一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用的製作方法

2023-05-09 19:25:36 3

專利名稱：一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種兩親性高分子陽離子聚合物作
為siRNA轉染載體及用法。
背景技術：
RNA幹擾現象是利用siRNA靶向實現轉錄後水平基因沉默的現 象，RNAi是通過siRNA介導的特異性高效抑制基因表達途徑，由 siRNA介導識別並耙向切割同源性靶mRNA。 siRNA基因沉默技術 是治療各種基因相關疾病的最有效方法[1—6]。
研究表明，人工合成的具有21 22個核苷酸序列的siRNA沒有細 胞毒性，並且能夠有效的實現RNA幹擾並達到基因治療的目的7—9。 儘管如此，由於siRNA本身不能進入靶向進入病變組織的功能，在臨 床應用方面受到了極大的制約1—12。近年來，非病毒類陽離子基因 載體已經應用在了siRNA傳遞體系中，如PEG-PLL和PEG-PEI"3—141 。
PEI類載體已經被證明了在質粒轉染體系中具有很好的效果，並 在siRNA轉染方面也起到一定的作用，但是聚陽離子帶有的大量的正 電荷，當劑量增大時會與細胞表面有強烈的作用而導致細胞死亡，因 此，在PEI表面進行修飾遮蔽一部分正電荷能夠有效的降低細胞毒性
15-18

發明內容
本發明的目的是尋找低毒性，轉染效率高，靶向性和pH敏感性強的非病毒類基因載體。
本發明選用超支化聚乙烯亞胺改性的超支化聚乙烯亞胺(PEI)-聚穀氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG ，選取PEI-25k和 Lipofectamine2000作為對照，介導螢光素酶siRNA進行基因沉默。我 們發現PEI-PBLG相對PEI-25k能夠有效提高siRNA沉默效率，並降低
了細胞毒性。
本發明提供了一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用，其特徵在 於，所述的一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體；
所述的兩親性高分子陽離子聚合物是分子量為25000的超支化 聚乙烯亞胺(PEI)與聚穀氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG， 其中，所述的超支化聚乙烯亞胺與聚穀氨酸苄酯的質量比為6:4;所 述的兩親性高分子陽離子聚合物的尺寸為150-250nm;
所述的siRNA為沉默螢光素酶的Luc siRNA，其序列為 5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。對照物為Rev siRNA， 其序列為5, -AGCUUCAUGAGUCGCAUUCdTdT-3'。
所述的一種兩親性高分子陽離子聚合物的製法用參考文獻[19] 提供的方法製備。
本發明提供的一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染
載體的用法，步驟和條件如下
(1) 用常規方法合成siRNA;
(2) 兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒的製備 取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為lmg/mL，用孔徑為0.22nm的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配製濃度為O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子聚合物siRNA的質量比為1.25:1-40:1，將所述的兩親性高分子陽離子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶質質量比混合，把該混合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促進兩親性高分子陽離子聚合物與siRNA複合物顆粒的形成，得到一種含兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物顆粒；
(3) —種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體
(1) 細胞的培養
復甦細胞，在含有體積分數為10。/。的小牛血清的DMEM細胞培養液中並在含體積百分數為5%的C02、溫度為37。C的孵箱中連續培養；
(2) 體外轉染
轉染前24小時內，將細胞按lxlO"個細胞/孔種於96孔細胞培養板中，置於含體積百分數為5%的C02、溫度為37-C的孵箱中連續培養至80~90%融合；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次後，加入兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒，以及含有體積百分數為10%FBS的高糖DMEM培養液，繼續培養24小時，加入複合顆粒6h換液作為對照實驗。
(3) 體外轉染效率的測定
取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入5(HiL細胞裂解液裂解，吹打均勻後取出20pL至1.5mL離心管中，然後加入lOOpL螢光素底物，用光度計測定轉染效率；
再取出20nL裂解液至新96孔板，選用美國Pierce公司BCA蛋白檢測試劑盒，加入200PL檢測液，37'C孵育30分鐘後，酶標儀562nm波長檢測。
有益效果本發明提供了一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體及用法。本發明的兩親性高分子陽離子聚合物是一種非病毒類基因載體。其基因沉默效率高，且細胞毒性小。對恆定表達螢光素酶的CT26細胞的最高基因沉默效率為73.4%，相對於商品化的PEI-25k的10.1%和脂質體2000的34.5%有較大的提高，且明顯的降低了細胞毒性。在轉染後6h換液實驗中，對恆定表達螢光素酶的4T1細胞的最高轉染效率為63.7%，相對於商品化的PEI-25k的14.5%和脂質體2000的20.5%亦有較大提高，同時也顯示出其低毒性的特點。在瞬時轉染的Hela細胞實驗中，該兩親性高分子陽離子聚合物相對於商品化的PEI-25k和脂質體2000有較高的基因沉默效率和較小的細胞毒性。轉染後6h不換液對照試驗中，該兩親性高分子陽離子聚合物細胞毒性降低較小，而商品化的PEI-25k和脂質體2000降低相對較大。


圖1是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恆定表達螢光素酶的CT26細胞內的釋放，轉染後6h換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng爾L。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。圖2是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恆定表達螢光素酶的CT26細胞內的釋放，轉染後6h不換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng/pL。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。
