一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽及多肽基因的製作方法

2023-05-10 14:35:06

專利名稱：：一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽及多肽基因的製作方法
技術領域：
：本發明屬於免疫
技術領域：
，具體涉及一種用於預防與治療老年性痴呆症的重組抗原多肽及編碼這種重組抗原多肽的融合基因。
背景技術：
：老年性痴呆症是一種神經退行性疾病，又稱阿爾茨海默氏病(Alzheimerdisease,AD)，其顯著病理特徵之一為患者腦內出現由42個胺基酸構成的、具有神經毒性的P-澱粉樣肽((3-amyloidp印tide，A(3或A(342，其胺基酸序列參見StrooperBD，etal.Aninflammatorydrugprospect.Nature.2001，64(6860):159-160)的聚集體和由其進一步形成的澱粉樣斑塊，引起腦神經元凋亡，最終導致AD。AD的臨床表現為精神症狀的痴呆如記憶減退甚至喪失，認知功能缺損和行為遲緩甚至能力喪失，給家庭和社會都帶來沉重的負擔。正常情況下人體中的AP42存在水平較低，不能夠形成A(342的聚集體，但當AP42水平異常增高時則易形成聚集體。目前認為A(342生成數量的增加而導致的聚集體和澱粉樣斑塊的出現是AD發生和發展的主要因素，因此減輕腦內A(542的負荷、阻止和逆轉A|342聚集體和澱粉樣斑塊的形成己成為預防和治療AD的一種直接而有效途徑。經過長達100年的探索和研究，1999年Schenk首次使用Af342作為抗原肽治療AD轉基因模型鼠(PDAPP)獲得成功(SchenkD,a/.Immunizationwithamyloid-betaattenuatesAlzheimer，sdisease-likepathologyinthePDAPPmouse.泡t『e，1999,400(6740):173-177)。至2002年已經證實(CheckE.NerveinflammationhaltstrialforAlzheimer'sdrug.Nature,2002,415(6871):462)，抗AP42的抗體能有效阻止或逆轉A(342聚集體和澱粉樣斑塊的形成，並能中和A(342的細胞毒性，促進A(342的代謝，從而起到了預防和治療AD的功效。然而，在隨後的II期臨床試驗中有5%的患者出現了免疫損傷(中樞無菌性腦炎和局部出血性腦血管病)，使得AD免疫治療試驗被迫停止(SchenkD.Amyloid-betaimmunotherapyforAlzheimer'sdisease:theendofthebeginning.NatRevNeurosci.2002，3(10):824-8)。之後眾多的研究結果表明，A|342抗原肽上不同區域可能存在不同性質的表位A|342抗原肽的N端序列包含B細胞表位，能刺激B細胞產生保護性抗體以清除A(342;而C端序列包含T細胞表位，激活T細胞誘發細胞免疫應答以至於產生了炎性反應，這構成了免疫損傷的潛在性基礎，而臨床試驗中出現的免疫損傷正是由細胞免疫應答引發的免疫炎性反應的表現(LeeM,BardF，Johnson-WoodK，LeeC，HuK,GriffithSG，BlackRS,SchenkD，SeubertP.Abeta42immunizationinAlzheimer'sdiseasegeneratesAbetaN_terminalantibodies.AnnNeurol.2005Sep;58(3):430-5;LemereCA，MaierM,PengY,JiangL，SeabrookTJ".NovelAbetaimmunogens:isshorterbetterCurrAlzheimerRes.2007,4(4):427-36)。jt匕外使用全長的Ap42作為免疫原，還存在著潛在的危險，因為A(342本身就是致病因素，同時A(342作為一個小肽，分子量小於10000，免疫原性也較差。儘管AP42疫苗清除腦內不溶性A(342沉積和促進可溶性A(342降解的確切機制目前仍不清楚，但大量研究結果已經肯定了AD免疫治療策略的科學性。AD免疫治療初期中出現的免疫炎性反應恰好啟發性地提示了開發安全性AD疫苗的必要性，這在一定程度上促進了新一代疫苗一A(342表位抗原疫苗的發展。應用A|342表位抗原疫苗清除Ap42的聚集體作為一種治療策略的意義不僅僅在於減輕和改善AD的病理特徵和症狀，而且還在於解除和逆轉神經退行性變性的發生基礎和發展過程，更在於積極預防腦的神經退行性病變。因此，通過優化AP42抗原肽的表位以降低不必要的免疫炎性反應，AD的免疫治療仍能獲得理想的免疫效果。根據這一思路，本發明人進行了深入、系統的研究，終於完成了本發明。
