用於檢測前列腺癌的抗膜聯蛋白a3單克隆抗體的製作方法

2023-05-10 10:43:51

專利名稱：用於檢測前列腺癌的抗膜聯蛋白a3單克隆抗體的製作方法
用於檢測前列腺癌的抗膜聯蛋白A3單克隆抗體
本發明涉及診斷前列腺癌的方法，包括用高度特異性抗體(尤其 是用單克隆抗體)測定膜聯蛋白A3 (尤其是胞外膜聯蛋白A3)。本發 明還涉及含所述抗體的檢測試劑。
前列腺癌對於男性而言，儘管和其他腫瘤相比只具中等生物學侵 襲力，但卻在惡性病發病率中排首位，在癌症引發的死亡中排第二 (Greenlee等人，2000 )。對於擴散前的前列腺癌有很好的治療方法， 即手術(Huland， 2001a)和/或放射療法(Wiegel， 1998 ),但對於 晚期病例只能使用暫時有效的激素消融法。激素消融療法中原發病發 展到新階段(通常在2-3年後)被稱為激素難治期(Hormone refractory state)。目前對於激素難治型前列腺癌只可用姑息性療法(Knox & Moore， 2001)。
因此，前列腺癌的早期診斷至為重要。可用高度敏感的血清腫瘤
才示^己--前歹寸腺特異小生抗原(PSA， prostate—specific antigen)進
行初期診斷(Stamey等人，1987 )，並對前列腺癌進行隨診(Haese 等人，1999 )。
因為PSA在很大程度上具有器官特異性，但非腫瘤特異性，良性 前列腺疾病也可伴有PSA升高，大於4 ng/ml被認為是上限。隨後從 直腸所得的至少10個侵入性前列腺鑽取活組織檢查為目前確診前列 腺癌的黃金標準(Miller & Wei P bach， 1999a，b)。達到25%的患者 病情複雜，其中一些需要進一步會診(13%的患者)及必要的住院檢查 (約6%的感染患者)(Lujan等人，2001: Djavan等人，2001 )。除 患尿道感染或前列腺炎的風險外，手術引發的出血和痛苦也是不希望 見到的現象，而這在一些機構中僅用局部麻醉來緩解(Irani等人， 1997; Issa等人，2000: Alavi等人,2001 )。 PSA指標在4-10 ng/ml 之間的患者中，有約75%的病例其鑽取活組織檢查為陰性，這是良性診斷結果(Huland, 2001b)。如果像目前一些學者所建議的(Djavan 等人，1999; 0kihara等人，2001 )，將進行前列腺鑽取活組織檢查 的PSA指標的起始值定為2. 5ng/ml， 50到75歲的男性每四人中就有 一人要經受所述侵入性體格檢查(Huland, 2001b)。
因此比PSA特異性高的新標記(包括它的亞型)(Jung等人，2001; Makinen等人，2001 )對前列腺癌的診斷很有利，因為它們可以更好 地定義進行侵入性鑽取(punch )活組織檢查的指標，從而減少必須經 受所述檢查的患者數。因此新近鑑定出也適合於以非侵入性方式得到 的具有高度的特異性的探針物質(如血漿或exprimate尿(exprimate urine))的腫瘤標記——膜聯蛋白A3 (ANXA3)標記(Wozny等人， 2006)。
ANXA3是膜聯蛋白家族中的罕見類型，是一類通過結合特定磷脂 來起作用的Ca"效應蛋白。它們可在膜表面形成網絡，從而為相互作 用的蛋白構造膜微域和募集灶(Gerke等人，2005 )。
因此膜聯蛋白在細胞分化、細胞遷移以及免疫調節中起重要作用。 除膜結構和膜運輸外，膜聯蛋白也參與不依賴於膜和磷脂的蛋白相互 作用(Rescher & Gerke 2004.， Gerke & Moss， 2002 )。膜聯蛋白也 作為基質小泡的重要組分參與軟骨形成和骨礦化過程(Wang等人，
2003 )。前列腺癌中成骨性轉移瘤的異常發生頻率使ANXA3的差異表 達有特殊意義(Keller等人，2001 )。
ANXA3既可存在於細胞內也可存在於細胞外(Carlson等人，
2004 ),例如尿液中的外來體(exosome)中(Pisitkun等人，2004 )。 外來體是所謂的"多泡體"(multivesicular bodies)的衍生物，在 免疫細胞抗原呈遞過程中起著替代但決定性的作用(Schartz等人， 2002 )。尿液中檢測到的外來體可能與早先資料中描述的前列腺小體 相同(Arienti等人，2004; Utleg等人，2003 )，它們都含有ANXA3。