圖3是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恆定表達螢光素酶的4T1細胞內的釋放，轉染後6h換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng爾L。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。
圖4是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恆定表達螢光素酶的4T1細胞內的釋放，轉染後6h不換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng/pL。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。
圖5是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在瞬時表達螢光素酶的Hela細胞內的釋放，轉染後6h換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng/pL。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。
圖6是脂質體2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在瞬時表達螢光素酶的Hela細胞內的釋放，轉染後6h不換液。橫坐標表示材料與siRNA的質量比，siNRA的終濃度為2ng/pL。轉染24h後檢測螢光素酶表達量。
具體實施例方式
實施例1:利用兩親性高分子陽離子聚合物介導沉默螢光素酶的Luc siRNA和陰性對照Rev siRNA對恆定表達螢光素酶的CT26細胞的體外轉染
(1) 用常規方法合成siRNA;
(2) 兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒的製備取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為
lmg/mL，用孔徑為0.22nm的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配製濃度為O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子聚合物siRNA的質量比為1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1，將所述的兩親性高分子陽離子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶質質量比混合，把該混合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促進兩親性高分子陽離子聚合物與siRNA複合物顆粒的形成，得到一種含兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物顆粒；
(3) —種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體
(1) 細胞的培養
復甦恆定表達螢光素酶的CT26細胞，在含有體積分數為10%的小牛血清的高糖DMEM細胞培養液中並在含體積百分數為5%的C02、溫度為37。C的孵箱中連續培養；
(2) 體外轉染
轉染前24小時內，將細胞按^104個細胞/孔種於96孔細胞培養板中，置於含體積百分數為5%的C02、溫度為37'C的孵箱中連續培養至80~90%融合；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次後，加入兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒，以及含有體積百分數為10% FBS的高糖DMEM培養液， 繼續培養24小時，加入複合顆粒6h換液作為對照實驗。 (3)體外轉染效率的測定
取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入50pL細胞裂解 液裂解，吹打均勻後取出2(HiL至1.5mL離心管中，然後加入10(HiL 螢光素底物，用光度計測定轉染效率；
再取出20pL裂解液至新96孔板，選用美國Pierce公司BCA蛋 白檢測試劑盒，加入200WL檢測液，37'C孵育30分鐘後，酶標儀562nm 波長檢測。
圖1,2分別給出了兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物對 恆定表達螢光素酶CT26細胞轉染6小時後換液與不換液的基因沉默 效率實驗結果
由圖1可見，螢光素酶螢光強度活性的測定取決於Luc siRNA和 Rev siRNA，其中Luc siRNA能與耙向mRNA特異性結合，而Rev siRNA作為陰性對照不能與耙向mRNA特異性結合。未加聚合物和 siRNA的細胞作為陽性對照。螢光強度的降低取決於加入了 Luc siRNA而不是陰性對照Rev siRNA，如果加入兩種siRNA細胞的熒 光強度均降低了，則是由於載體的毒性而導致了細胞死亡。在不產生 細胞毒性條件下，單純PEI-25k介導的siRNA基因沉默效率不高，最 高只能達到10.1%，只加siRNA不產生基因沉默，脂質體2000介導 siRNA效果比較明顯，能夠產生將近34.5%的沉默效率，但是可以看 出脂質體2000細胞毒性較大，而PEI-PBLG介導的siRNA基因傳最高能產生73.4%基因沉默效率，且其毒性較小。
由圖2可見，轉染6小時不換液後載體的毒性均略有增加，脂質 體2000和PEI-25k增加較快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，能達到 75.2%，而脂質體和PEI-25k分別為55.5%和12.6%，只加siRNA沒
有沉默效果。
實施例2:利用兩親性高分子陽離子聚合物介導沉默螢光素酶的 Luc siRNA和陰性對照RevsiRNA對恆定表達螢光素酶的4Tl細胞的
體外轉染
(1) 用常規方法合成siRNA;
(2) 兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒的製備 取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為
lmg/mL，用孔徑為0.22jim的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配製 濃度為0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子 聚合物siRNA的質量比為1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1， 將所述的兩親性高分子陽離子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上 述溶質質量比混合，把該混合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促 進兩親性高分子陽離子聚合物與siRNA複合物顆粒的形成，得到一 種含兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物顆粒；