發明內容本發明的目的是為了克服全長AP42抗原肽用於預防與治療老年性痴呆症的缺點，提供一種毒性小、免疫原性好的免疫增強序列與人p-澱粉樣肽(Ap)N端28個或35個胺基酸片段(分別用A(528或A(335表示)的重組多肽，以及提供編碼這種重組多肽的融合基因。本發明的重組抗原多肽既除去了全長人Ap的C端毒性片段，提高了抗原肽Ap的安全性，又重組了免疫增強序列，增強了抗原肽Ap的免疫原性。這種重組抗原多肽和編碼這種抗原多肽的基因兩者均在免疫預防與治療老年痴呆症中具有廣泛的應用。本發明的另一個目的是提供所述融合基因與表達載體pET28a、pET20b或pET41b在用於構建重組表達載體方面的應用。5本發明涉及的重組抗原多肽，其特徵在於包含至少一個免疫增強序列(immunoenhancingsequence,I)禾口至少一個人(3-澱粉樣肽((3-amyloidpeptide,A(3)序列，免疫增強序列通過至少一個共價鍵與所述人(3-澱粉樣肽序列相偶聯形成重組多肽，其中所述人(3-澱粉樣肽序列具有SEQIDNO:1或SEQIDN0:2所示的胺基酸序列；所述免疫增強序列(I)選自下面所述的任一胺基酸序列①SEQIDNO:3;②SEQIDNO:4;③①和②的重組形式；④與上述①、②或③至少90。/。同源的序列。本發明所述的免疫增強序列通過至少一個共價鍵與所述Ap序列相偶聯形成重組多肽，其中所述共價鍵優選的是肽鍵。本發明所述的免疫增強序列可在所述人(3-澱粉樣肽序列的N末端或者C末端重組連接。本發明實施例1中的重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:5所示，它是SEQIDN0:3序列在SEQIDNO:1序列N端與其重組而成，實施例2中的重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:7所示，它是SEQIDNO:4序列在SEQIDNO:1序列的C端與其重組而成，實施例3中的重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:9所示，它是SEQIDNO:3序列在SEQIDN0:2序列的N端與其重組，同時SEQIDNO:4序列在SEQIDNO:l序列的C端與其重組而成。本發明所述的編碼上述重組抗原多肽的融合基因，其特徵在於包含至少一個拷貝的編碼免疫增強序列(imraunoenhancingsequence,I)的DNA序列和至少一個拷貝的編碼人p-澱粉樣肽((3-amyloidp印tide,Af5)的DNA序列，編碼免疫增強序列的DNA序列與編碼人p-澱粉樣肽(p-amyloidp印tide,A(i)的DNA序列是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接的，其中所述的編碼人(3-澱粉樣肽((3-amyloidp印tide，Ap)的DNA序列為編碼SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的DNA序列，所述的編碼免疫增強序列(imraunoenhancingsequence,I)的DNA序列選自下面所述的任一DNA序列①編碼SEQIDN0:3的DNA序列；②編碼SEQIDN0:4的DNA序列；③①和②的重組DNA序列；6與上述①、②或③至少90%同源的DNA序列。上面所述的由編碼SEQIDNO:3的DNA序列和編碼SEQIDNO:4的DNA序列的重組DNA序列是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接。本發明的特點是不使用全長AP42而是使用A(M2N端28個或35個胺基酸片段(分別用AP28或AP35表示)為核心抗原肽，提高了抗原肽Ap的安全性，同時引入了由通用型輔助T細胞表位組成的免疫增強序列以補償核心抗原肽A(328或AP35分子較小的弱點，使本發明的重組抗原多肽成為安全而有效的抗原肽。圖l:pET41b-IAp28重組表達載體的測序譜圖；圖2:重組表達載體pET41b-IA(328構建示意圖3:純化得到的重組抗原多肽IAJ328(A)、AP28-H8(B)和IAp35-H8(C)的SDS-PAGE圖譜；其中M:蛋白質Marker;A:A(328-H8;B:IAp28;C:IAp35-H8;圖4:pET41b-Ap28-H8重組表達載體的測序譜圖；圖5:重組表達載體pET41b-Ap28-H8構建示意圖；圖6:pET41b-I-A(335-H8重組表達載體的測序譜圖；圖7:重組表達載體pET41b-IA(335-H8構建示意圖8:IAp28(I)、AP28-H8(II)和IAp35-H8(III)誘導抗體功效分析的PC12細胞圖。具體實施例方式實施例l:製備重組抗原多肽IA(328，包括以下步驟(1)設計本發明的重組抗原多肽本發明的重組抗原多肽IAP28的設計使得其完整胺基酸序列如SEQIDN0:5所示，它包含了SEQIDN0:3(I)序列和SEQIDN0:1(A&28)序列。