一組伊貝母中的甾體皂苷類化合物的製作方法

2023-04-26 10:03:11 2

專利名稱：一組伊貝母中的甾體皂苷類化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及從伊貝母中分離得到的有效成分，特別是涉及伊貝母中的具有降壓、 抗膽鹼、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、鎮咳、祛痰和抗菌作用新的留體皂苷類化合物。
背景技術：
貝母屬是百合科的一種Fritillaria，包括多種重要的藥用植物，其藥用部位多為其地下鱗莖，貝母具有清熱潤肺，止咳祛痰的功效，據記載該屬約有130種。在我國其種類主要包括川貝母、浙貝母、伊貝母等。貝母中的化學成分現代研究主要集中在其生物鹼類成分，貝母中的生物鹼類成分主要包括，留體類生物鹼和異留體類生物鹼，這類成分是貝母降壓，鎮咳，解痙，平喘，抗膽鹼和抗炎作用的主要藥用物質基礎；但是隨著對貝母化學成分和藥理活性的研究的深入，發現貝母中還含有大量的多種類的皂苷類成分，而且這類成分的鎮咳和抗炎作用也是很強的。這就為貝母藥理活性的研究注入了新的思路。貝母的十八反研究也是中藥現代化的要求所在，近年來人們對十八反的作用機制的研究正在不斷的深入。百合科貝母屬Fritillaria包括多種重要的藥用植物，其藥用部位多為其地下鱗莖，貝母具有清熱潤肺，止咳祛痰的功效，據記載該屬約有130種，廣泛分布於北半球的歐、 亞及北美洲的溫帶地區，尤以地中海北岸、伊朗、土耳其等地區分布的種類最為豐富[1]。在我國其種類主要包括川貝母、浙貝母、伊貝母等。川貝母，歷版《中國藥典》收載川貝母為百合科植物川貝母、暗紫貝母、甘肅或稜砂貝母的乾燥鱗莖。川貝母生長於海拔3000-4000m 的山坡草叢或陰溼的小灌木叢中，主產於四川甘孜州、阿壩州及與青海、甘肅、西藏交界的地區。傳統上將川貝按鱗莖大小和植物來源分為松貝、青貝、爐貝。松貝和青貝主要來源於川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母，爐貝主要來源於稜砂貝母[2]。性味歸經川貝母苦、甘，微寒。 歸肺、心經。功能主治本品味苦，性微寒，歸肺經，具有清熱化痰止咳之功，可用於治療痰熱咳喘，咯痰黃稠之證；又兼甘味，故善潤肺止咳，治療肺有燥熱之咳嗽痰少而粘之證，及陰虛燥咳勞嗽等虛證；還有散結開鬱之功，治療痰熱互結所致的胸悶心煩之證，及瘰癧痰核等病；浙貝母系百合科貝母屬植物浙貝母的乾燥鱗莖。中醫認為其苦、寒，歸肺、心經，具有清熱散結、化痰止咳功能，主治風熱犯肺、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰癧和瘡毒 ]。伊貝母包括 伊犁貝母、費爾乾貝母、灘貝母等幾個品種，統稱為新疆貝母，是一種與川貝.浙貝齊名的貴重中藥材，生於海拔1300-1780m的林下或陽坡草地。主產新疆。伊犁貝母鱗莖圓錐形， 較大。表面稍粗糙，淡黃白色，外層鱗葉心臟形，肥厚，大小懸殊而緊密抱合。頂端稍尖，少有開裂，基部微凹陷。質稍鬆脆，斷面白色，粉性。氣微，味微苦。具有清熱潤肺、化痰止咳功效M。還有一種是土貝母，與以上不同的是它是是葫蘆科多年生攀援植物假貝母的塊莖，主產於河北、陝西、山西等地土貝母性涼而味苦，具有清熱解毒、消腫散結、消癰排膿等功效。對貝母的化學成分研究主要集中在它的生物鹼類成分。貝母中非生物鹼成分的文獻報導相對較少。目前已發現貝母中主要有效成分為異留體生物鹼與留體生物鹼。到目前為止已經分離並確定結構的有100餘個化合物，其中異留體生物鹼佔86%，膽留衍生物次之M。貝母化學成分的研究報導始見於1888年，Frganer首先從德旺貝母中分離到蒂貝靈[6]。