一種多肽的製作方法

2023-05-10 09:21:46

一種多肽的製作方法
【專利摘要】本發明涉及多肽，相應的核酸分子，包含上述核酸分子的構建體和/或載體和/或細胞，和/或包含所述多肽、核酸分子、構建體、載體和/或細胞的組合物。本發明進一步涉及上述組合物用於醫療用途，優選用於治療傳染病。此外，本發明涉及所述多肽、核酸分子、構建體、載體、細胞和/或組合物作為抗菌劑、優選作為食品添加劑或消毒劑的應用，或用於檢測細菌，優選用於診斷應用。
【專利說明】一種多肽
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多肽，相應的核酸分子，包含上述核酸分子的構建體和/或載體和/或細胞，和/或包含所述多肽、核酸分子、構建體、載體和/或細胞的組合物。本發明進一步涉及上述多肽、相應的核酸分子、包含上述核酸分子的構建體和/或載體和/或細胞、和/或組合物，用於醫療用途，優選用於治療傳染病。此外，本發明涉及所述多肽、核酸分子、構建體、載體、細胞和/或組合物作為抗菌劑、優選作為食品添加劑或消毒劑的應用，或在用於檢測細菌、優選用於診斷應用中的應用。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌是一種主要的人類病原體，其通常牽涉若干嚴重的傳染病和食物中毒。由於新出現的耐抗生素菌株，它的治療變得越來越困難。來自感染金黃色葡萄球菌的噬菌體的內溶素已表明潛在地控制這些病原體並可以用於它們的特異性檢測。在大多數情況下，靶向葡萄球菌物種的內溶素應用的主要障礙是低酶活性、難以大批量生產和/或蛋白質穩定性。
[0003]總是需要關於例如抗微生物活性和/或穩定性具有改善特性的新抗菌劑。

【發明內容】

[0004]本文報導的是新表徵的Ply2638，金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&的內溶素。上述酶和若干工程化衍生物以可溶性方式表達在大腸桿菌中並在凍幹(冷凍乾燥，Iyophilisation)以後顯示出乎意料的穩定性,如在重建(重構,reconstitution)以後由它們的裂解活性所證明的。除細胞壁結合域(其結合葡萄球菌屬的細胞壁)之外，我們還示出，兩個功能域，即M23內肽酶域和醯胺酶域對於最佳的裂解活性是至關重要的。
[0005]我們示出，具有催化結構域的酶的改造和/或源自金黃色葡萄球菌Φ11內溶素、OTwort內溶素、和溶葡萄球菌素的細胞壁結合域的複製產生異源多肽融合產物，其在凍幹和重建以後具有增強的裂解活性和/或改變的pH最適點(最適度,optimum)和/或增加的穩定性。
[0006]核酸分子
[0007]在第一方面，提供了一種核酸分子，其包括第一核苷酸序列或由第一核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與 SEQ ID NO: 12 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性(關於所有本文使用的SEQ ID NO的概述參見表1)。優選地，所述第一核苷酸序列具有至少282、285、290、300、310、320、330、340、350、360或370個核苷酸，更優選至少381個核苷酸的長度，和/或至多510、480、450、420或390個核苷酸的長度。優選地，所述核酸分子具有至少282、285、290、300、310、320、330、340、350,360,370個核苷酸，更優選至少381個核苷酸的長度，和/或至多4500、4200、3900和/或3600個核苷酸的長度。優選地，所述核酸分子具有至少1200、1230、1260、1290、1320、1350、1380、1410、1440、1470、1500、1530 或 1560 個核苷酸的長度，和 / 或至多 4500,4200,3900和/或3600個核苷酸的長度。還優選的是，按照本發明的核酸分子具有至少1890、1920、1950、1980、2010、2040、2070、2100、2130 或 2160 個核苷酸的長度，和 / 或至多 4500、4200,3900和/或3600個核苷酸的長度。優選地，所述第一核苷酸序列編碼細胞壁結合域，其結合葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁。優選地，所述第一核苷酸序列源於金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內溶素。
[0008]如估計自與ALE-1的C端92個殘基的晶體結構的序列對比(Lu et al., J.Biol.Chem.，2006, 281(1): 549-58)，據估計，來自源自金黃色葡萄球菌噬菌體①2638a內溶素的細胞壁結合域的最少94個胺基酸可以足以將上述酶引導到葡萄球菌屬的細胞壁。
[0009]可以利用技術人員公知的測定來評估(結構)域與葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁的結合。在優選的實施方式中，免疫組織化學技術和/或基因融合技術(其產生標記的構建體)用來評估肽、多肽或蛋白質與葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁的特異性結合。在上述免疫組織化學或融合技術中所使用的信號的定量方法是本領域公知的。