(2)合成編碼IAp28的基因及構建重組表達載體依據本發明所設計的重組抗原多肽IA(328的胺基酸序列，設計並利用DNA合成儀人工合成了編碼IAf328的基因片段，其序列如下ggaattccatatgcaggtgc卿UcagagcctgtttctgUgttgctgtgggttccaggttctcgtggtgctaaatttgttgctgcctggaccctgaaagctgccgctggtggcggtcagtatattaaagctaatagcaaatttattggtattaccgaactggctgccgctgatgcagaattccgtcatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaataatctcgagcgg其中5'端有下劃線的catatg序列是內切酶Ndel識別位點，3'端有下劃線的ctcgag序列是內切酶Xhol識別位點，所設計的此二酶切位點與本發明所用的原核表達載體pET41b(通用的大腸桿菌表達載體，含有T7強啟動子、N-末端組氨酸標籤以及卡那黴素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)的Ndel和Xhol相匹配，適合於在大腸桿菌中高效表達。利用Ndel和Xhol切割位點將此人工合成的編碼IAP28的基因片段克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，連接便得到完整的編碼IA(328的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:8所示。上述表達載體的構建步驟具體如下雙酶切反應將1.0pgpET41b載體和上述用DNA合成儀人工合成的編碼IAP28的基因片段分別與適量去離子水混勻，使其總體積分別為18pl，各加入2-3單位的限制性內切酶Ndel和2-3單位的XhoI及2pl相應的IOXH緩衝液，混勻，置37"水浴保溫2-3小時後，分別採用常規低熔點瓊脂糖凝膠回收法參照"分子克隆實驗指南"(第二板，科學出版社)322頁回收目的DNA。編碼IAP28的基因片段與pET41b載體的連接取0.5嗎上述步驟回收的pET41b載體DNA，加入2-10倍摩爾量的上述步驟得到的編碼IAP28的基因片段DNA、2pl10XT4DNA連接酶緩衝液，加去離子水定容至20ul，最後加入1單位的T4DNA連接酶，混勻並瞬間離心以使液滴聚集管底，置16'C水浴過夜或25'C水浴1-4小時後，得到連接好的重組表達載體pET41b-IAP28。重組表達載體pET41b-IA(328轉化￡co"'DH5a:取10pl連接好的重組表達載體pET41b-IAp28加入到50-100pl￡c。h'DH5a感受態細胞￡co7j'DH5a感受態細胞的製備方法參照"分子克隆實驗指南"(第二板，科學出版社)49頁中，冰浴30分鐘後置入42r水浴中保溫1分鐘，立即取出並置冰浴中冷卻2分鐘。加入200pl37。C預熱的S0C液體培養基，37°C150rpm振搖培養60分鐘後，取出100pl培養液塗布於含卡那黴素(Kan)的LB瓊脂培養平板上，37'C培養14-16小時後，出現轉化菌落。重組載體pET41b-IAp28的克隆與基因序列分析挑取單菌落加入2ml含有卡那黴素的LB培養液中，37°C，200rpm培養過夜。提取擴增的重組載體pET41b-IA(528，經Ndel和Xhol雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇切割產物與理論值一致的克隆進行核酸序列分析，結果如圖l(pET41b-IA(328載體測序譜圖，其中編碼IA(328的基因為核苷酸59307號)所示，證明獲得了編碼完整IAP28的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:8所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。重組表達載體的構建過程如圖2所示，利用Ndel和Xhol切割位點將合成的外源DNA片段克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，成為重組載體pET41b-IA(328。(3)重組抗原多肽IAJ328的表達與製備重組表達載體pET41b-IAP28可轉化到￡co力'BL21(DE3)系列細胞中，如￡c^iBL21(DE3)、￡co乃'BL21(DE3)pLysS、￡coh'BL21(DE3)pLysE細胞等等，獲得高表達的IAp28。在本實施例中使用￡co"'BL21(DE3)為宿主細胞，並使用卡那黴素篩選出能高效穩定表達的單細胞株。具體操作將1.0pg表達載體pET41b-IAp28加入到100pl￡co"'BL21(DE3)感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42'C水浴保溫90秒，冰浴冷卻2分鐘，加入800^137'C預熱的LB液體培養基，37°C150rpm振搖培養60分鐘。取200pl培養液塗布於含卡那黴素的LB瓊脂培養平板上，37。