從此，植物化學工作者就以貝母的鹼性成分為對象對許多種貝母進行了研究，到 20世紀50年代中期取得較大進展，朱子清教授等用硒脫氫降解的方法確定了貝母異街生物鹼的骨架溝通了貝母生物鹼與黎蘆生物鹼的關係生物鹼類成分[6]伊貝母中主要主要包括D，E環雙氫順式的西貝素和新留體生物鹼一新貝甲素等，其中D，E環雙氫順式西貝素屬西藜蘆鹼類(cevine groups)等。例如貝母辛(peimissine)，西貝素(Sipeimine)，新貝素甲，西貝素氮氧化物(ImperialineNoxide)，西貝素苷，伊貝辛(yibeissine)，伊貝鹼苷 B (yibeinoside B)，伊貝鹼苷 E (yibeinoside E)，Ν-Γ，4，-羥基 _1，，2，，3，，4，-四氫化奈基)-丙基-N-二苯基甲基-N-3，3-二甲基丁胺等等[7]；川貝母的主要成分為異留體類生物鹼和生物鹼。川貝生物鹼成分有川貝鹼、西貝素。青貝中有青貝鹼，白爐貝中有白爐貝素， 黃爐貝中有爐貝鹼。白松貝中有松貝鹼，甘肅貝母中有岷貝鹼，稜砂貝母中有新貝甲素、西貝素、貝母辛、瓊貝酮、代拉文酮、代拉夫林，暗紫貝母中有松貝辛，瓦布貝母中有西貝素、貝母辛、鄂貝乙素異浙貝甲素、西貝素等[2]。浙貝母的主要成分為浙貝甲素、浙貝乙素、異浙貝甲素、貝母辛、寧貝辛等。土貝母的化學成分主要包括皂苷，脂肪酸，糖類及其苷類成分和三萜類成分。非生物鹼類成分對貝母屬植物化學成分的研究主要集中在生物鹼上，而對非生物鹼成分的研究最早始於1944年，吳榮熙首先從浙貝母.鱗莖中分離到一種含輕基的化合物。迄今從貝母屬植物分到的非生物鹼有約40種，其中大多數都是低極性部分化學成分，主要是萜類、留體、脂肪酸、糖，嘌呤、嘧啶等類化合物，其中萜類化合物在貝母屬植物中分布最為廣泛。大極性化合物也有分離，主要包括核苷類成分、留體皂苷類成分以及糖類成分等。劉洪寧等[8]，在彭澤貝母中分離得到6個對映一貝殼杉類二萜化合物 ent-kauran-15-en-17-ol ；ent_kauran一15一en_3α，17一diol ；等β 貝新，ent-kauran-16 α， 17-diol ；ent-kauran-3,16 α ,17-triol ；ent-16,17-epoxy-kauran-3 α -ol ；曹新偉等 [9]從川貝母中分離的到8個核苷類成分尿嘧啶(uracil)，胞嘧啶(cytosine)，腺苷 (adenosine)，尿苷(uridine)，肌苷(carnine)，鳥苷(guanosine)，禾口胸苷(thymine)；張久亮等[κι]在湖北貝母的莖葉中分離的到，三種長鏈脂肪酸類化合物，β-谷留醇和β-胡蘿蔔苷；貝母水溶性成分還包括各種胺基酸。結合現代研究表明貝母總皂苷具有很強的祛痰作用；李萍等對11種商品貝母暗紫貝母，甘肅貝母，浙貝母，稜砂貝母，伊貝母，平貝母，湖北貝母等，總皂苷部分進行了鎮咳祛痰的活性篩選，進行氨水引咳試驗和酚紅排出試驗，結果表明總生物鹼部分具有明顯的祛痰作用。現代抗癌機制研究表明皂苷類成分已被體內外實驗證實有著良好的抗活性氧自由基活性，即又良好的抗促抗癌活性；而且研究表明皂苷可以通過抑制TPA誘導的32Pi結合於HeLa細胞的磷脂中發揮抗促癌作用β3]。因此我將對貝母總皂苷進行系統的分離，鑑定所得到的單體化合物，並對單體化合物進行抗癌活性以及其他活性的篩選，為尋找到新的抗癌藥物奠定實驗和理論基礎。但是，對貝母非生物鹼類成分的化學研究仍存在很多問題，沒有找到非生物鹼類成分發揮降壓、抗膽鹼、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、鎮咳、祛痰和抗菌作用的有效成分。我們通過對伊貝母進行系統、現代、科學的分離技術，得到了 9種留體皂苷類新化合物，其藥效活性強，說明其為貝母的主要有效成分，有望用於降壓、抗膽鹼、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、 鎮咳、祛痰和抗菌的藥物。以上成分，利用HPLC-MS分析證明，在各種貝母屬植物中也不同含量的含有，也是貝母屬植物的有效成分。通過單獨使用或加入各種製劑輔料(各種固體製劑、液體製劑、凝膠製劑、緩控釋製劑等)，或與其他中藥配伍，從而實現了其在藥物、功能食品、保健品和食品中的應用。

