一種乳酸乳球菌誘變菌株及其培育方法
2023-04-26 10:23:26
專利名稱：一種乳酸乳球菌誘變菌株及其培育方法
技術領域：
本發明公開一種乳酸乳球菌誘變菌株， 為一種新的菌株品種，本發明還提供了該 菌株的培育方法，屬於微生物技術領域。
背景技術：
乳鏈菌肽是由乳酸乳球菌(lactococcus lactis)產生的一種小分子多肽物質，對 許多革蘭氏陽性菌，包括葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、分枝桿菌、利斯特氏菌和乳桿菌等有強 烈的抑制作用。乳鏈菌肽作為一種高效、天然、無毒的食品防腐劑，已經廣泛應用於肉類、魚 類、牛奶、乾酪、蛋類、水果、蔬菜、果汁飲料、啤酒釀造和豆製品等食品的防腐處理。隨著應 用研究的深入，乳鏈菌肽應用範圍已擴展到造紙、活性食品包裝、農業飼料、生殖避孕和醫 學移植等領域。在國外，乳鏈菌肽早就開始了工業化大生產，乳鏈菌肽的應用也很普遍。但我國在 此領域的研究比較落後，進入20世紀90年代後才對乳鏈菌肽進行系統研究，而且大多研究 集中在培養基和發酵過程的優化方面，乳鏈菌肽效價較低，是制約乳鏈菌肽大規模生產的 瓶頸。在本發明中，選育了一株高產乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株，對乳鏈菌肽的深入研 究和廣泛應用具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一種乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株，為一種新的菌株， 其產生的乳鏈菌肽效價和野生菌相比有顯著提高。本發明還提供了該菌株的培育方法，適用於工業化生產。本發明的乳酸乳球菌誘變菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心保藏，保藏日期2009年5月4日，登記號CGMCC NO. 3050，分類命名乳酸乳球菌乳亞 禾中，Lactoccuslactis subsp lactis。本發明所述的乳酸乳球菌菌株培育方法，包括以下步驟IMfLactococcus lactis subsp. lactis ATCCl 1454凍乾粉末接入液體小試管培 養基中進行活化後，轉接至液體搖瓶培養基中，30-38°C恆溫箱中培養8-24h，連續傳代5次 後，接種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養8h的 菌液，8000r/min離心lOmin，菌體用無菌水清洗兩遍，加30_50mL水，在有玻璃珠的三角瓶 中30°C振蕩lh，用血球計數板進行計數後，8000r/min離心10 min，取菌體沉澱；2)在菌體沉澱中加入-3% (ν/ν)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩衝液(使 菌體濃度為1 X IO8個/mL)，pH 7. 0，放入150r/min搖床振搖15_40min ；3)採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應，將誘變菌液逐級稀釋至IX IO6倍，塗 布乳鏈菌肽抗性梯度平板，30-38°C恆溫箱中培養8-24h，對乳鏈菌肽高產菌株進行初篩，採 用雙層瓊脂擴散法進行復篩；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復甦，30°C，150r/min恆溫搖床中培養8_24h，連續傳代10次，測定每代的乳鏈菌肽效價，即得。本發明所述的高產乳鏈菌肽突變株的特徵為
1)誘變菌株 SYZXD2 在玉米漿80-90mL，糖醪 10-15mL，KH2P04 l_2g，NaC10. 1-0. 5g， 配製成的IOOmL廢料發酵培養基中培養時，乳鏈菌肽的效價為5000-7000IU/mL，比野生菌 提高 3. 94-5. 51 倍。2)誘變菌株SYZXD2在葡萄糖15_20g/L，蛋白腖20_30g/L，酵母浸粉22_28g/L， NaC14-7g/L,KH2PO4 8_12g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 1-0. 5g/L 的化學試劑發酵培養基中培養時，乳 鏈菌肽的效價為8000-11000IU/mL，比野生菌提高6. 30-8. 66倍。3)誘變菌株SYZXD2最適發酵條件為培養溫度30-38 °C，搖瓶轉速120_180rpm， 裝液量80mL-110mL、接種量2_5%，初始pH值為6. 2-7. 5。本發明的積極效果在於誘變的乳酸乳球菌新菌株經10次以上傳代培養不退化， 具有遺傳穩定性，並且乳鏈菌肽的效價遠遠比野生菌高出許多倍。具體實施方法為了便於理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而 非對本發明的任何形式的限制。實施例1 (1)乳酸乳球菌的誘變將Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC11454 凍乾粉末接入液體小試管培 養基中進行活化後，轉接至液體搖瓶培養基中，37°C恆溫箱中培養12h，連續傳代5次後，接 種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養8h的菌液， 8000r/min離心lOmin，菌體用無菌水清洗兩遍，加入30mL水，在有玻璃珠的三角瓶中30°C 振蕩lh，用血球計數板進行計數後，8000r/min離心lOmin，取菌體沉澱，加入2% (使菌體 濃度為IX IO8個/mL,)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩衝液，pH 7. 0，放入150r/min 搖床振搖30min ；採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應，將誘變菌液逐級稀釋至IXlO6 倍，塗布乳鏈菌肽抗性梯度平板，37 °C恆溫箱中培養12h。(2)乳鏈菌肽高產菌株的篩選乳鏈菌肽抗性梯度平板的製備在無菌的平板中倒入15mL左右的下層固體培養 基，將平板的一端墊起，使培養基在平板上凝固成斜面，再倒入12. 