一種適用於菸草種子的rna提取方法
2023-05-10 03:29:21 2
一種適用於菸草種子的rna提取方法
【專利摘要】本發明屬於分子生物學【技術領域】，具體是一種從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：實驗中先用物理方法除去脂類物質，之後用醋酸鈉和異丙醇重複沉澱RNA，並用DNaseI去除RNA中的基因組DNA；最終得到濃度高、質量好、完整性好的RNA。本發明相比現有技術所具備的優點在於：1.提供了一種適合菸草種子總RNA的提取方法。2.有效去除了脂類物質。3.DNaseI除去提取RNA中的基因組DNA汙染。4.用NaAc和異丙醇共沉澱去除多糖類物質。5.異丙醇在室溫下沉澱RNA能最大程度的降低鹽的共沉澱，減少鹽類物質對後續實驗的影響。6.可大大節約提取時間，實驗效果好。
【專利說明】-種適用於菸草種子的RNA提取方法
[0001]
【技術領域】
[0002] 本發明涉及一種菸草種子中總RNA提取方法，屬於分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0003] 菸草是世界上重要的經濟作物之一，也是一種重要的模式作物，其在植物生物學 包括生理學、分子生物學及遺傳學研究中具有重要的作用。總RNA的提取技術是菸草分 子生物學的基本實驗技術，高質量(純度高，完整性好）的RNA是進行一些分子生物學實驗 包括逆轉錄、Northern雜交、cDNA文庫構建、基因晶片實驗及轉錄組學分析的關鍵。菸草 成熟種子中富含脂類、蛋白和多糖類物質，其主要的營養貯藏物質是油和脂肪（約佔乾重 的42%-43%)，其次是蛋白質（約佔乾重的20%)，多糖類物質的含量也比較多（約佔乾重的 17%-19%)。這些物質往往會干擾RNA的分離和純化，能否有效的去除脂類、蛋白質、多糖是 提高RNA質量的關鍵。但是目前報導的提取RNA方法或者商業化的試劑盒多針對幼嫩的植 株組織或植株，很少有針對種子的RNA提取方法。丁福章等（2007)研究了菸草不同組織總 RNA的提取方法，發現試劑盒法和Trizol法只能提取根、莖、葉、蕾和花的總RNA，並不能提 取種子中總RNA。用CTAB法雖然能從種子中提取RNA，但是也有其自身的缺點。一般CTAB 法提取RNA要用LiCl和異丙醇先後沉澱RNA，雖然能去除蛋白和多糖，但是一般RNA都要沉 澱過夜，且對小分子RNA的沉澱效果不好，另外用異丙醇沉澱RNA則會有基因組DNA汙染， 並且最後得到的RNA濃度並不高。
【發明內容】
[0004] 本發明目的正是針對上述現存方法存在的不足而專門設計的高效提取菸草種子 中總RNA的方法，不僅可以有效的去除脂類物質、蛋白質、多糖以及基因組DNA幹擾，能得到 純度高，完整性好的RNA，另外可以大大節約實驗時間。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的： 一種從菸草種子中提取RNA的方法，依次包括以下步驟： 1) 取適量菸草種子在提前預冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細粉末狀； 2) 轉移至1. 5ml的離心管中，並加入700 μ?的RNA提取緩衝液（65°C溫育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巰基乙醇）充分混勻，後置於65°C溫育lOmin，用滅菌的牙籤或槍 頭去除脂類物質。
[0006] 3)加入提取緩衝液等體積的等體積的氯仿：異戊醇，氯仿：異戊醇為24 : 1，充分 震蕩混勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5 )所取上清重複3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mo 1醋酸鈉溶液（pH5. 0 ) 和與上清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會發現RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉澱一次，在超淨工作檯乾燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重複加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液（pH5. 0)和與RNA水溶液等體積 的異丙醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清； 10) 70%的乙醇清洗沉澱兩次，在超淨工作檯乾燥（時間可適當延長，但是不可過度幹 燥)，加入無核酸酶的ddH 20溶解RNA，置於-70°C保存備用。
[0007] 所述菸草種子為成熟的菸草種子。
[0008] 所述 RNA提取緩衝液成分如下：2% 的 CTAB(W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl(pH8. 0)， 2.5 mMol/LEDTA ,2. OMol/L NaCl, 上述所有步驟中用到的試劑和耗材都經過DEPC處理。
[0009] 本發明具有以下優點： 1.提供了一種適合菸草種子總RNA的提取方法。
[0010] 2.該提取方法通過滅菌槍頭去除脂類物質。
[0011] 3. DNasel除去提取RNA中的基因組DNA汙染。
[0012] 4.用NaAc和異丙醇共沉澱去除多糖類物質。
[0013] 5.異丙醇在室溫下沉澱RNA能最大程度的降低鹽的共沉澱，減少鹽類物質對後 續實驗的影響。
[0014] 6.提取的RNA濃度高，質量好，RNA完整性好。
[0015]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1 CTAB法提取的菸草種子RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0017] 圖2為本方法提取的菸草種子RNA的瓊脂糖凝膠圖。
[0018] 圖3為CTAB方法提取的菸草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以 CTAB法提取菸草成熟種子為例說明）。
[0019] 圖4為CTAB方法提取的菸草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以 CTAB法提取菸草露白種子為例說明）。
[0020] 圖5為本發明方法提取的菸草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以實 施例1中的樣品為例說明）。