[0010]在一種實施方式中，可以利用螢光融合構建體來量化葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合，上述突光融合構建體包含多肽，其包含由第一核苷酸序列編碼的域。由Loessner etal (Molecular Microbiology2002, 44(2):335 - 349)以及在實施例1 中詳細描述了這樣的細胞壁結合測定。在該測定中，使包含所述螢光融合構建體或陰性對照、優選綠色螢光蛋白(GFP)的溶液經受葡萄球菌屬細胞、優選金黃色葡萄球菌細胞、更優選金黃色葡萄球菌BB255指定時間段，其後通過離心作用，和結合的螢光融合構建體一起，沉降細胞。暴露於螢光融合構建體的葡萄球菌屬細胞的螢光信號減去暴露於陰性對照(優選GPF)的葡萄球菌屬細胞的螢光信號是細胞結合的度量，如在本公開中所指的。
[0011 ] 優選地，在本發明的範圍內，核酸分子將編碼多肽域，該多肽域結合葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁，當使用這種測定時，檢測到沉降細胞的螢光信號的增加高於陰性對照(如本文中所定義的)。上述結合優選是特異性的。優選地，本發明涉及核酸分子，該核酸分子編碼多肽或域，其呈現由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內溶素(Ply2638)的肽聚糖細胞壁結合如本文所定義的至少50、60、70、80、90或100、150或200%的結合。
[0012]在一種實施方式中，本發明涉及核酸分子，其與編碼金黃色葡萄球菌噬菌體^2638 內溶素的 SEQ ID NO:1 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0013]本發明進一步涉及核酸分子，除所述第一核苷酸序列之外，其還包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。優選地，所述裂解域呈現肽聚糖水解酶活性(如後文中所定義的)。所述核酸分子包含異源核苷酸序列，其在本文中被定義為「改造構建體(retrofittedconstruct)，，。 [0014]如在本文中所使用的，術語〃異源序列〃或〃異源核酸〃是指這樣的核酸，其不是天然存在的，可操作地連接為所述第一核苷酸序列的鄰近序列。如在本文中所使用的，術語「異源」可以指「重組體」。〃重組體〃是指這樣的遺傳本體(entity)，其不同於一般在天然界中發現的遺傳本體。當應用於核苷酸序列或核酸分子時，這意味著所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制和/或連接步驟、和其它程序(其致使產生不同於在天然界中發現的序列或分子的構建體)的各種組合的產物。
[0015]可以通過技術人員公知的方法來評估「肽聚糖水解酶活性」，其在本文中還被定義為「裂解活性」。在實施方式中，可以用分光光度法並通過測量底物細胞懸浮液的濁度降低來評估裂解活性。優選地，可以用分光光度法測量金黃色葡萄球菌懸液的濁度降低來評估裂解活性，其中通過用分光光度法(Libra S22，BioChrom)測量OD595來量化濁度。更優選地，在37°C下，在PBS緩衝液(pH7.4，120mM氯化鈉衝，連同金黃色葡萄球菌懸浮液(其具有1±0.05的初始OD6tltl，如用分光光度法(Libra S22, Biochrom)所評估的)一起，溫育200nM的由核酸分子(如在本文中識別的)編碼的多肽30分鐘。通過將在溫育30分鐘以前的OD595減去在溫育30分鐘以後的OD595來計算濁度降低。在本發明的範圍內，核酸分子將包含編碼裂解域的核酸序列，當利用這種測定時，檢測到至少10、20、30、40、50或60%的濁度降低。優選地，檢測到至少70%的降低。優選地，本發明涉及核酸分子，該核酸分子編碼多肽，其呈現由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內溶素(Ply2638)的裂解活性的至少50、60、70、80、90、100、150或200%或更高的裂解活性。
[0016]在實施方式中，本發明的核酸分子可以不包含SEQ ID NO:1或者不由SEQ ID NO:1構成。SEQ ID NO:1編碼金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638內溶素。
[0017]優選的實施方式包括核酸分子，該核酸分子包含所述第一核苷酸序列(如本文中所識別的)並進一步包含作為裂解域的第二和第三核苷酸序列，其中所述第二序列編碼內肽酶域以及第三核苷酸序列編碼醯胺酶域。因此，本發明涉及核酸分子，該核酸分子包含所述第一核苷酸序列，其中所述核酸分子與SEQ ID勵:1具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性，或其中所述核酸分子進一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。`
