潰瘍性大腸炎或間質性肺炎的病期判定方法及其病期判定用試劑盒的製作方法

2023-05-10 13:34:46

專利名稱：潰瘍性大腸炎或間質性肺炎的病期判定方法及其病期判定用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種潰瘍性大腸炎或間質性肺炎的病期判定方法及其病期判定用試劑盒。
背景技術：
已知潰瘍性大腸炎是難治性炎症疾病，據報導患者數(特定疾病受分配者)在平成14年度為77，073人，每年以約5，000人正在增加。所述潰瘍性大腸炎是一種在大腸的黏膜出現糜爛或潰瘍的大腸的炎症性疾病。該疾病的原因被認為是腸內細菌的參與或免疫功能沒有正常發揮功能的自身免疫反應的異常或者飲食生活的變化的參與等，但尚不清楚。特徵性的症狀是伴有便血或不伴有便血的腹瀉和經常發生的腹痛。病變有從直腸連續地進而向上行性(口側)擴展的性質，最大為從直腸擴展到全部結腸。該疾病根據病變的擴展或病程經過等被如下所述地分類。(1)根據病變的擴展的分類全部大腸炎、左側大腸炎、直腸炎(2)病期的分類活動期、緩解期(3)根據嚴重程度的分類輕症、中等症、重症、嚴重症(4)根據臨床經過的分類復發緩解型、慢性持續型、急性嚴重症型、初次發作型診斷所述潰瘍性大腸炎時，根據作為臨床症狀的持續性或反覆性的粘血、血便或者其既往史進行診斷，進而並用結腸或乙狀結腸內的內窺鏡檢查和活檢，根據需要還進行高度且需要很大費用的灌腸X線檢查或整個大腸內窺鏡檢查。首先，對從臨床症狀獲得的數據進行分析，進行是否需要手術、治療藥的選擇、給藥的中止決定等最佳治療方法的選擇。進而，為了確認病情，進行內窺鏡檢查，但在所述潰瘍性大腸炎的活動期還伴有穿孔或腸道黏膜的損傷導致的出血的危險，反覆的檢查在醫療費用上成為很大的負擔，而且是一種伴隨著給檢查患者帶來負擔和痛苦的方法。另外，有報導前列腺素(prostaglandin)類(以下稱為PGs)或其衍生物在活體內與各種病情之間的關係，已知有以簡單的操作對微量PGs進行定量的方法。作為該測定法， 包括氣相色譜質譜分析法(GC-MQ、放射免疫分析法(RIA)、酶免疫測定法(EIA)等。前列腺素&(PGE)已知為參與活體內的炎症反應的重要的化學介質(chemical mediator)，有報導利用競爭法以酶免疫法測定其尿中的主要代謝物(PGE Main Urinary Metabolite，以下稱為「PGE-MUM」。)的方法(專利文獻1)。而且，本發明人等嘗試著將從所述潰瘍性大腸炎患者得到的尿樣本測定所述 PGE-MUM的值、與數值化所述潰瘍性大腸炎患者的多個臨床症狀(臨床疾病活性)的評分的總評分(修訂TalstacK ^ ^ ^ ^ K )評分(score))聯繫起來(非專利文獻1)。另一方面，已知間質性肺炎為難治性炎症疾病之一。該間質性肺炎是伴有間質的炎症並最終引起肺泡的纖維化的病例的總稱，已知有特發性肺纖維症、非特異性間質性肺炎、特發性器質化肺炎等病例。該間質性肺炎的發生機制尚不很清楚，其診斷需要高度的經驗，存在不得不對每個病例綜合判斷患者的病例、各種採集數據的檢查結果等的困難。為了解決該問題，還對測定血中的骨橋蛋白量得到的值與所述間質性肺炎的症狀之間的關係進行了探討(專利文獻2)。另外，作為判斷該間質性肺炎的症狀的標記物，已知有表面活性蛋白D(SP-D)、表面活性蛋白A(SP-A)、涎液(〉7 > )化糖鏈抗原KL-6等。但是，這些標記物在所述間質性肺炎的症狀進展之後才被作為結果檢測出來，所以可以明確依賴於這些標記物的方法未必適合作為判定所述間質性肺炎的病期的階段的手段。專利文獻1 特開昭61-11664號公報專利文獻2 特開2005-030852號公報非專利文獻1 消化(Digestion) 2000 ；61 :201-20