[0021] 圖6為本發明方法提取的菸草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以實 施例2中的樣品為例說明）。
【具體實施方式】
[0022] 本發明將結合實施例作進一步的描述，但並不是限制本發明。
[0023] 實施例1 :從菸草紅花大金元成熟種子中提取RNA 1)取適量成熟乾燥的種子在提前預冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細粉末 狀； 2) 轉移至1. 5ml的離心管中，並加入700 μ?的RNA提取緩衝液（65°C溫育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巰基乙醇）充分混勻，後置於65°C溫育lOmin，可用滅菌的槍頭或 牙籤剔除漂浮的脂質； 3) 加入提取緩衝液等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，充分震蕩混勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5 )所取上清重複3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mo 1醋酸鈉溶液（pH5. 0 ) 和與上清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會發現RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉澱一次，在超淨工作檯乾燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重複加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液（pH5. 0)和與RNA水溶液等體積 的異丙醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清。
[0024] 10)70%的乙醇清洗沉澱兩次，在超淨工作檯乾燥(時間可適當延長，但是不可過度 乾燥)，加入無核酸酶的ddH 20溶解RNA，置於-70°C保存備用。
[0025] 實施例2 : 取適量萌發過程中露白的種子，採用本方法提取RNA。
[0026] 提取完成後進行凝膠電泳檢測和用Agilent 2100生物分析儀進行分析（圖2 :1、 2代表成熟種子，3、4代表露白的種子；圖5、6 :分別抽取成熟種子和露白種子的RNA進行 分析)，對照實施例可參照常規的CTAB法提取葉片中總的RNA (圖1 :1、2代表成熟種子，3 和4分別代表露白的種子；圖3、4 :分別抽取成熟種子和露白種子的RNA進行分析)，通過比 較發現，CTAB法提取的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳並沒有發現5S RNA條帶（圖1)，Agilent 2100生物分析儀分析結果顯示RNA濃度較低，且28S/18S的比值明顯大於2. 0,說明所提取 的RNA完整性不好。本發明方法提取的菸草種子的總RNA的5S條帶清晰可見（圖2)，進一 步經Agilent 2100生物分析儀分析發現RNA濃度較高，28S/18S的比值在2. 0左右，說明 所提取RNA完整性好，本發明方法提取的RNA質量優於CTAB法提取的RNA。
【權利要求】
1. 一種從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：依次包括以下步驟： 1) 取適量菸草種子在提前預冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細粉末狀； 2) 轉移至1. 5ml的離心管中，並加入700 μ?的RNA提取緩衝液充分混勻，後置於65°C 溫育lOmin，剔除漂浮的脂質； 3) 加入提取緩衝液等體積的氯仿/異戊醇溶液，氯仿：異戊醇為24 : 1，充分震蕩混 勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5) 所取上清重複3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液和與上 清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會發現RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉澱一次，在超淨工作檯乾燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重複加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液和與RNA水溶液等體積的異丙 醇，室溫放置15 min沉澱RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清； 10) 70%的乙醇清洗沉澱兩次，在超淨工作檯乾燥，加入無核酸酶的ddH20溶解。
2. 根據權利要求1所述的從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：所述菸草種子 為成熟的菸草種子。
3. 根據權利要求1所述的從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：在步驟2)中是 用滅菌的牙籤或槍頭剔除脂類物質。
4. 根據權利要求1所述的從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：所述RNA提取 緩衝液成分如下：2% 的 CTAB (W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl 其 ρΗ8· 0,2· 5 mMol/L EDTA， 2. OMol/L NaCl。
5. 根據權利要求1或4所述的從菸草種子中提取RNA的方法，其特徵在於：所述RNA提 取緩衝液使用時應65°C溫育30min以上，用之前加入5% V/V的β巰基乙醇。
【文檔編號】C12N15/10GK104152439SQ201410434938
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月30日 優先權日:2014年8月30日
【發明者】武明珠, 李鋒, 羅朝鵬, 王燃, 魏攀, 金立鋒, 翟妞, 楊軍, 林福呈 申請人:中國菸草總公司鄭州菸草研究院