(3) —種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體 (1)細胞的培養
復甦恆定表達螢光素酶的4T1細胞，在含有體積分數為10%的 小牛血清的低糖DMEM細胞培養液中並在含體積百分數為5%的C02、溫度為37'C的孵箱中連續培養；
(2) 體外轉染
轉染前24小時內，將4T1細胞按1"04個細胞/孔種於96孔細 胞培養板中，置於含體積百分數為5%的C02、溫度為37'C的孵箱 中連續培養至80~90%融合；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板 中的培養液，用PBS洗滌兩次後，加入兩親性高分子陽離子聚合物 /siRNA複合顆粒，以及含有體積百分數為10% FBS的低糖DMEM 培養液，繼續培養24小時，加入複合顆粒6h換液作為對照實驗。
(3) 體外轉染效率的測定
取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入5(HiL細胞裂解 液裂解，吹打均勻後取出2(HiL至1.5mL離心管中，然後加入10(HiL 螢光素底物，用光度計測定轉染效率。
再取出20pL裂解液至新96孔板，選用美國Pierce公司BCA蛋 白檢測試劑盒，加入200WL檢測液，37-C孵育30分鐘後，酶標儀562nm 波長檢測。
圖3,4分別給出了兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物對 恆定表達螢光素酶4T1細胞轉染6小時後換液與不換液的基因沉默效 率實驗結果
由圖3可見，螢光素酶螢光強度活性的測定取決於Luc siRNA 和Rev siRNA，其中Luc siRNA能與耙向mRNA特異性結合，而Rev siRNA作為陰性對照不能與靶向mRNA特異性結合。未加聚合物和 siRNA的細胞作為陽性對照。螢光強度的降低取決於加入了 LucsiRNA而不是陰性對照Rev siRNA，如果加入兩種siRNA細胞的熒 光強度均降低了，則是由於載體的毒性而導致了細胞死亡。在不產生 細胞毒性條件下，單純脂質體2000和PEI-25k介導的siRNA基因沉 默效率不高，最高只能分別達到14.5%和20.5%，且產生較大的細胞 毒性，只加siRNA不產生基因沉默，而PEI-PBLG介導的siRNA基 因傳遞最高能產生63.7%基因沉默效率，且其毒性較小。
由圖4可見，轉染6小時不換液後載體的毒性均略有增加，脂質 體2000和PEI-25k增加較快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，能達到 65.2%，脂質體和PEI-25k分別為9.5Q/o和11.4%，只加siRNA沒有沉 默效果。
實施例3利用兩親性高分子陽離子聚合物介導沉默螢光素酶的 Luc siRNA和陰性對照Rev siRNA對Lipofectamine2000轉染螢光素 酶質粒pGL3-contro1在HeLa細胞內瞬時表達螢光素酶的體外轉染實 驗
(1) 用常規方法合成siRNA;
(2) 兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒的製備 取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為
lmg/mL，用孔徑為0.22jmi的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配製 濃度為0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子 聚合物siRNA的質量比為1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1， 將所述的兩親性高分子陽離子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上 述溶質質量比混合，把該混合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促進兩親性高分子陽離子聚合物與siRNA複合物顆粒的形成，得到一 種含兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物顆粒；
(3) —種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體
(1) 細胞的培養
復甦Hela細胞，在含有體積分數為10%的小牛血清的高糖 DMEM細胞培養液中並在含體積百分數為5y。的(302、溫度為37。C 的孵箱中連續培養；
(2) 體外轉染
轉染前24小時內，將HeLa細胞按^104個細胞/孔種於96孔培 養板中，置於含體積百分數為5%的C02、溫度為37'C的孵箱中連 續培養至80~90%融合。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的 培養液，用PBS洗滌兩次後，加入脂質體2000/pGL3-control複合顆 粒轉染3h，使Hela細胞瞬時表達螢光素酶，吸掉培養板內液體後， PBS洗滌兩次，再加入兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒， 以及含有體積百分數為10% FBS的高糖DMEM培養液，繼續培養 24小時，加入複合顆粒6h換液作為對照實驗。
(3) 體外轉染效率的測定
取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入50nL細胞裂解 液裂解，吹打均勻後取出20nL至1.5mL離心管中，然後加入lOO^L 螢光素底物，用光度計測定轉染效率。
再取出20pL裂解液至新96孔板，選用美國Pierce公司BCA蛋 白檢測試劑盒，加入200PL檢測液，37'C孵育30分鐘後，酶標儀562nm波長檢測。
圖5,6分別給出了兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合物對 瞬時表達螢光素酶的Hda細胞轉染6小時後換液與不換液的基因沉 默效率實驗結果
由圖5可見，螢光素酶螢光強度活性的測定取決於Luc siRNA 和Rev siRNA，其中Luc siRNA能與靶向mRNA特異性結合，而Rev siRNA作為陰性對照不能與靶向mRNA特異性結合。未加聚合物和 siRNA的細胞作為陽性對照。螢光強度的降低取決於加入了 Luc siRNA而不是陰性對照Rev siRNA，如果加入兩種siRNA細胞的熒 光強度均降低了，則是由於載體的毒性而導致了細胞死亡。在不產生 細胞毒性條件下，單純PEI-25k介導的siRNA基因沉默效率不高，只 加siRNA不產生基因沉默，脂質體2000介導siRNA效果比較明顯， 但是可以看出脂質體2000細胞毒性較大，而PEI-PBLG介導的siRNA 基因傳遞最高能產生較高的基因沉默效率，且其毒性較小。