C培養14-16小時後，獲得轉化的單菌落。挑取轉化的單菌落，接種於2mlLB培養基中，37'C振搖培養過夜。以1:100的比接種10mlLB培養基(50嗎/mlKan)，37°C200r/min振蕩培養至0D6。。=0.81.0(約23小時)，加異丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度O.6mM，37°C200rpm振蕩誘導45小時後，4°C5000rpm離心5分鐘收集菌體。用1/10培養液體積的10mMTris.Cl(pH8.0)重懸菌體，置冰浴中超聲波處理破碎菌體。破碎菌體4'C，5000rpm離心15分鐘，獲得上清液。將上清液進行製備性SDS-PAGE分離IA(328。電泳後在凝膠一側切下0.5cm寬的膠條，進行考馬斯亮藍染色，依據染色結果切下剩餘含有IA(328的膠條，加入等體積磷酸緩衝液(20mM)中，反覆凍融(-8(TC/室溫)3次後凝膠中的IA(528游離出。去除凝膠，獲得了純化的IAp28。.圖3A示出了純化得到的重組抗原多肽IAp28的SDS-PAGE鑑定結果，純化得到的重組抗原多肽IA|328的分子量為9kDa。本發明設計了重組抗原多肽IAP28的胺基酸序列，並獲得了編碼重組抗原多肽IA(328的基因，使用該基因表達出重組抗原多肽IAp28。所述的重組抗原多肽IAp28以可溶性多肽形式表達，使用電泳純化法得到了本發明的重組抗原多肽IA|328。實施例2製備重組抗原多肽AP28-H8，包括以下步驟(1)設計本發明的重組抗原多肽本發明的重組抗原多肽Ap28-H8的設計使得其完整胺基酸序列如SEQIDN0:6所示，它包含了SEQIDN0:1(Ap28)序列和SEQIDN0:4(H8)序列。重組的SEQIDN0:4(H8)序列既是重組抗原多肽的一部分，又是表達的該抗原多肽的純化標籤。(2)合成編碼A(528-H8的基因及構建重組表達載體依據本發明所設計的重組抗原多肽AP28-H8的胺基酸序列，先設計並利用DNA合成儀人工合成了編碼AP28的基因片段，其序列如下ggaattccatatggatgccgaatttcgtcatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaactcgagcgg其中5，端有下劃線的catatg序列是內切酶Ndel識別位點，3'端有下劃線的ctcgag序列是內切酶Xhol識別位點。上述所設計併合成的Ap28-H8基因片段的特性與實施例1中IA(328基因片段的特性相同，但無終止密碼子，因此利用Ndel和Xhol切割位點將此合成的編碼A(J28的基因片段克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，連接後便在3'端融合了載體上的編碼八聚組氨酸(H8)的序列和終止密碼子(caccaccaccaccaccaccaccactaa)，得到完整的編碼A(328-H8的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:9所示。上述重組表達載體pET41b-Ap28-H8的構建步驟同實施例1中的pET41b-IA|328。提取擴增的重組載體pET41b-Ap28-H8，進行核苷酸序列分析，結果如圖4(pET41b-Ap28-H8質粒核苷酸序列分析譜圖，其中編碼A(328-H8的基因為核苷酸65184號)所示，證明獲得了編碼完整A(328-H8的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:9所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。重組表達載體的構建過程如圖5所示，利用Ndel和Xhol切割位點將合成的編碼Ap28-H8的基因克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，成為重組載體pET41b-Ap28-H8。(3)重組抗原多肽A(328-H8的表達與製備重組表達載體pET41b-Ap28-H8轉化￡BL21(DE3)宿主細胞的步驟以及AI328-H8基因的表達步驟同實施例1中pET41b-IAp28的轉化以及IA(328基因的表達。挑取pET41b-A(328-H8轉化￡BL21(DE3)宿主細胞的單菌落，按與實施例1中相同的方法誘導發酵後的菌體以及收集菌體和破碎菌體，獲得上清液，然後使用10Ni2+-NTA親和柱純化得到本發明的重組抗原多肽A(328-H8:將上清液緩慢流過Ni2+-NTA親和柱，然後用8倍柱體積緩衝液(20mM磷酸緩衝液，500mM氯花鈉，20mM咪啤)洗柱，最後用洗脫緩衝液(20mM磷酸緩衝液，500mM氯花鈉，250mM咪唑)洗脫本發明的重組抗原多肽AP28-H8。圖3B示出了所製備的重組抗原多肽Ap28-H8的SDS-PAGE鑑定結果，純化得到的重組抗原多肽IAp35-H8的分子量為4.3kDa。