發明內容
首先，對於所述潰瘍性大腸炎而言，如下所述，目前的潰瘍性大腸炎根據病期被大體上分成2期。活動期(Active phase)自述血便，可見內窺鏡中血管透見像的消失、易出血性、 糜爛或潰瘍等的狀態。緩解期(Remission phase)血便消失、內窺鏡中活動期所見消失、出現血管透見像的狀態。但是，對於所述潰瘍性大腸炎而言，在所述活動期與所述緩解期之間存在被稱為緩解前期(Pre-remission phase)的過渡病期，病理學上可以觀察到從接近所述活動期的緩解前期到接近所述緩解期的緩解前期的寬範圍的病理像。在接近所述緩解期的病例中， 很難客觀地判斷，儘管臨床症狀消失，但在判斷是否中止給藥時，對通過內窺鏡觀察的所見和從活體採集的10處以上的病理組織標本進行分析，利用以下所示的Matts分類對全部組織標本進行評分化，求得評分的平均值，根據多年的經驗作出判斷。已知如果判斷為所述緩解前期已緩解並中止給藥，不僅所述潰瘍性大腸炎會復發，而且會發生向大腸癌移行的可能性等各種問題。所述非專利文獻1顯示所述PGE-MUM的測定結果與表示所述潰瘍性大腸炎的病情的活動期和緩解期的修訂Talstad評分相關，顯示了不進行內窺鏡檢查而判斷病期的標準，但有時在用修訂Talstad評分判斷為緩解期的病例中包含需要繼續給藥的本發明所示的所述緩解前期的病例，無法進行區別。作為在用修訂Talstad評分進行判定中使用的項目，包括腹瀉、體溫、心動過速、紅細胞沉澱速度、血紅蛋白、白細胞、血小板、總蛋白質、白蛋白、鐵等，對測定的各項目數值進行評分化，總計該評分，求得修訂Talstad評分。另一方面，對於間質性肺炎而言，難以判斷活動期與非活動期，為了判定這些病期，除了對所述間質性肺炎的患者進行聽診、X線檢查等以外，必需利用肺組織的活檢來進行病理組織學診斷等。特別是為了實施所述肺組織的活檢，必需向所述患者的氣道中插入內窺鏡等從而實際上從所述患者的體內採集所述肺組織的活檢中所必需的量的肺組織，給所述患者帶來的身體上、精神上的負擔極大。進而，已知如果判斷所述間質性肺炎的病期為非活動期而中止給藥，不僅所述間質性肺炎會復發、進而進展，而且會發生向肺癌移行的可能性等各種問題。另外，對於前面的專利文獻2中的方法而言，必需採集所述間質性肺炎的患者的血漿或血清，經過多階段的操作，對其中所含有的骨橋蛋白量進行定量。本發明的目的在於，提供一種詳細而客觀地對存在於活動期與緩解期之間的所述潰瘍性大腸炎的緩解前期的病期進行分類的方法，提供一種用於對目前即使利用通過內窺鏡的觀察所見或從活體採集的組織標本的分析也難以判斷的所述潰瘍性大腸炎的病期進行判定的簡單的病期判定方法。另外，本發明的目的還在於，提供一種詳細而客觀地對所述間質性肺炎的活動期與所述間質性肺炎的非活動期的病期進行分類的方法，提供一種用於對目前難以判斷的所述間質性肺炎的病期進行判定的簡單的病期判定方法。本發明人等進行了潛心研究，結果發現從被診斷為處於潰瘍性大腸炎的緩解期的患者採集尿，將其尿中含有的所述PGE-MUM濃度的值作為基礎值來事前掌握，在所述患者的所述PGE-MUM濃度顯示出超過該基礎值並在所述基礎值的3倍以下的範圍時，所述患者的病期對應所述潰瘍性大腸炎的緩解前期。