如圖6可見，轉染6小時不換液後載體的毒性均略有增加，脂質 體2000和PEI-25k增加較快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，且產生 最小的細胞毒性，只加siRNA沒有沉默效果。本發明涉及的參考文獻.- M.T.McManus,P.A.Sharp,Gene silencing in mammals by small interfering RNAs,Nat.Rev,Genet 2002; 3: 737—747. J.W.Shiver,T.M.Fu,L.Chen,D.R.Casimiro,M.E.Davies，R.K.Evans，et
al.Replicationincompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virusimmunity,Nature 2002;415:331—335. D.M.Dykxhoorn，C.D.NovinajP.A.Sharp,Killing the messenger:short RNAs that silence gene expression,Nat.Rev.,Mol.Cell Biol 2003;4:457~467. J丄ieberman,E.Song，S.K丄ee,P.Shankar，Interfering with disease: opportunities and roadblocks to harnessing RNA interference,Trends Mol. Med 2003;9:397~403. E.Song,S.K丄ee,J.Wang,N.Ince,N.Ouyang,J.Min,et al.,RNA interference targeting Fas protects mice from fUlminant hepatitis,Nat.Med.2003;9:347—351. Sun Hwa Kim，Ji Hoon Jeong,Soo Hyeon Lee, Sung Wan Kim^Tae Gwan Park丄ocal and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer,Joumal of Controlled Release 2008;129:107-116. A.L.Gartel,E.S.Kandel,RNA interference in cancer，Biomol. Eng 2006;23:17-34. [8] Y.Dorsett,T.Tuschl,siRNAs:applications in flmctional genomics and potential as
therapeutics，Nat.Rev.Drug Discov 2004;3:318—329. [9] G.J.Hannor^RNA interference,Nature 2002;418:244-251. [lO]P.Y丄u,F.Xie，M.C.Woodle，In vivo application of RNA interference:from
functional genomics to therapeutics, Adv.Genet 2005;54:117—142. M.Oishi,Y.Nagasaki,K.Itak^N.NishiyamajK.Kataok^Lactosylated poly(ethylene glycol卜siRNA conjugate through acid-labile beta-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells,J.Am.Chem.Soc 2005; 127:1624~1625. S.H.Kim3. Mok，J.H.Jeong,S.W.Kim,T.G.Par、Comparative evaluation of targetspecific GFP gene silencing efficiencies for antisense ODN, syntheticsiRN入and siRNA plasmid complexed with PEI-PEG—FOL conjugate,
Bioconjug.Chem 2006;17:241-244. [13]R.M.Schiffelers,A. Ansari，J.Xu,Q.Zhou，Q.Tang,G.Storm，et al.,Cancer siRNA
therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized
nanoparticle,Nucleic Acids Res 2004;32:el49. [14] S.H.Kim,J.H.Jeong,K.C.Cho，S.W.Kim,T.G.Park^Target-specific gene silencing
by siRNA plasmid DNA complexed with folate-modified
poly(ethylenimine),J.Control.Release 2005;104:223-232. [15〗Boussif,O,Lezoualc，h,F,Zanta，M.A.,Mergny,M.D，Scherman,D,Demeneix,B.,and
Behr,J.P.A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in
culture and in vivo:polyethylenimine.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A
1995;92:7297-7301. Zou,S.M.,Erbacher,P,Remy，J.S.,and Behr，J.P. Systemic linear polyethylenimine (L-PEI)-mediated gene delivery in the mouse.J. Gene Med 2000;2:128-134. Hassani,Z,Lemkine，G，Erbacher,P，Palmier，K, Alfama,G,Giovannangeli,C,Behr,IP, and Demeneix,B.A.Lipid-mediated siRNA delivery down-regulates exogenous geneexpression in the mouse brain at picomolar levels. J. Gene Med 2005;7:198-207. Grayson,A.C，Doody,A M,and Putnan^D Biophysical and structural characterization of polyethyleniminemediated siRNA delivery in vitro Pharm. Res 2006;23:1868-1876. H.Y.Tian, C Deng, H丄h^ J.R.Sun, M.X.Deng, X.S.Chen, X.B.Jing, Biomaterials 2005;26:4209~4217.