本發明設計了重組抗原多肽Ap28-H8的胺基酸序列，並獲得了編碼重組抗原多肽Ap28-H8的基因，使用該基因表達出重組抗原多肽A(328-H8。所述的重組抗原多肽A(328-H8以可溶性多肽形式表達，使用附2+-^7\柱親和層析法得到了本發明的重組抗原多肽Ap28-H8。實施例3製備重組抗原多肽IA(335-H8，包括以下步驟(1)設計本發明的重組抗原多肽本發朋的重組抗原多肽IAP35-H8的設計使得其完整胺基酸序列如SEQIDN0:7所示，它包含了SEQIDN0:3(I)序列、SEQIDN0:2(A(335)和SEQIDN0:4(H8)序列。重組的SEQIDN0:4(H8)序列既是重組抗原多肽的一部分，又是表達的該抗原多肽的純化標籤。(2)合成編碼A卩28-H8的基因及構建重組表達載體依據本發明所設計的重組抗原多肽IAP35-H8的胺基酸序列，先設計並利用DNA合成儀人工合成了編碼IA(335的基因片段，其序列如下ggaattc￡§^§^gcaggtgcagattcagagcctgtttctgttgttgctgtgggttccaggttctcgtggtgctaaatttgttgctgcctggaccctgaaagctgccgctggtggcggtcagtatattaaagctaatagcaaatttattggtattaccgaactggctgccgctgatgcagaattccgtcatgactcEiggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatgctcgagcgg其中5，端有下劃線的catatg序列是內切酶Ndel識別位點，3'端有下劃線的ctcgag序列是內切酶Xhol識別位點。上述所設計併合成的IAP35基因片段的特性與實施例1中IAp28基因的特性相同，但無終止密碼子，因此利用Ndel和Xhol切割位點將此合成的編碼IAj335的基因片段克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，連接後便在3'端融合了載體上的編碼八聚組氨酸(H8)的序列和終止密碼子(caccaccaccaccaccaccaccactaa)，得到完整的編碼IA(335-H8的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:10所示。上述重組表達載體pET41b-IA(335-H8的構建步驟同實施例1中的pET41b-IA(328。提取擴增的重組載體pET41b-IA(335-H8，進行核苷酸序列分析，結果如圖6(pET41b-lAp35-H8質粒核苷酸序列分析譜圖，其中編碼IA(335-H8的基因為核苷酸60359號)所示，證明獲得了編碼完整IAP35-H8的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:10所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。重組表達載體的構建過程如圖7所示，利用Ndel和Xhol切割位點將合成的編碼IAP35-H8的基因克隆進表達載體pET41b中Ndel和Xhol酶切位點之間，成為重組載體pET41b-IAp35-H8。(3)重組抗原多肽IA|335-H8的表達與製備重組表達載體pET41b-IA(335-朋轉化￡co乃'BL21(DE3)宿主細胞的步驟以及IA(335-H8基因的表達步驟同實施例l中pET41b-IA[328的轉化以及IA(328基因的表達。挑取pET41b-IAp35-H8轉化Acoh'BL21(DE3)宿主細胞的單菌落，按與實施例l中相同的方法誘導發酵後的菌體以及收集菌體和破碎菌體，獲得上清液，然後使用N]T-NTA親和柱純化得到本發明的重組抗原多肽IA(335-H8:將上清液緩慢流過Nr-NTA親和柱，然後用8倍柱體積緩衝液(20mM磷酸緩衝液，500mM氯花鈉，20mM咪唑)洗柱，最後用洗脫緩衝液(20mM磷酸緩衝液，500mM氯花鈉，250mM咪唑)洗脫本發明的重組抗原多肽IAp35-H8。圖3C示出了所製備的重組抗原多肽IA(335-H8的SDS-PAGE鑑定結果，純化得到的重組抗原多肽IAp35-H8的分子量為llkDa。本發明設計了重組抗原多肽IAP35-H8的胺基酸序列，並獲得了編碼重組抗原多肽IAP35-H8的基因，使用該基因表達出重組抗原多肽IA|335-H8。所述的重組抗原多肽IA|335-H8以可溶性多肽形式表達，使用Ni2+-NTA柱親和層析法得到了本發明的重組抗原多肽IA(335-H8。實施例4重組抗原多肽Ap28-H8誘導抗體的功效分析(1)抗血清的製備分別以純化的重組抗原多肽IA(328-H8、A(528-H8或IA(335-H8為免疫原，分別與弗氏佐劑按l:l(v/v)相混合，乳化混勻後分別對810隻BALB/c小鼠進行腿部肌肉注射(150pg/次/只)，共免疫7次，初次免疫後間隔為21天，以後每次間隔14天。最後一次免疫結束後7天取血，4°C靜置3小時後4。C4000rpm離心15分鐘，獲得12抗血清。