US 2005 130 876、 W0 03 086 461、 W0 2005 078 124、 EP 05 011 042. 8和EP 05 026 092. 6中描述了用於治療或診斷前列腺癌和其他 泌尿生殖道上皮癌的蛋白生物標記。然而，之前用於測定ANXA3的方法短於與其他膜聯蛋白的強交叉 反應所致的可用抗體的低特異性。因此，本發明的目的即為提供一種 檢測前列腺癌的方法，所述方法可在病症早期進行高度特異性診斷。
首先，本發明涉及診斷癌症的方法，其中用膜聯蛋白A3(ANXA3) 的特異性抗體分析樣品中膜聯蛋白A3的存在和/或含量，所述抗體與 其他膜聯蛋白的交叉反應低。
其次，本發明是用於診斷癌症的檢測試劑，包含至少一種膜聯蛋 白A3的特異性抗體，所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
再次，本發明是藥物組合物，包含作為活性成分的膜聯蛋白A3 的特異性抗體，所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低，可用於生產 用於治療癌症的藥物。
本發明還是膜聯蛋白A3的特異性抗體，所述抗體與其他膜聯蛋白 的交叉反應低。
本發明還是細胞，尤其是產生上述抗體的雜交瘤細胞。
本申請所用術語"抗體"也包括含至少一個抗原結合域的抗體片 段，例如Fab片段或F(ab， )2片段，或重組抗體如單鏈抗體或其片段， 如Fv片段。
銀染後用密度計分析蛋白印記優選檢測不到所述抗體與其他膜聯 蛋白(如膜聯蛋白5、膜聯蛋白6和/或膜聯蛋白8)發生交叉反應。 抗體優選為單克隆抗體或單克隆抗體的混合物。所述單克隆抗體可為 嵌合單克隆抗體或通過人源化非人源恆定區與任選的可變框區得到的 人源化單克隆抗體。但一些高度特異性多克隆抗血清也適用於本發明 的方法。
可通過用純化的ANXA3或其片段(尤其是其N-末端片段)免疫實 驗動物(例如小鼠、大鼠、兔子等)，並根據標準方法獲得產生所需 單克隆抗體的雜交瘤細胞而得到優選的單克隆抗體。抗體更優選針對 人膜聯蛋白A3N-末端的表位(也可稱為膜聯蛋白III、脂皮素III、 胎盤抗凝蛋白III (PAP-III) 、 35-oc鉀介蛋白、或肌醇-l，2-環磷酸 鹽一2一磷酸水解酶)，尤其是人膜聯蛋白A3的胺基酸1-16的區域
9(GenBank Accession No. P12429 )。抗體優選結合癌細胞表面。
可通過用純化的ANXA3或其片段(尤其是含有N-末端16個氨基 酸(如片段ANX A3 (胺基酸1-324 ) 、 ANX A3 (胺基酸1-159)或 ANX A3 (胺基酸1-106))的片段)免疫實驗動物(如小鼠、大鼠、 兔子等)並根據標準方法獲得產生所需單克隆抗體的雜交瘤細胞而得 到優選的單克隆抗體。如上所述，可通過使用上述或相似用於特異性 結合ANXA3的N末端部分的單克隆抗體的表位定位和相應篩選的片段 的篩選方法得到具有所需特異性的單克隆抗體。尤其優選仍將天然人 ANXA3 (如從人嗜中性粒細胞分離的)用作產生單克隆抗體的免疫原。 還可從人類個體(例如人類癌症患者或其他個體)得到優選的針 對ANXA3的人單克隆抗體。可根據標準方法從所述個體分離產生抗體 的B細胞。在尤其優選的實施方案中，抗體選自由雜交瘤細胞系tgc 5 ProII6G7 (DSM ACC2778 ) 、 tgc 6 ProIIIlGll ( DSM ACC2779 ) 、 tgc 7 ProVII5C5 ( DSM ACC2780 ) 、 tgc 8 ProIIIlEl (DSM ACC2781 )、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7產生 的單克隆抗體或與膜聯蛋白A3上的相同表位結合的單克隆抗體。可根 據標準方法通過竟爭實驗來確定與所述相同表位結合的抗體。根據布 達佩斯條約，已將上述雜交瘤細胞繫於2006年5月5日(DSMACC2778、 DSM ACC2779、 DSM ACC2780和DSM ACC2781 )和2007年6月5日(tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7 )保藏在 位於不倫瑞克(Braunschweig) D-38124的Mascheroder weg lb的 DMSZ (Deutsche Sammlung f ii r Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中。