5mL含乳鏈菌肽的上層 發酵固體培養基，將平板平放，等待凝固。含有乳鏈菌肽的上層固體發酵培養基的PH值用 2mol/L的HCl調到3. 5，105°C滅菌lOmin。待乳鏈菌肽抗性梯度平板上的菌落生長成熟後， 挑選乳鏈菌肽高濃度區的菌落挑到小試管液體培養基中進行活化，活化後經250mL搖瓶發 酵(裝液量為IOOmL)，雙層瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價。將乳鏈菌肽高產菌株挑選出來 並立即製成甘油管保存。再採用雙層瓊脂擴散法復篩。實施例2 以 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC11454 為出發菌株，利用 2%的硫酸 二乙酯進行誘變處理，採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應。利用乳鏈菌肽抗性梯度平 板法對誘變菌株進行篩選，獲得乳鏈菌肽高產誘變菌株SYZXD2。用工業廢料對乳鏈菌肽高 產菌株SYZXD2進行發酵培養基優化。通過單因素試驗方法確定工業廢料酒糟、玉米漿、糖 醪發酵生產乳鏈菌肽的最佳濃度，然後採用Box-Behnken設計及響應面分析法確定乳鏈菌肽的最佳廢料培養 基組分為玉米漿88mL，糖醪12mL，KH2PO4 1. 56g，NaCl 0. 25g，配製成 IOOmL的培養基，在此培養基的培養條件下乳鏈菌肽的效價為5590IU/mL。 實施例3 以 Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC11454 為出發菌株，利用 2%的硫酸 二乙酯進行誘變處理，採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應。利用乳鏈菌肽抗性梯度平 板法對誘變菌株進行篩選，獲得乳鏈菌肽高產誘變菌株SYZXD2。利用化學試劑對乳鏈菌肽 高產菌株SYZXD2的發酵培養基進行優化。將Plackett-Burman試驗設計，最陡爬坡試驗和 響應面分析法三種統計學方法綜合應用於乳鏈菌肽高產菌株SYZXD2發酵培養基的優化， 確定最佳的化學試劑培養基組分為葡萄糖19. 3g/L，蛋白腖28. 6g/L，酵母浸粉24. lg/L， NaCl 5. 9g/L，KH2PO4 10g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，在此培養基培養條件下，乳鏈菌肽效價為 10070IU/mL。實施例4 以Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC11454為出發菌株，利用 2%的硫酸二 乙酯進行誘變處理，採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應。利用乳鏈菌肽抗性梯度平板 法對誘變菌株進行篩選，獲得乳鏈菌肽高產誘變菌株SYZXD2。利用單因素試驗法對該菌株 的培養條件進行了優化。在廢料培養基中，該菌株的最佳培養條件為裝液量lOOmL、接種 量5%、培養溫度37°C、轉速160rpm、初始pH值為6. 5，乳鏈菌肽發酵時間為10h，在此培養 基條件下，乳鏈菌肽的效價為6500IU/mL。在化學試劑培養基中，該菌株的最佳培養條件為 裝液量lOOmL、接種量3%、培養溫度37°C、轉速150rpm、初始pH值為6. 8，乳鏈菌肽發酵時 間為8h，在此培養基條件下，乳鏈菌肽的效價為10100IU/mL。
權利要求
1.一種乳酸乳球菌誘變菌株，其保藏號為CGMCC NO. 3050。
2.獲得權利要求1所述乳酸乳球菌菌株的方法，包括以下步驟完成 IMfLactococcus lactis subsp. Iactis ATCCl 14M凍乾粉末接入液體小試管培養基中進行活化後，轉接至液體搖瓶培養基中，30-38°C恆溫箱中培養8-Mh，連續傳代5次後， 接種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養他的菌 液，8000r/min離心lOmin，菌體用無菌水清洗兩遍，加一定體積水，在有玻璃珠的三角瓶中 30°C振蕩lh，用血球計數板進行計數後，8000r/min離心lOmin，取菌體沉澱；2)在菌體沉澱中加入-3%(ν/ν)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩衝液(調節 使菌體濃度為1 X IO8個/mL)，pH 7. 0，放入150r/min搖床振搖15_40min ；3)採用25%硫代硫酸鈉進行終止誘變反應，將誘變菌液逐級稀釋至IXIO6倍，塗布乳 鏈菌肽抗性梯度平板，30-38°C恆溫箱中培養8-Mh，對乳鏈菌肽高產菌株進行初篩，採用雙 層瓊脂擴散法進行復篩；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復甦，30°C，150r/min恆溫搖床中培養8_Mh，連續傳代 10次，即得。
全文摘要
本發明提供一種乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株及其培育方法，以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454為出發菌株，通過硫酸二乙酯進行誘變處理，篩選獲得乳鏈菌肽高產誘變菌株，其保藏號為CGMCC NO.3050。該菌株在玉米漿、糖醪、KH2PO4、NaCl配製成的發酵培養基中培養時，乳鏈菌肽的效價為5000-7000IU/mL，比野生菌提高3.94-5.51倍。在葡萄糖、蛋白腖、酵母浸粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O的化學試劑發酵培養基中培養時，乳鏈菌肽的效價為8000-11000IU/mL，比野生菌提高6.30-8.66倍。本發明的乳酸乳球菌新菌株經10次以上傳代培養不退化，具有遺傳穩定性。
文檔編號C12N1/20GK102093962SQ20091006745
公開日2011年6月15日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者任曉冬, 蘭鵬飛, 姜麗豔, 孟慶繁, 李雪, 滕利榮, 王貞佐, 程瑛琨, 逯家輝, 馬富強 申請人:吉林大學