(2)抗體的功效分析由於A(342(即全長的Af3)的寡聚體形式具有較強的神經毒性(BarghornS"s丄Globularamyloidbeta-peptideoligomer-ahomogenousandstableneuropathologicalproteininAlzheimer'sdisease.JNeurochem.2005，95(3):834-47，LeeEB,"s丄Targetingamyloid-betapeptide(Abeta)oligomersbypassiveimmunizationwithaconformation-selectivemonoclonalantibodyimproveslearningandmemoryinAbetaprecursorprotein(APP)transgenicmice./5iWC力柳，2006，281(7):4292-4299)，因此，在此以Ap42的寡聚體作為分析抗體功效的耙標。使用常規間接ELISA方法測定獲得的抗血清的抗體滴度，具體操作如下使用96孔板，每孔加入AP42寡聚體抗原100nl(5pg/ml),37'C包被4小時，用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，每孔加入10(V1封閉液(含ly。牛血清白蛋白的PBS)，37。C封閉2小時，用PBS洗滌，分別加入不同稀釋度的抗血清(1:200、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600)100fxl，每個稀釋度設三個平行樣，37。C孵育1.5小時，用PBS洗滌，每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG100pl(稀釋度1:20000)，於37。C孵育1小時，用PBS洗滌，最後每孔加50plTMB顯色液，10min後加入30|al2M濃硫酸終止顯色。讀取450nm的0D值。以非免疫BALB/c小鼠血清為陰性對照，陽性判斷標準為樣品的OD柳值)陰性對照0D柳值+0.20，且樣品0D45。值^2.IX陰性對照OD柳值。通過Execl軟體及SPSS軟體對數據進行處理和統計學分析，結果表明重組抗原多肽IAp28-H8、A(328-H8、IAp35-H8誘導的抗體的滴度均為1:6400。以PC12細胞(大鼠腎上腺嗜硌細胞瘤)為模型細胞，在PC12細胞中同時加入10plAp42(400jxg/ml)和l.Ojal抗血清，同時以只加入10nlAp42(400嗎/ml)的PC12細胞和正常PC12細胞為對照，以檢測抗血清對Ap42的細胞毒性的抑制作用。結果表明(圖8):只加入Ae42的PC12細胞(圖8C)的存活率明顯低於正常PC12細胞(圖8A)，但同時還加入抗血清的PC12細胞(圖8B)的存活率與正常PC12細胞相比卻無明顯的變化。這說明抗血清對Ae42的細胞毒性具有很強的抑制作用。以上結果表明，應用本發明的重組抗原多肽IAp28-H8、A(328-H8或IA|335-H8誘導產生的抗體體外檢測證明具有明顯的抑制AP42細胞毒性的功效。13附本發明所述重組抗原多肽的胺基酸序列表和融合基因的核苷酸序列表吉林大學<120〉一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽及多肽基因10128<212〉PRT〈213〉人1AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLys20252〈211〉35<212〉PRT人2AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlalielie202530GlyLeuMet35354PRT<213〉人工序列<220〉PROPEP(l)...(54)根據細胞定位和表位性質而設計，以用作免疫增強肽〈400>3MetGinValGinlieGinSerLeuPheLeuLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerArgGlyAlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAla202530AlaGlyGlyGlyGinTyrlieLysAlaAsnSerLysPhelieGlylie354045ThrGluLeuAlaAlaAla5048<212〉PRT<213〉人工序列<220〉PEPTIDE(l)...(8)<223〉根據結合性質和極性而設計，以用作免疫增強肽和親和純化標籤4HisHisHisHisHisHisHis5〈210〉582PRT人工序列CHAIN<222〉(l)...