(i )在更優選的實施方案中，所述抗體是針對膜聯蛋白A3上的 表位的單克隆抗體，包含選自下列的序列或具有至少6個胺基酸的其 部分鄰接序列VRDYPDFSPSVD ( SEQ ID NO: 1);
(ii) MLISILTERSNA (SEQ ID NO: 2);
(iii) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ (SEQ ID NO: 3);
(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO: 4);(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO: 5);
(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL (SEQ ID NO: 6)。
SEQ ID NO: 1的尤其優選的部分序列是DYPDFSPSV。 SEQ ID NO: 2的尤其優選的部分序列是LISILTERS。 SEQ ID NO: 3的尤其優選的 部分序列是FRKALL或SLKVDEHLA。 SEQ ID NO: 4的尤其優選的部分序 列是TFDEYRNIS。 SEQ ID NO: 5的尤其優選的部分序列是SRSEIDLLD。 SEQ ID NO: 6的尤其優選的部分序列是AIKSDTSGDYEI。針對SEQ ID NO: 1的表位的一個抗體實例是tgct ProVII 5C5 (DSM ACC2780 )。針對 SEQ ID NO: 2的表位的一個抗體實例是tgc5 ProII 6G7 (DSMACC2778 ) 和tgc6 ProIII 1611 (DSM ACC2779 )。針對人ANXA3的C-末端區域 的表位的抗體實例是tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4Bll和tgc 14 ProVIII/3D7。尤其優選的抗體針對SEQ ID NO: 5和/或SEQ ID NO: 6的表位。
可通過用多肽或包含表位序列的肽(如重組人ANXA3、來自其他 物種的同源多肽或其片段)免疫實驗動物而得到針對SEQ ID NO: 1-6 的所述表位的其他抗體。
可根據本發明診斷的癌症優選為泌尿生殖道和/或胃腸道癌，例如 前列腺癌、膀胱癌、腎癌、尿道癌、卵巢癌、子宮癌或結腸癌。所述 癌症尤其是上皮癌。在尤其優選的實施方案中，所述癌症為前列腺癌。
可以任何適合的免疫學檢測手段實現本發明的方法。在一些檢測 手段中可優選使用帶有標記基團的抗體，例如帶有乳膠珠或金珠、熒 光標記基團、酶標記基團等可視標記。可根據標準方法製備抗體和標 記基團的綴合物，例如將標記基團通過雙官能團間隔分子共價偶聯到 抗體的活性胺基酸側基，如羧基、氨基和/或巰基等。
優選從人類受試者獲得樣品。在尤其優選的實施案列中，本發明 的方法為非侵入性診斷方法，其中所述樣品可為尿樣(尤其是 exprimate尿樣)或糞樣。如需要，也可用如凝膠過濾等方法對樣品 進行預處理。
可對樣品進行分級分離以分別測定胞外和胞內ANXA3。例如，可通過離心樣品獲得細胞沉澱和上清，從而可測定細胞沉澱中的胞內膜
聯蛋白A3和上清中的胞外膜聯蛋白A3。在尤其優選的實施方案中， 包括選擇性測定胞外ANXA3。
在進一步的實施方案中，本發明的方法可為組織化學方法，其中 所述樣品可為組織樣品、尤其是活組織(例如鑽取的活組織)。在組 織化學方法中，可通過測定樣品中ANXA3定位選擇性測定胞外ANXA3。