[0018]如在本文中所使用的，內肽酶域優選切割五甘氨酸交聯橋(cross-bridge)(Trayer, H.R.and Buckley, C.E.(1970)Molecular properties of lysostaphin,abacteriolytic agent specific for Staphylococcus aureus.J.Biol.Chem.245, 4842 -4846)，其存在於葡萄球菌屬的細胞壁中，優選存在於金黃色葡萄球菌、模仿葡萄球菌和肉葡萄球菌的細胞壁中。如在本文中所使用的，醯胺酶域優選水解包含Y-穀氨醯基的底物。在用純化肽聚糖溫育包含任何這些域的所述多肽以後，可以通過表徵切割產物來證實在多肽中這些域的功能和活性。優選地，編碼第二或第三域的每個核苷酸序列具有細菌或噬菌體來源。在優選的實施方式中，所述第二和第三核苷酸序列源於編碼酶的基因，上述酶選自由金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11內溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體(pTwort內溶素和模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素組成的組。優選地，所述第二核苷酸序列與 SEQ ID NO: 14 或 15 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性以及所述第三核苷酸序列與SEQ ID NO: 17或18具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 序列同一性。
[0019]本發明包括如本文所定義的所有構建體，其包含在構建體內的任何可能位置處的功能域(如在本發明中所指的)。在優選的實施方式中，如本文所定義的核酸分子編碼多肽，該多肽具有由如本文中所識別的第一核酸序列編碼的C端域，其在本文中顯示編碼能夠靶向葡萄球菌屬的功能多肽。甚至更優選的是如本文所定義的核酸分子，包括這樣的核酸分子，其與 SEQ ID NO:9 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。SEQ ID N0:9包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼C端SH3b同源細胞壁結合域(兩個域均來自由SEQ ID NO:1編碼的Ply2638:Leul38-LyS486 );第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列編碼多肽，其包含N端M23甘氨醯-甘氨酸內肽酶同源域(由SEQ ID NO: 33編碼的成熟溶葡萄球菌素:Alal_Glyl54);以及第三核苷酸序列，其編碼中心醯胺酶-2同源域。它具有58.266kDa的理論大小。由SEQ ID NO:9編碼的多肽與金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內溶素的不同之處在於:N-端M23內肽酶域被來自模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的M23內肽酶域取代。我們在這裡示出，由SEQ IDNO: 9編碼的多肽，相比於金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內溶素，顯示至少20%增加的裂解活性，同時在凍幹和重建以後保持裂解活性。在優選的實施方式中，包含所述第一、第二和第三核苷酸序列的核酸分子編碼多肽，相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體 Φ2638a 內溶素的裂解活性，其呈現至少 0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6、
1.7、1.8、1.9或2倍的裂解活性。在優選的實施方式中，包含所述第一、第二和第三核苷酸序列的核酸分子編碼多肽，相比於新製備的多肽，其在凍幹和重建(如本文所定義的)以後，呈現至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%的裂解活性的降低，其中「新製備的」在本文中優選被定義為，在_20°C下，以1.63mg/mL在凍幹緩衝液(50mM Tris、500mM蔗糖、200mM甘露醇、
0.05%聚山梨酯20+50%甘油)中儲存至多2天，並且在測定中評估裂解活性(如本文中所確定的)之前立即融化。
[0020]凍幹和重建在本文中被定義為通過冷凍乾燥脫水並隨後通過添加水重建樣品。在實施方式中，可以通過針對3次變化的300ml凍幹緩衝液(50mM磷酸鹽或Tris、500mM鹿糖、200mM甘露醇、pH7.4)等分部分進行透析(滲析)並在液氮的氣相中進行冷凍來進行凍幹和重建。可以在標準條件下進行冷凍乾燥，優選地在_40°C和75毫託的真空下60分鐘，接著在5小時內提高溫度至-10°C以及在-10°C和相同真空水平下保持另外60分鐘。作為最後的步驟，優選在10小時內將溫度提高至25°C。通過添加水重建樣品。
[0021]在另一種優選的實施方式中，如本文所定義的核酸分子除上文識別的第一、第二和第三核苷酸序列之外還包含至少一個相同或異源的第一、第二和/或第三核苷酸序列的複製體。優選地，如本文所定義的核酸分子除所述第一、第二和第三核苷酸序列之外還包含重複的相同第一核苷酸序列。我們在這裡示出，如本文所定義的編碼細胞壁結合域的第一核苷酸序列的複製產生多肽，優選地如由SEQ ID N0:20編碼的，相比於由缺少上述重複的第一域的核酸分子編碼的參比多肽的裂解活性，或相比於由SEQ ID N0:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內溶素的裂解活性，其顯示至少5、10、20、30、20或40%增加的裂解活性，如在如本文中所確定的測定中所評估的，更具體地利用等摩爾量的多肽和改變的PBS緩衝液，其包含200、300、400、或1000nM NaCl。該實施方式還包括異源核酸分子，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列源於相同來源，其為金黃色葡萄球菌卩遼菌體0 2638a,所述核酸分子包含以下序列，其與SEQ ID 勵:1具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性，以及另外的重複的、相同的或異源的第一、第二和/或第三核苷酸序列。還優選的是，如本文所定義的核酸分子包含核苷酸序列，其與SEQ ID N0:6 和 20 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。