(82)根據細胞表位性質而設計，以用作重組抗原多肽<400〉5MetGinValGinlieGinSerLeuPheLeuLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerArgGlyAlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAla202530AlaGlyGlyGlyGinTyrlieLysAlaAsnSerLsyPhelieGlylie354045ThrGluLeuAlaAlaAlaAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyr505560GluValHisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer65707580AsnLys639PRT人工序列<221〉CHAIN<222〉(l)...(39)根據細胞表位性質而設計，以用作重組抗原多肽6MetAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGin1015AlaGluAspValGlySerAsnLysLeuGluHis2530HisHis1LysLeuValPhe20HisHisHisHis355PheHis<220〉〈221〉<222〉〈400〉99PRT人工序列CHAIN(l)...(99).根據細胞表位性質而設計，以用作重組抗原多肽7MetGinValGinlieGinSerLeuPheLeuLeuUuUuTrpValPro151015GlySerArgGlyAlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAla202530AlaGlyGlyGlyGinTyrlieLysAlaAsnSerLsyPhelieGlylie354045ThrGluLeuAlaAlaAlaAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyr505560GluValHisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer65707580AsnLysGlyAlalielieGlyLeuMetLeuGluHisHisHisHisHis859095HisHisHis8<211〉249DNA<213〉人工序列〈220〉CDS(l).,.(249)<223〉fusiongene<400〉8atgcaggtgMetGinValggtGlygetAlaaccThrg肪Glu65aacAsntctSerggtGlygaaGlu50gttValLyscgtArgggcGly35ctgLeucatHis承cagattGinlie5ggtgetGlyAla20ggtcagGlyGingetgccAlaAlaca/tcsiaHisGincagageGinSera肌tttlysPhetatattTyrliegetgatAlaAsp55aasttgLysLeu70ctgtttLeuPhegttgetValAla25aaagetLysAla40gcagaaAlaGlugtgttcValPhectgttgLeuLeu10gcctggAI3TrpaatageAsnSerttccgtPheArgtttgcaPheAla75ttgctgLeuLeuaccctgTheLeuaaatttLsyPhe45estgacHisAsp60gaagatGluAsptgggttccaTrpV3IPro15aaagetgccLysAlaAla30attggtattlieGlylieteaggatatSerGlyTyrgtgggtteaValGlySer80<211〉<213〉<221〉<400〉9120腿人工序列CDS(l)...(120)fusiongene9atggatgccgaatttMetAspAlaGluPhe15aaattggtgttctttLysLeuValPhePhe20cgtcatgacteaggatatgaagttArgHisAspSerGlyTyrGluVal10gcagaagatgtgggtteaaacaaaAlaGluAspValGlySerAsnLys25catcatcaaHisHisGin15etcgagcacLeuGluHis30C3CC3CC3CC3CC3CC3CCaCt33HisHisHisHisHisHisHis*35<210〉10300<212〉DNA<213〉人工序列<221〉CDS(1)..