本發明的方法中，當與患有多種症狀(包括良性前列腺增生(BPH )、 纖維化、慢性前列腺炎、不同時期的前列腺上皮內瘤(PIN1-3))的 非癌症患者相比，在4氐速離心後的才羊品(如exprimate尿)上清或相 應沉澱中的胞外ANXA3豐度降低，則認為所述樣品指示癌症(如前列 腺癌)。與完全健康的患者相比，沉澱和上清中的ANXA3豐度似乎都 增高。總之，本發明包括exprimate尿上清和/或沉澱中的ANXA3總量 或濃度的任何比率或組合，所述比率或組合用於診斷上述不同症狀。
本發明基本嚢括了可通過任何一種差速離心得到的多種胞內和胞 外樣品組分(如exprimate尿)中ANXA3豐度的任何閾值及用於診斷 目的的相關比率。
本發明的方法還包括測定其他癌症標記(如癌症標記)。可在相 同樣品(測定ANXA3)或不同樣品(如血液、血清和/或血漿樣品)中 測定所述其他標記。尤其優選的測定血液、血清或血漿標記，尤其是 測定至少一個激肽蛋白酶家族成員(如前列腺特異性抗原(PSA))和 /或至少一種上皮細胞標記(尤其是前列腺特異性膜抗原(PSMA))。
本發明的診斷方法可包括病期確定，其中區別如PIN的癌前期和 癌期。基於臨床病理學家的組織學分級確定病期，根據Gleason評分 對前列腺癌進行標準分級。也有其他分期方法將癌症分為逐級嚴重的 三級。目前為止，這些分期方法主要依靠形態學標準且需要有經驗的 專家。上文已提到包括良性前列腺增生(BPH)、纖維化、慢性前列腺 炎變化、不同時期的前列腺上皮內瘤(PIN1-3)的非癌症病例。本發 明涉及通過使用來自exprimate尿或任何其他樣品的任何類型的組分 的合適的閾值的ANXA3相關值對前列腺癌或前列腺相關非癌期進行分
12級。
本發明還涉及上述抗體在如製備用於治療癌症藥物中的醫藥用 途，所述癌症尤其是上述生殖泌尿道和/或胃腸道癌，更尤其是前列腺 癌。本發明此實施方案中，所述抗體優選是嵌合抗體或含有人恆定區
(如人IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4恆定區)和任選的人源化框架區的 人源化單克隆抗體。所述抗體也可為可從血清或人類個體得到的人抗 體。所述治療性抗體優選與癌細胞(如前列腺癌細胞)表面結合。
所述治療性抗體可與效應分子(如放射性和/或細胞毒性部分)綴 合。用於治療時，可根據疾病類型和嚴重程度優選通過輸注給予治療 有效劑量(如每天給予10到5000 Mg至4000到1000jLig)的所述抗 體。可根據施用其他抗體如曲妥珠單抗(Trastuzumab)、利妥昔單抗
(RUuximab)、西妥昔單抗(Cetuximab)等的已知標準方法，例如 腸外給予所述抗體。所述抗體給予可與其他治療手段結合使用，所述 其他治療手段如給予其他抗肺瘤抗體、給予細胞毒性試劑、手術和/ 或放射療法。
將通過以下附圖和實施例進一步詳細說明本發明。


圖1:用於單克隆抗體表位定位的膜聯蛋白A3(A)及膜聯蛋白 A3的重組片斷的結構概覽；所述種表位定位方法被用於篩選本發明所 用單克隆抗體。
圖2:人膜聯蛋白A3的片斷vANA-5 (胺基酸107-243 )的純化 對通過層析法提純的vANA-5進行SDS-PAGE。
圖3:人膜聯蛋白A3片斷vANA-7 (胺基酸1-106)的純化對通 過層析方提純的vANA-7進行SDS-PAGE。
圖4:膜聯蛋白A3片斷vANA-l (胺基酸1-324 )的純化對層析 法提純的vANA-1進行SDS-PAGE。
圖5: vAM-1 ELISA板的檢測紫色抗血清；藍色空白血清
(免疫前兔血清)。
圖6:抗ANXA3抗體的特異性1-9道及2維-免疫印跡結果來自Wozny等人(2006 ); 10-19道顯示本文所述多種抗ANXA3單克隆抗體。
結果表明它們不與其他任何膜聯蛋白發生交叉反應。
圖7: PC3細胞的總細胞溶解物經免疫印跡ECL染色後，用密度計定量抗ANXA3著色，顯示單克隆抗體tgc7 ProVII5C5 (DSMACC2780 )有高度特異性。
圖8:將vANA-l用作抗原的基於抗ANXA3抗體的ELISA標準曲線，於15 ( A) 、 30 (B)和45 (C)分鐘後終止顯色反應。
圖9:標準低速離心後測定exprimate尿上清中的ANXA3;釆集數據A、 D: 15分鐘；B、 E: 30分鐘；C、 F: 45鍾；通過凝膠過濾(GF)除去尿素後得到粉色曲線。
