS-1000/He基因槍(Bio-Rad公司生產)，選擇可裂膜壓力為1100Psi，靶材料至目的基因距離為6cm，按照該基因槍說明書所述過程對靶材料進行轟擊。
轉化體的篩選及植株的再生轟擊後，愈傷組織在上述高滲培養基避光培養16小時，然後轉到原培養基上恢復培養。2周後將愈傷組織轉移到含1/2 MS+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+4mg/L Basta篩選培養基上，在光照條件下誘導胚性愈傷組織的分化和植株的再生。3周後，將再生的小苗移植到含1/2MS+8mg/LBasta的培養基上生長。再生植株長到2-4cm後，移入壯苗培養基。
外源基因檢測利用常規的外源基因檢測技術對外源基因進行跟蹤鑑定。結合接種病原菌，可篩選出具有抗病性的轉基因植株。
表1. P53基因突變引起的腫瘤部位 腫瘤腦 星狀膠細胞腫瘤、多形膠芽腫瘤、中樞神經原發惡性淋巴腫瘤頭頸部 扁平上皮癌皮膚 黑色腫瘤、扁平上皮癌、基底細胞癌肺 腺癌、小細胞癌、扁平上皮癌、乳房 乳腺癌消化器系統 食道癌、胃癌、大腸癌、膽囊、膽管癌、肝癌內分泌系統 甲狀腺癌、副腎皮質癌、泌尿系統 膀胱癌、尿管癌生殖器 前列腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮內膜癌、子宮頸癌血液 各種白血病、惡性淋巴腫瘤引自多田光宏，池田潤，細胞工學，1992，16(4)，519—52權利要求
1.一種細胞周期調節及細胞過敏性反應誘導基因，其特徵在於該基因為pMAg139基因，由804個鹼基對組成，其序列如圖1。
全文摘要
一種細胞周期調節及細胞過敏性反應誘導基因,該基因為pMAg139基因,由804個鹼基對組成,其序列如圖。本發明獲得的pMAg139基因,可能就是誘導小麥細胞體內產生過敏性反應的轉錄因子,可做為一種廣譜抗病基因加以利用。將其導入當地主栽品種,可選育出抗銹病、抗黃化葉病毒病小麥新品種。由於抗病品種育成和推廣,還可大量減少農藥的使用,因此,該基因的應用,可產生巨大的經濟和社會效益。
文檔編號C07H21/00GK1342755SQ0012472
公開日2002年4月3日 申請日期2000年9月14日 優先權日2000年9月14日
發明者馬有志, 辛志勇, 何聰芬, 陳孝, 張增豔, 李連城, 徐瓊芳, 徐惠君, 林志珊, 葉興國, 杜麗璞 申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所