(300)<223〉fusiongene<400〉10atgcaggtgcagattcagagectgtttctgttgttgctgtgggttccaMetGinValGinlieGinSerLeuPheLeuLeuUuLeuTrpValPro151015ggttctcgtggtgetaaatttgttgetgcctggaccctgaaagetgccGlySerArgGlyAlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAla202530getggtggcggtC3gtat3ttaaagetaatageaaatttattggtattAlaGlyGlyGlyGinTyrlieLysAlaAsnSerLsyPhelieGlylie354045accgaactggetgccgetgatgcagaattccgtcatgacteaggatatThrGluLeuAlaAlaAlaAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyr505560gaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggtteaGluValHisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer65707580aacaaaggtgcaateattggaetcatgetcgagcaccaccaccaccacAsnLysGlyAlalielieGlyLeuMetLeuGluHisHisHisHisHis859095esccacC3CtaaHisHisHisH=權利要求1.一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於包含至少一個免疫增強序列和至少一個人β-澱粉樣肽序列，免疫增強序列通過至少一個共價鍵與所述人β-澱粉樣肽序列相偶聯形成重組多肽，其中所述人β-澱粉樣肽序列具有SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的胺基酸序列，所述免疫增強序列選自下面所述的任一胺基酸序列①SEQIDNO3；(②SEQIDNO4；③①和②的重組形式；④與上述①、②或③至少90％同源的序列。2.如權利要求1所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於共價鍵是肽鍵。3.如權利要求1或2所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於免疫增強序列與人P-澱粉樣肽序列在其N末端或者C末端重組連接。4.如權利要求3所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:5所示。5.如權利要求3所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:6所示。6.如權利要求3所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽，其特徵在於重組抗原多肽的胺基酸序列如SEQIDN0:7所示。7.權利要求1、4、5、6任何一項所述的一種用於治療老年痴呆症的重組抗原多肽在用於預防與治療老年性痴呆症方面的應用。8.—種編碼重組抗原多肽的融合基因，其特徵在於包含至少一個拷貝的編碼免疫增強序列的DNA序列和至少一個拷貝的編碼人(3-澱粉樣肽的DNA序列，編碼免疫增強序列的DNA序列與編碼人p-澱粉樣肽的DNA序列是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接的，其中編碼人p-澱粉樣肽的DNA序列為編碼SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的DNA序列，編碼免疫增強序列的DNA序列選自下面所述的任一DNA序列①編碼SEQIDN0:3的DNA序列;②編碼SEQIDN0:4的DNA序列；③①和②的重組DNA序列；與上述①、②或③至少9(W同源的DNA序列；SEQIDNO:3與SEQIDNO:4的重組DNA序列是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接。9.權利要求8所述的一種編碼重組抗原多肽的融合基因與pET28a、pET20b或pET41b在用於構建重組表達載體方面的應用。10.權利要求8所述的一種編碼重組抗原多肽的融合基因在預防與治療老年性痴呆症方面的應用。全文摘要本發明屬於免疫
技術領域：
，具體涉及一種用於預防與治療老年性痴呆症的重組抗原多肽及編碼這種重組抗原多肽的融合基因。重組抗原多肽包含至少一個免疫增強序列和至少一個人β-澱粉樣肽序列，其中所述人β-澱粉樣肽序列具有SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的胺基酸序列，免疫增強序列選自SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO3和SEQIDNO4的重組形式、或與它們至少90％同源的胺基酸序列。本發明的重組抗原多肽既除去了全長人Aβ的C端毒性片段，提高了抗原肽Aβ的安全性，又重組了免疫增強序列，增強了抗原肽Aβ的免疫原性。文檔編號C07K19/00GK101481421SQ200910066499公開日2009年7月15日申請日期2009年2月4日優先權日2009年2月4日發明者崔理立,張應玖,王嘉鵬申請人:吉林大學