一種發酵乳桿菌及其應用的製作方法
2023-04-26 11:52:36
本發明屬於微生物領域，具體涉及一種發酵乳桿菌及其應用。
發明背景
飼料中添加抗生素能夠抵抗疾病，促進動物的生長，加快集約化畜牧業的發展。但是隨著人們對綠色、安全和環保理念的不斷加強和對健康程度的不斷重視，抗生素添加劑在給人們帶來巨大經濟利益的同時其負面效應也逐漸凸顯，最典型的特徵就是抗生素引起的耐藥性、內源性感染、二重感染以及藥物殘留，這些將對養殖業、飼料工業和動物帶來嚴重威脅，進而通過食物鏈危及人類健康。因此，限制乃至禁止飼料行業和養殖業使用抗生素的呼聲越來越高，研究和開發新的抗生素替代品刻不容緩。
近年來，益生菌因其安全、無毒、無殘留、不誘發耐藥性且對動物生長具有顯著作用而被作為抗生素替代品的首要選擇。乳酸桿菌是益生菌中的主要菌種，它是動物消化道棲生微生物，在防治胃腸道感染、調節免疫功能和調節腸道的微生物菌群平衡中具有較好作用，是一種很有前途的益生素生產菌種。
目前，乳酸菌類產品的開發利用已成為我國飼料行業發展的一個新趨勢，但也存在一些亟待解決的問題。如益生效果不佳、產品質量不穩定、活菌數量不夠、抗逆性差等。因此，篩選益生性能好、耐受能力強、繁殖速度快、質量穩定的乳酸桿菌類產品，對提高產品的市場競爭力以及促進畜牧業的發展都非常有意義。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a。
本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其於2016年11月15日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓，郵編：510070，保藏編號：gdmccno.60112。
本發明的第二個目的是提供發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a在製備抗菌藥物中的應用。
所述的抗菌藥物是抗金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的藥物。
本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果，因此能用於製備抗菌藥物，具有廣闊的市場前景。
本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其於2016年11月15日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓，郵編：510070，保藏編號：gdmccno.60112。
附圖說明：
圖1為本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a在mrs培養基上培養的菌落形態特徵。
圖2為本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a顯微形態特徵。
圖3為本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發酵上清液對大腸桿菌的抑菌能力，1：發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發酵上清液；2：菌株dj9b的發酵上清液；②：ph4.45mrs空白培養基；③：ph6.60mrs空白培養基。
圖4為本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌能力，1：發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發酵上清液；2：菌株dj9b的發酵上清液；②：ph4.45mrs空白培養基；③：ph6.60mrs空白培養基。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制，根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。
實施例1：菌株的分離純化
購買廣州先烈中路菜市場所售發酵風味食品(酸菜、酸豆角、梅菜)，加適當的生理鹽水進行無菌研磨，用生理鹽水將研磨液稀釋至合適濃度，取3個適宜稀釋度的菌液塗布caco3-mrs(蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，碳酸鈣20g，吐溫-801.08g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，三級水定容至1l，調ph至7.2，滅菌備用)平板，37℃厭氧培養48h。挑取溶鈣圈較大的菌落在mrs(配方如上，無碳酸鈣)平板上劃線分離，反覆純化。將純化後的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢及h2o2接觸酶試驗，挑出無芽孢、接觸酶陰性的革蘭氏陽性菌株，置於10％的甘油管中，-80℃保存備用。本試驗共分離到81株溶鈣圈較大、接觸酶陰性、無芽孢的革蘭氏陽性菌株。
用濃度為6mol/l的鹽酸調節mrs液體培養基(蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-801.08g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，三級水定容至1l，調ph至7.2，滅菌備用)ph至4.0、3.0、2.5。將初篩獲得的乳酸菌進行活化並培養至對數生長期後，按體積比2％的接種量分別接種至ph為4.0、3.0、2.5的mrs液體培養基中，37℃厭氧培養24h，以未接種的培養基為對照，測各組菌液的od600nm值，選取耐酸性能較好的乳酸菌進行後續實驗。
本試驗發現48株乳酸菌可在ph4.0的mrs液體培養基中生長，10株乳酸菌能夠在ph3.0環境下生長，其中菌株dj8a和dj10c在ph3.0環境下生長良好。