圖10:基於抗ANXA3的ROC診斷研究曲線，採用圖6所示ELISA方法，研究基於200名PSA值在4-10 ng/ml的患者；AUROC為0. 823，PSA "灰色帶"中的重要集合表示在70%敏感性條件下特異性為90%。
圖11: Wozny等人(2006 )所用的多克隆血清(見圖1)僅非顯著地結合於PC-3細胞表面。
圖12:用tgc7 ProVII5C5 ( DSM ACC2780 )檢測PC-3細胞表面ANXA3;所用抗體濃度如圖所示。使用作為第第二抗體體的抗小鼠IgG-FITC的1: 50稀釋液，反應體系為100 n 1的抗體稀釋液。數據顯示ANXA3在所述前列腺癌細胞系的表面定位，其結果有應用於治療的潛力。
圖13:使用涵蓋ANXA3抗原性區域的重疊肽序列發現六個表位，並確定可高度特異性結合多克隆抗血清。除N-末端區的2個表位(被tgc 5 Pro II6G7 = DSM ACC2778、 tgc 6 ProIIIlGll - DSM ACC2779、tgc 7 ProVII5C5 = DSM ACC2780識別)之外，還有4個表位，更多細節見圖14。
圖14:人ANXA3及其抗原性區域(深紫色，最下行)序列概覽多克隆抗體1是高度特異性多克隆抗血清，唯一地結合ANXA3，不與其他膜聯蛋白或任何其他抗原(見2維蛋白印記和質譜圖，圖1)發生交叉反應。多克隆抗體2針對表位3和4; MABl是tgc7ProVII5C5
14=DSM ACC2780, MAB2代表tgc 5 Pro II6G7 - DSM ACC2778和tgc 6ProIIIlGll = DSM ACC2779;重組ANXA3片段1-8被用於各自免疫。圖15:人ANXA3的晶體結構示意圖。
實施例實施例1
針對ANXA3的特異性單克隆抗體的製備
克隆可溶性人膜聯蛋白A3的重組片斷vANA-5(胺基酸107-243 )、vANA-7 (胺基酸1-106) 、 vANA-1 (胺基酸1-324 ) 、 vANA-2 (胺基酸1-159) 、 vANA-3 (胺基酸35-159 ) 、 vANA-4 (胺基酸191-324 )和vANA-6 (胺基酸107-190 );用大腸桿菌(A co//)表達；而後層析純化。膜聯蛋白A3及其重組片斷的結構概覽見圖1。
圖2、3和4顯示根據標準層析法純化而得的可溶性ANXA3的重組片斷vANA-5、 vANA-7和vANA-l的1維Coomassie染色ID膠。
融合後篩選陽性雜交瘤細胞，並在克隆產生抗體的細胞的過程中進行基於已開發的片段vANA-1的抗膜聯蛋白A3ELISA (圖5)。為非排它性識別與ANXA3天然表位結合的抗體，在包被ELISA板前要先復性重組vANA-1。以ljag/孔重組vANA-1的濃度包被ELISA板。用多克隆抗ANXA3血清檢查ELISA板的功能。
圖6顯示用多克隆血清檢測良性和癌性前列腺組織樣品時得出的假色譜圖。用2維-PAGE印記癌樣品。大多數信號來自於四點鏈，其通過質鐠分析被鑑定為ANXA3。該假色譜圖與單色灰度法相比顯示更深的動態範圍。非ANXA3信號密度(顯示為藍色(接近背景))總是接近背景值。圖6第8和9道顯示特異性和非特異性信號的對比度，顯示所得的單色灰度。
10到19道進一步強調了單克隆抗體不同稀釋濃度的信號特性，其中所述單克隆抗體為tgc5 Pro II6G7-DSM ACC2778 ( 10和11道)；tgc6 ProIIIlGll (DSM ACC2779 ) ( 15和16道)；tgc7 ProVII5C5(DSM ACC2780 ) ( 12-14道);tgc8 ProIIIlEl ( DSM ACC2781 ) ( 17-19道)；它們的交叉反應活性甚至更低。
如圖6所示，本發明的單克隆抗體不與其他膜聯蛋白發生交叉反應，而Wozny等人(2006 )所用多克隆血清與ANXA6有些殘留的交叉反應，圖6右側顯示用單克隆抗體染色的結果(對前列腺癌患者的活組織和前列腺細胞系PC3的染色)，除33kD處的ANXA3外其他位置染色小於1%背景信號。
圖7表示電化學發光(ECL )處理後用密度計定量抗ANXA3著色的結果。用tgc7 ProVII5C5 ( DSM 2780 )抗體對PC3細胞的總細胞溶解物進行免疫印跡分析。只發現到一個相當於ANXA3的條帶。幾乎無交叉反應活性。 .