發明內容
1、本發明的目的提供一類從伊貝母中經過提取分離得到的化合物，其結構特徵如表1所示表1伊貝母中的9個新的留體皂苷類化合物及其鑑定方法
權利要求
1. 一組伊貝母中的留體皂苷類化合物，其結構特徵下
2.權利要求1的化合物，是從浙貝母、川貝母、伊貝母、湖北貝母、平貝母或安徽貝母藥材基原的貝母屬植物中提取的。
3.權利要求1的化合物在製備具有平喘、鎮咳、祛痰、解痙，抗菌、抗膽鹼、降壓等改善心腦血管、神經退行性疾病、解熱、鎮痛、抗炎、抗過敏反應、抗變態反應、風熱感冒、頭暈、抗肝纖維化、抗腫瘤、保護肝損傷、調血脂、降血糖、免疫增強、抗氧化作用、抗衰老作用的藥物中的應用。
4.含有權利要求1的化合物的組合物。
5.權利要求1的化合物，用於藥品、功能食品和食品的原料。
6.權利要求1化合物的製備方法，其特徵為，經過以下步驟將貝母的乾燥鱗莖^g，用體積分數為95%的乙醇提取三次每次3小時，溶劑用量為 10，10，8，合併濾液，減壓回收溶劑後得浸膏89. Og,將95%乙醇提取後的藥渣再經過體積分數為70%的乙醇提取提取三次每次3小時，溶劑用量為10，10，8，合併濾液，減壓回收溶劑後得浸膏98. Og,將所得浸膏加適量2L水分散，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取，每種溶劑均萃取三次，回收溶劑後得到石油醚層浸膏2. 2g、三氯甲烷層 3. 5g、乙酸乙酯層5. lg、正丁醇層26. Og,70%提取物正丁醇萃部分26. Og經矽膠吸附柱色譜(拌樣矽膠用量35. Og ；空白矽膠用量150. Og)，以三氯甲烷-甲醇系統QOO 1-1 1)梯度洗脫，每300ml收集一份，得到流份Fr. 1-216，在洗脫至氯仿-甲醇8 1時得到流份Fr. 108至Fr. 114，經薄層分析將其合併為Fr. 108-1142. 6g;在洗脫至氯仿-甲醇5 1時得到流份Fr. 141至Fr. 145，經薄層分析將其合併為Fr. 141-1451. 7g;在洗脫至氯仿-甲醇4 1時得到流份Fr. 146至 Fr. 169，經薄層分析將其合併為Fr. 146-1693. 2g，Fr. 108-114經ODS開放柱，依次用甲醇-水1 9，3 7,5 5,7 3,9 1洗脫， 每個梯度，洗脫溶劑用量為500ml，其中甲醇-水7 3洗脫部分得到浸膏1.2g，將這部分樣品溶於甲醇，上製備型HPLC，以75 %甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，得到化合物 318. 2mg，保留時間72. 5min,Fr. 141-145 經ODS 開放柱，依次用甲醇-水 1 9，3 7，5 5，6 4，7 3，9 1 洗脫，每個梯度，洗脫溶劑用量為500ml，，其中甲醇-水6 4洗脫部分得到浸膏0.7g，將這部分樣品溶於甲醇，上製備型HPLC，以69. 5%甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物229. %ig，保留時間11. 2min,Fr. 146-169 經 ODS 開放柱，依次用甲醇-水 1 9，3 7，5 5，6 4，7 3，9 1 洗脫，每個梯度，洗脫溶劑用量為700ml，其中甲醇-水6 4洗脫部分得到浸膏1.8g，將這部分樣品溶於甲醇，上HPLC製備，以30%乙腈-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物945. lmg，保留時間4. 3min, ODS開放柱，甲醇-水5 5洗脫部分得到浸膏 1. 3g，將這部分樣品溶於甲醇，上製備型HPLC，以57. 