進而，本發明人等還發現從被診斷為處於間質性肺炎的非活動期的患者採集尿，將其尿中含有的所述PGE-MUM濃度的值作為基礎值來事前掌握，在所述患者的所述 PGE-MUM濃度顯示出超過該基礎值的範圍時，所述患者的病期對應所述間質性肺炎的活動期，以至完成本發明。S卩，本發明提供以下的(1) (10)。(1)潰瘍性大腸炎的緩解前期與潰瘍性大腸炎的緩解期的病期判定方法，其特徵在於，在伴隨給消炎藥的治療管理下，對診斷為處於所述潰瘍性大腸炎的緩解期的患者的尿中含有的前列腺素主要代謝物(PGE-MUM)進行測定，將得到的所述尿中的PGE-MUM濃度的值作為基礎值，當所述患者的尿中的PGE-MUM濃度的值超過該基礎值並在所述基礎值的3倍以下的範圍時，判定為潰瘍性大腸炎的緩解前期(Pre-remission phase),當所述患者的尿中的PGE-MUM濃度的值在該基礎值以下的範圍時，判定為潰瘍性大腸炎的緩解期(Remission phase)。(2)根據上述(1)所述的病期判定方法，其特徵在於，所述潰瘍性大腸炎的緩解前期為潰瘍性大腸炎的病理學評分(Matts分類)在 2 3的範圍內的情況，所述潰瘍性大腸炎的緩解期為所述Matts分類在不到2的範圍的情況。(3)間質性肺炎的活動期(Active phase)與所述間質性肺炎的非活動期 (None-active phase)的病期判定方法，其是一種通過在伴隨給消炎藥的治療管理下測定間質性肺炎的患者的尿中含有的前列腺素主要代謝物(PGE-MUM)來判斷間質性肺炎的活動期(Active phase)與所述間質性肺炎的非活動期(None-active phase)的病期判定方法。(4)根據上述C3)所述的病期判定方法，其特徵在於，對診斷為處於所述間質性肺炎的非活動期的患者的尿中含有的PGE-MUM進行測定，將得到的所述尿中的PGE-MUM濃度的值作為基礎值，當所述患者的尿中的PGE-MUM濃度的值在超過該基礎值的範圍時，判定為間質性肺炎的活動期，當所述患者的尿中的PGE-MUM濃度的值在該基礎值以下的範圍時，判定為間質性肺炎的非活動期。(5)根據上述(1) 中任意一項所述的病期判定方法，其特徵在於，利用抗PGE-MUM抗體來免疫測定所述PGE-MUM。(6)潰瘍性大腸炎的緩解前期(Pre-remission phase)與潰瘍性大腸炎的緩解期(Remission phase)的病期判定用試劑盒，其含有已標記的PGE-MUM試劑及抗PGE-MUM 抗體試劑，利用樣品中的PGE-MUM測定，判定根據潰瘍性大腸炎的病理學評分(Matts分類)來分類的潰瘍性大腸炎的緩解前期(Pre-remission phase)與潰瘍性大腸炎的緩解期 (Remission phase)0(7)間質性肺炎的活動期(Active phase)與間質性肺炎的非活動期 (None-active phase)的病期判定用試劑盒，其含有已標記的PGE-MUM試劑及抗PGE-MUM抗體試劑，利用樣品中的PGE-MUM測定，判定間質性肺炎的活動期(Active phase)與間質性肺炎的非活動期(None-active phase)。(8)根據上述(6)或(7)所述的病期判定用試劑盒，其中，抗PGE-MUM抗體為抗PGE-MUM多克隆抗體。(9)根據上述(6)或(7)所述的病期判定用試劑盒，其中，抗PGE-MUM抗體為抗PGE-MUM單克隆抗體。(10)根據上述(6) (9)中任意一項所述的病期判定用試劑盒，其中，還含有與抗PGE-MUM抗體發生反應的抗免疫球蛋白抗體試劑。