實施例2
測定exprimate尿樣和組織切片中的抗體特異性
將實施例1中的單克隆抗體按上述方法用於ELISA實驗來檢測癌症患者exprimate尿上清中的ANXA3。
如圖8的標準曲線所示，用tgc7 ProVII5C5 ( DSM ACC2780 )包被ELISA板，並檢測了 vANA-l的連續稀釋液(20-0. 3ng/孔)，用生物素標記的tgc5 Pro II6G7 (DSM ACC2778 )和親和素標記的HRP檢測，以TMB作為顯色底物。如圖所述，於15分鐘、30分鐘和45分鐘後終止酶促顯色反應。
圖9顯示患者exprimate尿上清中ANXA3的檢測。根據標準臨床方法低速離心樣品。於之前進行凝膠過濾(GF)可提高信號，此步驟可基本上去除幹擾1D PAGE免疫印跡的尿素。
也用免疫組織化學染色方法檢測了組織切片中的所述抗體。在正常前列腺上皮內發現了高濃度胞內ANXA3。從PIN到癌症的病變過程中，發現胞外ANXA3的局部濃度明顯升高。然而活組織區著色並不代表或可由此估計exprimate尿上清和沉澱間ANXA3的診斷性分布的定量關係。這是因為活組織檢查只能作為定性手段，而不能綜合性反映前列腺癌區域的病狀。實施例3
測定exprimate尿樣品中ANXA3的臨床研究進行多中心臨床盲檢，以測定體液中(尤其是exprimate尿中)基於ANXA3非侵入性檢測的前列腺癌診斷的敏感性和特異性。3. 1患者和對照
A:經組織學檢測確定患有前列腺癌的患者(PCA組)n約為200。B:經組織學檢測確定未患前列腺癌的患者(對照組)n約為300。3. 2樣品的採集和處理3.2.1血清/血漿
靜脈採集一管用於常規測定血清PSA值的血清。而後，額外收集l-2ml血清並深度冷凍保存。所述血樣用於進一步PSA分析。在鑽取前列腺活組織檢查或進行直腸觸診前釆集所述血樣。
3.2.2 exprimate尿沉澱
對前列腺進行觸診和按摩20秒鐘後，要求患者清空膀胱。根據已發表的方法處理所得exprimate尿(I. Rehman， A. R. Azzouzi， J. W. F.Catto， S. Allen, S. S. Cross, K. Feeley， M. Meuth， & F. C. Hamdy，Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage frompatients with prostate cancer: A pilot study, Urology 64(6)，2004， 1238-1243; C. Goessl, M. Muller， R. Heicappell, H. Krause,B. Straub， M. Schrader & K. Miller, DNA-based detection ofprostate cancer in urine after prostatic massage. Urology 58 (3)，2001， 335-338 )，產物保存於-80匸。
與血清一樣，如可能，在鑽取前列腺活組織檢查前採集exprimate尿。
3. 3結論
在約200個PSA陽性患者中測得的exprimate尿沉澱和血清中的ANXA3的敏感度約為90°/。，特異性約為80%,
如圖10所示，PSA值在2-6ng/ml間的患者基於上清中ANXA3(u. anx. tot)的R0C值為0. 8;對於PSA值在4-10ng/ml的患者，ROC值為0. 85;對於所有患者及所有PSA值範圍，ANXA3的ROC值為0. 74。圖IO所示的具有代表性的ROC曲線是針對PSA值在4到10ng/ml的患者；顯示出尤其對該重要PSA灰色帶的診斷相關性(此處PSA的特異性非常低(Roddam AW， Duffy MJ， Hamdy FC， Ward AM, PatnickJ， Price CP, Rimmer J， Sturgeon C， White P， Allen NE; On behalfof the NHS Prostate Cancer Risk Management Programme. Use ofprostate-specific antigen (PSA) isoforms for the detection ofprostate cancer in men with a PSA level of 2-10 ng/ml: systematicreview and meta-analysis. Eur Urol. 2005 Sep; 48 (3): 386-99;discussion 398-9. Review. PMID: 15982797; Stamey TA， CaldwellM， McNeal JE， NolleyR, Hemenez M， Downs J. The prostate specif icantigen era in the United States is over for prostate cancer:what happened in the last 20 years J Urol. 2004 Oct; 172(4 Pt1): 1297-301. PMID: 15371827)), ROC曲線是臨床統計的標準工具，詳述見http: //www. anaesthetist. com/mnm/stats/roc/。實施例4
單克隆抗體與癌細胞的結合
抗ANXA3單克隆抗體可在診斷(病理組織學)和治療應用中用作
表面標記。
如以下流式細胞分析所示，與N-末端表位tgc7ProVII5C5 (DSMACC2780 )特異性結合的單克隆抗體可以鈣離子依賴的方式結合到前列腺癌細胞系(PC-3細胞，ATCC， DCV-1017, Vers ion 08-2004 )胞外結合位點。
每次實驗都用單獨溫育第二抗體以及使用非特異性和非相關性對照抗體(單克隆和多克隆抗體)來評估非特異性結合。
圖ll顯示Wozny等人(2006 )所用的多克隆血清(見圖6)僅非顯著地結合到PC-3細胞表面。
用適當緩衝液漂洗細胞，冰育30分，稀釋度如圖11所示。而後，
18用100jil的FITC-抗大鼠第二抗體的1: 50稀釋液溫育全部樣品。漂洗後，如圖所示用流式細胞術分析各樣品中的12， 000個細胞。