5%甲醇-水溶劑做為流動相，對樣品進行分離，由於這部分樣品成分較為複雜；因此，接峰情況是按照如下條件0-8min收集一份，回收溶劑得到AO. 5g,8-20min收集一份得，回收溶劑得到B 0. 3g,20-32min收集一份， 回收溶劑得到C 0. 05g, 32-37min收集一份，回收溶劑得到D 0. lg, 37-55min收集一份，回收溶劑得到E 0. 08g, 55-75min收集一份，回收溶劑得到F0. Ig,將B溶於甲醇，上HPLC製備，以50%甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物512. Omg，保留時間43. 7min,化合物66. Omg,保留時間40. 7min,將C溶於甲醇，上HPLC製備(儀器及參數設置同上述安捷倫液相，以53. 5%甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物710. lmg，保留時間15. 3min)，將D溶於甲醇，上製備型HPLC,以57%甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物125. %ig，保留時間17. 2min，化合物 814. Omg,保留時間36. 5min,將F溶於甲醇，上HPLC製備，以55%甲醇-水溶劑做為流動相，進行製備，減壓回收溶劑得到化合物48. Omg，保留時間24. 7min。
7.權利要求1的化合物的檢測方法，其特徵在於，方法如下分析方法=HPLC分析，以質譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢測、蒸發光散射檢測器等為檢測器，對照品溶液的配置權利要求1中留體皂苷類化合物化學對照品精密稱取適量，用甲醇配製成適量的對照品溶液，樣品溶液的配置精密稱取伊貝母藥材樣品(或者含有貝母藥材的藥品、食品等)各適量，用IOOml甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經裝填ODS的SPE小色譜柱預處理，甲醇(或乙腈、 乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)洗滌，合併洗脫液，甲醇溶解，定容，過濾，即得， 色譜流動相條件1)乙腈-水梯度洗脫2)甲醇-水梯度洗脫色譜柱十八烷基鍵合矽膠柱測試方法進行HPLC分析，以質譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢測、蒸發光散射檢測器等為檢測器，以樣品中各化合物的色譜峰面積，與標準對照樣品相應色譜峰面積，按照標準曲線法或外標1點法、外標2點法，進行定量分析，計算，即得。
8.權利要求1的化合物的檢測方法，其特徵在於，方法如下分析方法HPLC分析，以質譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢測、蒸發光散射檢測器等為檢測器，對照品溶液的配置權利要求1中留體皂苷類化合物化學對照品精密稱取適量，用甲醇配製成適量的對照品溶液，樣品溶液的配置精密稱取伊貝母藥材樣品適量，用IOOml甲醇提取，回收提取液，甲醇溶解，經裝填ODS的SPE小色譜柱預處理，甲醇洗滌，合併洗脫液，甲醇溶解，定容，過濾， 即得，色譜流動相條件1)乙腈-水梯度洗脫，洗脫條件如下表 _
全文摘要
本發明涉及從中藥伊貝母中提取的一組伊貝母中的甾體皂苷類化合物及其製備工藝和其平喘、鎮咳、祛痰等醫藥用途，其組合物可在藥物、功能食品和食品使用，所述化合物是從浙貝母、川貝母、伊貝母、湖北貝母、平貝母或安徽貝母藥材基原的貝母屬植物中提取得到的。
文檔編號A61P39/06GK102504006SQ20111028722
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者李國玉, 沈碩 申請人:李國玉