根據本發明，可以通過定量測定尿中的所述PGE-MUM來簡單地辨別所述潰瘍性大腸炎的緩解前期和所述潰瘍性大腸炎的緩解期的病期。另外，可以通過定量測定尿中的所述PGE-MUM來簡單地辨別所述間質性肺炎的活動期和所述間質性肺炎的非活動期的病期。此外，根據本發明的方法，可以將以往使用的利用通過需要熟練而且需要高額檢查費用的內窺鏡等的觀察或從活體採集的病理組織標本的分析來進行判定的方法代替為本發明的方法，所以不會給所述患者帶來像將內窺鏡插入到所述潰瘍性大腸炎的患者或所述間質性肺炎的患者的體內等的檢查或採集所述患者的體內組織等的作手術等所伴隨的身體上、精神上的負擔，結果不依賴於實施檢查的醫師等的個人判斷差異，對於所述潰瘍性大腸炎或所述間質性肺炎而言能夠簡單地判定其病期，所以不僅治療藥的選擇、給藥中止等的判斷變得容易，而且治療效果的判定變得容易，患者的QOL(生活質量(Quality ofLife))的提高或醫療費的削減成為可能。


圖1表示緩解期的潰瘍性大腸炎患者病理照片。觀察到的黒點為顯示若干炎症性細胞浸潤的細胞的核。圖2表示緩解前期的潰瘍性大腸炎患者病理照片。觀察到的黒點為顯示大量炎症性細胞浸潤的細胞的核圖3表示活動期的潰瘍性大腸炎患者病理照片。觀察到的黒點為顯示大量炎症性細胞浸潤的細胞的核，另外還觀察到作為活動期的特徵的細胞浸潤引起的隱窩膿腫。
具體實施例方式利用本發明的方法測定的PGE-MUM (7alpha-hydroxy-5， 11-diketotetranor-prosta-l，16-dioic acid)被發現為是 PGE1 和 E2、特別是 PGE2 向尿中的主要代謝物。在測定所述PGE-MUM的濃度的值時，可以使用尿作為樣本，利用例如GC-MS、 HPLC、使用抗PGE-MUM抗體的免疫測定法等實施。所述PGE-MUM的濃度的值的測定可以同時且簡單地測定大量的樣本，所以優選用免疫測定法實施，優選加入利用氫氧化鈉等進行的鹼處理從而成為化學穩定的二環體的測定法來實施。作為所述免疫測定法中使用的抗 PGE-MUM抗體，例如關於所述抗體可以舉出多克隆抗體或單克隆抗體等。本發明中使用的抗體只要是作為與二環化的PGE-MUM(以下稱為二環PGE-MUM)發生特異性反應的抗體的多克隆抗體或單克隆抗體等，就優選。關於所述抗體，例如可以按照特開昭61-11664號(專利文獻1)中記載的方法製造多克隆抗體。在製造所述抗體時，由於所述PGE-MUM是半抗原 (hapten)，所以首先利用鹼處理使所述PGE-MUM成為PGE-MUM的二環體，在使其與適當的蛋白質例如牛血清白蛋白(BSA)、球蛋白、甲狀腺球蛋白、血藍蛋白等結合之後，與適當的佐劑 (adjuvant)懸濁混合，隔開使用間隔對動物(大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、貓、羊、山羊等)使用，經過規定時間後採集動物的血清，以公知的方法進行處理，從而可以獲得多克隆抗體。另外，單克隆抗體可以利用通過如下所述的過程作成的雜交瘤(hybridoma)產生，即使在作成所述多克隆時使用的PGE-MUM的二環體與所述適當的蛋白質結合，用作免疫原來免疫動物，使從脾臟得到的單克隆抗體產生細胞與腫瘤細胞發生細胞融合，從而作成雜交瘤。所述雜交瘤可以用下面的方法得到。將如上所述得到的PGE-MUM的二環體結合蛋白質與弗氏(7 π 4 >卜)的完全佐劑一起，分數次，每隔2 3周向小鼠等動物進行腹腔內或靜脈給予來進行免疫。