權利要求
1.一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用，其特徵在於，所述的兩親性高分子陽離子聚合物用作siRNA轉染載體；所述的兩親性高分子陽離子聚合物是分子量為25000的超支化聚乙烯亞胺與聚穀氨酸苄酯的共聚物超支化聚乙烯亞胺-聚穀氨酸苄酯；所述的超支化聚乙烯亞胺與聚穀氨酸苄酯的質量比為6∶4；所述的兩親性高分子陽離子聚合物的尺寸為150-250nm；所述的siRNA為沉默螢光素酶的Luc siRNA，其序列為5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。
2. 如權利要求1所述的一種兩親性高分子陽離子聚合物作為 siRNA轉染載體，其用法的步驟和條件如下(1) 用常規方法合成siRNA;(2) 兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA複合顆粒的製備 取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為lmg/mL，用孔徑為0.22nm的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配製 濃度為O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子 聚合物siRNA的質量比為1.25:1 40:1，將所述的兩親性高分子陽離 子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶質質量比混合，把該混 合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促進兩親性高分子陽離子聚合 物與siRNA複合物顆粒的形成，得到一種含兩親性高分子陽離子聚 合物/siRNA複合物顆粒；(3) —種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體(1) 細胞的培養復甦細胞，在含有體積分數為10。/。的小牛血清的DMEM細胞培 養液中並在含體積百分數為5%的C02、溫度為37。C的孵箱中連續 培養；(2) 體外轉染轉染前24小時內，將細胞按^104個細胞/孔種於96孔細胞培養 板中，置於含體積百分數為5%的C02、溫度為37'C的孵箱中連續 培養至80 90%融合；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培 養液，用PBS洗滌兩次後，加入兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA 複合顆粒，以及含有體積百分數為10% FBS的高糖DMEM培養液， 繼續培養24小時，加入複合顆粒6h換液作為對照實驗；(3) 體外轉染效率的測定取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入5(HiL細胞裂解 液裂解，吹打均勻後取出20pL至1.5mL離心管中，然後加入lOO^L 螢光素底物，用光度計測定轉染效率；再取出20pL裂解液至新96孔板，選用美國Pierce公司BCA蛋 白檢測試劑盒，加入200叱檢測液，37"C孵育30分鐘後，酶標儀562nm 波長檢測。
全文摘要
本發明涉及一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用，該聚合物用作siRNA轉染載體。該聚合物是一種非病毒類基因載體。其基因沉默效率高，且細胞毒性小。對恆定表達螢光素酶的CT26細胞的最高基因沉默效率為73.4％；在轉染後6h換液實驗中，對恆定表達螢光素酶的4T1細胞的最高轉染效率為63.7％。在瞬時轉染的Hela細胞實驗中，該兩親性高分子陽離子聚合物相對於商品化的PEI-25k和脂質體2000有較高的基因沉默效率和較小的細胞毒性。轉染後6h不換液對照試驗中，該兩親性高分子陽離子聚合物細胞毒性降低較小。
文檔編號C12N15/87GK101638668SQ200910067480
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月2日 優先權日2009年9月2日
發明者夏加亮, 景遐斌, 琳 林, 田華雨, 郭兆培, 傑 陳, 磊 陳, 陳學思 申請人:中國科學院長春應用化學研究所