與對照血清相比，不同稀釋度的多克隆血清基本上不導致螢光強度的顯著升高。因此，這個時期無法檢測到ANXA3在PC-3細胞表面表達，這可能是因為多克隆血清中的特異性抗體濃度太低。
然而，如圖12所示，單克隆抗體tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780 )確實以依賴於濃度和鈣離子方式與PC-3細胞表面表位相結合。
實施例5表位定位
在使用涵蓋膜聯蛋白A3 (ANXA3)的全部抗原性區域的重疊肽序列後，我們通過分析高度特異性多克隆抗體的結合(如圖l)得出，如圖13和14所示，只有6個表位負責高度特異性結合。通過2維-PAGE的免疫印記和質譜分析檢測多克隆抗血清的特異性。以同樣方法檢測單克隆抗體tgc 5 Pro II6G7 = DSM ACC2778、 tgc 6 ProIIIlGll =讓ACC2779、 tgc 7 ProVII5C5 =讓ACC2780、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7的特異性。
表位定位顯示，ANXA3的N-末端區的2個表位後，於中段和C-末端也各有2個起作用的表位(圖13)。
這些表位(稱為表位1-6 )在人ANXA3上的定位檢圖14。
人ANXA3的晶體結構概覽見圖14 (http:〃麗.pdb.org/pdb/files/laxn. pdb和http: //www, pdb. org/explore, do structureIIMAXN)，暗示表位l、 2、 5和6源於ANXA3的自然摺疊的結構域。我們因此從嗜中性粒細胞分離人ANXA3，並用其免疫兔子，以得到相應抗體。這些抗體針對天然ANXA3，我們再一次篩選高度特異性抗體，結合包括相應的表位l、 2、 5和6的結構域的那些抗體尤其適用於診斷和治療目的。參考文獻
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20
權利要求
1. 診斷癌症的方法，其中用膜聯蛋白A3的特異性抗體分析樣品中膜聯蛋白A3的存在和/或含量，所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
2. 權利要求l的方法，其中所述癌症為泌尿生殖道和/或胃腸道癌。
3. 權利要求1或2的方法，其中所述癌症為上皮癌。
4. 權利要求l-3的方法，其中所述癌症為前列腺癌。
5. 權利要求l-4中任一項的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
6. 權利要求1-5中任一項的方法，其中所述抗體針對膜聯蛋白 A3N-末端，尤其針對人膜聯蛋白A3的胺基酸1-16的區域的表位。
7. 權利要求l-6中任一項的方法，其中所述抗體選自雜交瘤細胞 系tgc 5 ProII6G7 ( DSM ACC2788 ) 、 tgc 6 ProIIIlGll ( DSM ACC2779 )、 tgc7ProVII5C5 (DSMACC2780 ) 、 tgc 8 ProIIIlEl (DSMACC2781 )、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7產生 的抗體或與膜聯蛋白A3上的相同表位結合的抗體。
8. 權利要求1-7中任一項的方法，其中所述抗體針對膜聯蛋白 A3上的表位，包含選自下列的序列或具有至少6個胺基酸的其部分鄰 接序列(i) VRDYPDFSPSVD ( SEQ ID NO: 1);(ii) MLISILTERSM (SEQ ID NO: 2);(iii) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ ( SEQ ID NO: 3);(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO: 4);(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO: 5);(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL (SEQ ID NO: 6)。
9. 權利要求1-8中任一項的方法，其中所述抗體帶有標記基團。
10. 權利要求1-9中任一項的方法，其為非侵入性方法。
11. 權利要求10的方法，其中所述樣品為尿樣，尤其是exprimate尿樣。
12. 權利要求10的方法，其中所述樣品為糞樣。
13. 權利要求1-9中任一項的方法，其為組織化學方法。
14. 權利要求13的方法，其中所述樣品為組織樣品，尤其是活組織。
15. 權利要求1-14中任一項的方法，其中測定胞外膜聯蛋白A3 的存在和/或含量和/或胞內膜聯蛋白A3的存在和/或含量。
16. 權利要求1-15中任一項的方法，其中測定至少一種其他標記。
17. 權利要求16的方法，其中所述其他標記為前列腺特異性抗原 (PSA)和/或前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
18. 權利要求1-17中任一項的方法，其中所述診斷包括確定病期。
19. 權利要求18的方法，其中檢測出癌前期和癌期的至少一項差異。
20. 用於診斷前列腺癌的檢測試劑，包含至少一種膜聯蛋白A3 的特異性抗體，所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
21. 權利要求20的試劑，其中所述抗體為單克隆抗體。
22. 權利要求20或21的試劑，其中所述抗體針對膜聯蛋白A3 的N-末端，尤其針對人膜聯蛋白A3的胺基酸1-16的區域的表位。
23. 權利要求20-22中任一項的試劑，其中所述抗體選自由雜交 瘤細胞系tgc 5 ProII6G7 ( DSM ACC2788 ) 、 tgc 6 ProIIIlGll ( DSM ACC2779 )、 tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780 ) 、 tgc 8ProIIIlEl ( DSM ACC2781 )、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7 產生的抗體或與膜聯蛋白A3上的相同表位結合的抗體。