接著，使脾臟等來源的抗體產生細胞與來自骨髓瘤細胞株 (line)的細胞(骨髓瘤細胞)等可以在試管內增殖的腫瘤細胞融合。作為融合方法，可以按照 Kohler ( >—，一)和 Milstein ( ^ ^ -i > )的常規方法(自然(Nature)，256 卷，495頁，1975年)，利用聚乙二醇進行，或者也可以利用仙臺病毒等進行。使用利用上述方法得到的抗PGE-MUM抗體，實施所述PGE-MUM的免疫測定。作為該免疫測定法，優選用基於相對測定對象物質的所述PGE-MUM的周知的競爭法的免疫測定法進行，可以舉出用標記物質分類的酶免疫測定法(EIA)、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)等。通常，在競爭法中可以使用已標記的抗原。作為標記物質，例如包括酶、螢光物質、 發光物質、放射性同位素等。標記物與抗原的結合方法可以利用公知的形成共價鍵或非共價鍵的方法來製造。結合的方法例如可以舉出使用縮合劑形成共價鍵的方法、使用各種交聯劑的方法等(例如參照「蛋白質核酸酶」增刊31號，37 45頁(1985))。在利用共價鍵的方法中，除了可以使用存在於抗原的官能團以外，例如還可以在利用常規方法導入硫醇基、氨基、羧基、羥基等官能團之後利用所述結合法製造標記抗原。另外，作為利用非共價鍵的方法，可以舉出物理吸附法等。所述PGE-MUM的測定，例如優選用以下記載的免疫測定法實施。使規定量的所述已標記的PGE-MUM、所述抗PGE-MUM抗體、將要實施測定的含有PGE-MUM的樣本發生競爭性反應，從與所述抗體結合或未結合的已標記的抗原的量來定量所述樣本中的所述PGE-MUM。如上所述，作為所述PGE-MUM，例如優選使用二環化的PGE-MUM( 二環體PGE-MUM)， 作為所述抗PGE-MUM抗體，例如優選使用抗二環PGE-MUM。為了從與所述抗體結合的已標記的抗原中分離沒有結合的抗原，可以進一步加入免疫球蛋白抗體，使其沉澱分離，測定與複合體結合的標記物質或沒有結合的標記物質，由此來實施。該方法被稱為二抗體法，也可以利用使用木炭過濾器(charcoal filter)的方法等來實施。所述抗免疫球蛋白抗體也可以通過測定使其與固相結合的抗免疫球蛋白抗體、 與固相結合的標記物質或沒有結合的標記物質來實施。所述抗免疫球蛋白抗體可以利用周知的方法例如物理吸附法、利用交聯劑或共價鍵的化學結合法、利用抗生物素蛋白-生物素(avidin-biotin)結合的結合法等而與固相結合。當然，在測定所述標記物質時，要對應所述標記物質進行選擇。在本發明的病期判定用試劑盒中含有所述已標記的PGE-MUM試劑、所述抗 PGE-MUM抗體試劑。更優選含有所述二環PGE-MUM試劑、所述抗二環PGE-MUM抗體試劑。進而在試劑盒中，除了與抗PGE-MUM抗體結合的抗免疫球蛋白抗體試劑以外，根據需要還加入樣本稀釋液、試劑稀釋液、已知濃度的標準PGE-MUM等，在EIA時還加入基質、停止液等而構成。作為本發明中使用的實施所述PGE-MUM的測定的樣本，例如可以舉出從人、動物等採集的尿。其中，作為在所述潰瘍性大腸炎的緩解前期和所述潰瘍性大腸炎的緩解期的病期判定中使用的樣本，使用在伴隨給消炎藥的治療管理下採集的所述潰瘍性大腸炎患者的尿。另外，作為在所述間質性肺炎的活動期和非活動期的病期判定中使用的樣本，使用在伴隨給消炎藥的治療管理下採集的所述間質性肺炎患者的尿。