上述試驗純化所得的菌株均保存於廣東省微生物菌種保藏中心。
實施例2：菌株耐酸、耐膽鹽試驗
選取可在ph3.0生長的菌株，重新培養至對數生長期後，按體積比2％接種量接種至含有0.1％、0.2％、0.3％膽鹽的mrs液體培養基中，37℃厭氧培養24h，以相應膽鹽含量的未接種培養基為對照，測各組菌液的od600nm值，選取耐膽鹽性能較好的乳酸菌進行後續實驗。
本試驗發現，實施例1中所提到的10株可在ph3.0環境下生長的菌株均能在0.1％的牛膽鹽中生長，但均不能在0.2％及0.3％牛膽鹽中生長，其中菌株dj8a在0.1％的牛膽鹽中生長良好。
實施例3菌種鑑定
(1)形態學鑑定：將篩選獲得的菌株塗布分離於mrs平板上，37℃厭氧培養24h後觀察其菌落特徵；取單菌落塗片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其個體形態。
菌株dj8a在mrs平板上37℃培養48h後，菌落呈圓形、扁平、白色，表面光滑、溼潤，邊緣整齊，直徑3-4mm(圖1)；菌株dj8a的顯微形態特徵為短杆狀，單個、成對或成長鏈，不產芽孢、革蘭氏陽性(圖2)。
(2)16srrna分子鑑定：
採用ctab法提取待鑑定菌株dj8a的基因組dna，採用細菌16srrna通用引物進行pcr擴增。將pcr產物送到上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。將測序結果提交genbank進行blast比對分析。
菌株dj8a的16srrna基因序列經測序(其序列如seqidno.1所示)、分析，比對，結果與已報導的發酵乳桿菌lactobacillusfermentumcect562(t)的16srrna基因序列同源性達到99.65％，鑑定其為發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其於2016年11月15日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓，郵編：510070，保藏編號：gdmccno.60112。
實施例4發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a產酸能力及抑菌能力考察
(1)產酸能力：將發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a進行活化培養48h，挑取單菌落分別接種至ph6.60和ph3.85的mrs液體培養基中，37℃厭氧培養15h，4℃，10000rpm離心10min，取上清液並測定ph值，以未接種的mrs液體培養基做同等處理，作為空白對照。
培養15h後，發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a可使ph6.60和ph3.85的mrs液體培養基ph分別降至4.49和3.34。
(2)抑菌能力：取發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發酵上清液，以大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為指示菌，以調至相應ph的mrs培養基為對照，以na作為培養基，使用牛津杯打孔法進行抑菌實驗。按1％接種量重新轉接大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，28℃，180rpm振蕩培養17h，其菌體濃度約為107cfu/ml，取培養好的大腸桿菌2ml或金黃色葡萄球菌2ml與200ml經融化後保持在45℃左右的na培養基混勻，在無菌平板上放置4個滅過菌的牛津杯，用無菌移液管吸取20ml覆蓋平板。凝固後取出牛津杯，分別加入100ul的乳酸菌上清液樣品或調至相應ph的mrs對照培養基，37℃培養24h，觀察結果。
本實驗結果表明，菌株dj8a的發酵上清液(ph4.49)對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果(表1，圖3，圖4)。
表1發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a發酵上清液的抑菌能力
實施例5發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a耐酸和耐膽鹽考察
配製ph2.0無膽鹽的mrs液體培養基和ph6.6且含0.3％膽鹽的mrs液體培養基，將在37℃已厭氧培養15h的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a菌液，按體積比1％接種量分別轉接至ph2.0的mrs液體培養基和含0.3％膽鹽的mrs液體培養基中，37℃厭氧培養3h和6h，取合適的稀釋倍數進行塗布平板，每組重複三個平行實驗，37℃培養48h後，選擇菌落數30-300範圍的平板進行菌落計數。
結果表明發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a可在ph3.0或含0.1％膽鹽環境下生長，在ph2.0或含0.3％膽鹽條件下處理3h，活菌數仍在107cfu/ml以上，處理6h，活菌數仍在106cfu/ml以上，說明菌株dj8a具有較強的耐酸和耐膽鹽能力(表2)。
表2發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a耐酸和耐膽鹽特性
序列表
廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
一種發酵乳桿菌及其應用
1
1
861
dna
發酵乳桿菌（lactobacillusfermentum）dj8a
1
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