24. 權利要求20-23中任一項的試劑，其中所述抗體針對膜聯蛋 白A3上的表位，包含選自下列的序列或具有至少6個胺基酸的其部分 鄰接序列(i) VRDYPDFSPSVD ( SEQ ID NO: 1);(ii) MLISILTERSM ( SEQ ID NO: 2);(iii) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ (SEQ ID NO: 3);(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO: 4);(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO: 5);(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL (SEQ ID NO: 6)。
25. 權利要求20-24中任一項的試劑，其中所述抗體帶有標記基團。
26. 膜聯蛋白A3的特異性抗體在製備用於治療癌症的藥物中的用途，其中所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
27. 權利要求26的用途，其中所述癌症為泌尿生殖道和/或胃腸道癌。
28. 權利要求26或27的用途，其中所述抗體為嵌合或人源化或人單克隆抗體。
29. 權利要求26-28中任一項的用途，其中所述抗體針對膜聯蛋白A3的N-末端，尤其針對人膜聯蛋白A3的胺基酸1-16的區域的表位。
30. 權利要求26-29中任一項的用途，其中所述抗體選自由雜交瘤細胞系tgc 5 ProII6G7 (■ ACC2788 ) 、 tgc 6 ProIIIlGll ( DSMACC2779 ) 、 tgc7ProVII5C5 (DSMACC2780 ) 、 tgc8ProIIIlEl ( DSMACC2781 )、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7產生的抗體或與膜聯蛋白A3上的相同表位結合的抗體。
31. 權利要求26-30中任一項的用途，其中所述抗體針對膜聯蛋白A3上的表位，包含選自下列的序列或具有至少6個胺基酸的其部分鄰接序列(i) VRDYPDFSPSVD ( SEQ ID NO: 1);(ii) MLISILTERSNA (SEQ ID NO: 2);(iii) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ (SEQ ID NO: 3);(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO: 4);(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO: 5);(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL ( SEQ ID NO: 6)。
32. 權利要求26-31中任一項的用途，其中所述抗體與效應分子綴合。
33. 用於生產治療癌症的藥物的藥物組合物，包含作為活性成分的膜聯蛋白A3特異性抗體，其中所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
34. 膜聯蛋白A3特異性抗體，所述抗體與其他膜聯蛋白的交叉反應低。
35. 權利要求34的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
36. 權利要求34或35的抗體，其中所述抗體針對膜聯蛋白A3的N-末端，尤其針對人膜聯蛋白A3的胺基酸1-16的區域的表位。
37. 權利要求34-36中任一項的抗體，其中所述抗體選自由雜交瘤細胞系tgc 5 ProII6G7 ( DSM ACC2778 ) 、 tgc 6 ProIIIlGll ( DSMACC2779 ) 、 tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780 ) 、 tgc 8 ProIIIlEl ( DSMACC2781 )、 tgc 13 ProI/5G9、 tgc 12 ProIII/4B11、 tgc 14 ProVIII/3D7產生的抗體或與膜聯蛋白A3上的相同表位結合的抗體。
38. 權利要求34-37中任一項的抗體，其中所述抗體針對膜聯蛋白A3上的表位，包含選自下列的序列或具有至少6個胺基酸的其部分鄰接序列(i) VRDYPDFSPSVD ( SEQ ID NO: 1);(ii) MLISILTERSNA (SEQ ID NO: 2);UU) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ (SEQ ID NO: 3);(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO: 4);(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO: 5);(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL (SEQ ID NO: 6)。
39. 權利要求34-38中任一項的抗體，其中所述抗體帶有標記基團或效應基團。
40. 生產權利要求34-39中任一抗體的細胞。
41. 天然人膜聯蛋白A3在製備免疫試劑中的用途。
42. 權利要求41的用途，其中所述天然人膜聯蛋白A3分離自嗜中性粒細胞。
43. 製備針對人膜聯蛋白A3的人抗體的方法，包括從人類樣品中分離產生所述抗體的B細胞，並從所述B細胞或由其衍生出的細胞如雜交瘤細胞得到所述抗體。
全文摘要
本發明涉及診斷前列腺癌的方法，包括用高度特異性抗體(尤其是用單克隆抗體)測定膜聯蛋白A3(尤其是胞外膜聯蛋白A3)。本發明還涉及含所述抗體的檢測試劑。
文檔編號G01N33/574GK101501501SQ200780021382
公開日2009年8月5日 申請日期2007年6月11日 優先權日2006年6月9日
發明者A·施拉滕赫爾茲 申請人:普羅迪奧塞斯股份公司