作為本發明中使用的消炎藥，例如可以例示甾體皮質激素、非甾體系消炎鎮痛藥 (non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)等。這些消炎藥可以使用一種或兩種以上。所述樣本使用存尿一日份的樣本，但也可以使用不存尿採集的樣本進行測定。採集的尿在用於測定之前優選在低溫、零下20°C以下保存。另外，所述樣本中含有的所述PGE-MUM濃度的值的測定可以以採集的所述樣本全量為標準來實施，也可以考慮利用肌酸酐(creatinine)對採集的所述樣本的一部分進行補正來實施。從操作的簡便性出發，在測定所述樣本中含有的所述PGE-MUM濃度的值時，優選考慮利用肌酸酐對採集的所述樣本的一部分進行補正來實施。下面對本發明中使用的基礎值進行說明。對於所述潰瘍性大腸炎患者的基礎值，可以通過利用上述的方法，測定在伴隨給消炎藥的治療管理下被診斷為處於潰瘍性大腸炎的緩解期的患者的尿中含有的PGE-MUM 濃度的值來得到。另外，對於所述間質性肺炎患者的基礎值，也可以通過利用上述的方法，測定在伴隨給消炎藥的治療管理下被診斷為處於間質性肺炎的非活動期的患者的尿中含有的 PGE-MUM濃度的值來得到。在求所述基礎值時，優選在對被診斷為所述緩解期或所述非活動期的患者給予消炎藥等的基礎上，採集一日存尿或在規定的時刻等採集尿。另外，在規定所述基礎值時，優選預先進行試驗評價考慮估計的測定所述PGE-MUM 的試劑的測定間誤差等，然後再規定。判定所述潰瘍性大腸炎的病期的方法，可以使用利用Matts分類(Matts Classification)的病理學評分。Matts分類對利用內窺鏡從活體採集的多個組織標本進行分析，對全部組織標本以1 5進行評分，求評分的平均值來判斷。Matts分類如表1所不。[表 1]Matts 分類
權利要求
1.一種試劑盒在製造間質性肺炎的活動期與間質性肺炎的非活動期的病期判定用診斷劑中的應用，其中，所述試劑盒含有已標記的PGE-MUM試劑及抗PGE-MUM抗體試劑，利用樣品中的PGE-MUM 測定，判斷間質性肺炎的活動期與間質性肺炎的非活動期。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，抗PGE-MUM抗體為抗PGE-MUM多克隆抗體。
3.根據權利要求1或者2所述的應用，其特徵在於， 抗PGE-MUM抗體為抗PGE-MUM單克隆抗體。
4.根據權利要求1或者2所述的應用，其特徵在於，所述試劑盒還含有與抗PGE-MUM抗體發生反應的抗免疫球蛋白抗體試劑。
全文摘要
本發明提供一種病期判定方法，與以往在潰瘍性大腸炎或間質性肺炎的病期的判定中使用的利用內窺鏡的需要熟練的黏膜病變的觀察或利用從活體提取的病理組織標本的分析不同，本發明提供的方法可以容易地辨別病情、能夠判斷治療藥的選擇、治療效果的程度、給藥中止等，是通過將尿中含有的物質數值化來定量判定病期的方法。測定尿中的前列腺素E主要代謝物(PGE-MUM)的濃度的值，判定潰瘍性大腸炎的緩解前期(Pre-remission phase)和潰瘍性大腸炎的緩解期(Remission phase)的病期。另外，測定尿中的所述PGE-MUM的濃度的值，判定間質性肺炎的活動期和間質性肺炎的非活動期的病期。
文檔編號G01N33/88GK102305865SQ20111024863
公開日2012年1月4日 申請日期2006年4月14日 優先權日2005年4月14日
發明者岡安勳, 林裕造, 藤原睦憲 申請人:岡安勳, 富士瑞必歐株式會社, 林裕造, 藤原睦憲