[0022]在另一種優選的實 施方式中，如本文所定義的核酸分子包含編碼CHAP(半胱氨酸、組氨酸依賴性醯胺水解酶/肽酶)域的第四核苷酸序列。更優選地，所述第四核苷酸序列源於金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11或金黃色葡萄球菌噬菌體ΦΤ\νοι?內溶素。甚至更優選地，所述第四核苷酸序列與 SEQ ID NO: 18 或 SEQ ID NO: 19 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。優選地，如本文所定義的核酸分子包含核苷酸序列，其與SEQ ID ΝΟ:5或7具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。我們在這裡示出以下分子，其包含如由SEQ ID ΝΟ:5所定義的所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列，編碼以下多肽，相比於由缺少所述第四域的構建體編碼的多肽，和/或相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內溶素，其呈現增加的裂解活性和/或改變的、優選降低的pH最適點。用分光光度法並在如前文所定義的條件下評估裂解活性。優選地，相比於由參比多肽編碼的多肽(與所述多肽的差別僅在於缺少所述第四域)的裂解活性，或相比於由SEQ IDNO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內溶素的裂解活性，所述多肽呈現至少0.7、 0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或 2 倍的裂解活性的增加。甚至更優選地，相比於限定的參比多肽或由SEQ ID NO:1編碼的多肽，所述多肽呈現至少2.5倍的裂解活性的增加。
[0023]改變的或降低的pH最適點在本文中被定義為最佳的裂解活性改變或降低至較低的PH值，其中離子強度保持恆定。優選地用分光光度法評估裂解活性(如本文所定義的)。優選地，相比於由參比多肽編碼的多肽(與所述多肽的差別僅在於缺少所述第四域)的裂解活性，或相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內溶素的裂解活性，裂解活性的PH最適點降低0.5-lpH單位。
[0024]本發明優選涉及包含第一、第二、第三和可選地第四核苷酸序列(如本文中所識別的)的核酸分子，其編碼以下多肽，相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638a內溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的pH最適點或者其具有增加的裂解活性和/或降低的PH最適點。當利用如本文中所確定的測定或技術人員公知的方法時，在本文中識別的核酸分子沒有可檢測的差異。本發明還涉及包含如本文中所識別的第一、第二、和第四核苷酸序列的核酸分子，其編碼以下多肽，相比於由SEQ ID N0:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的PH最適點，或者其具有增加的裂解活性和/或降低的pH最適點。本發明還涉及包含如本文中所識別的第一、第三、和第四核苷酸序列的核酸分子，其編碼以下多肽，相比於由SEQID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的PH最適點，或者其具有增加的裂解活性和/或降低的pH最適點。本文識別的每種核苷酸序列，即第一、第二、第三、第四核苷酸序列，其編碼本文定義的多肽的單獨域，可以通過已知用於構建和裝配核酸片段的任何常用方法加以裝配，其中上述常用方法是本領域技術人員公知的並且廣泛描述於文獻(Sambrook, Maniatis et al.(1989))和本公開描述的實驗部分。在優選的實施方式中，第一、第二、第三和/或第四核苷酸序列可操作地連接在一起。
[0025]因此，本發明的核酸分子編碼多肽，優選如本文中所識別的多肽，其能夠藉助於由如本文所定義的第一核苷酸序列編碼的細胞壁結合域來結合葡萄球菌屬，和/或溶解所述細菌，其中藉助於分別由第二、第三和第四核苷酸序列編碼的內肽酶和/或醯胺酶域和可選地CHAP域(如本文所定義的)。[0026]在優選的實施方式中，如本文所定義的本發明的核酸分子可選地包含以下序列，其編碼便於純化的標記。優選地，所述標記選自，但不限於，由FLAG標記、多(His)標記、HA標記和Myc標記組成的組。更優選地,所述標記是6xHis標記。甚至更優選地,所述標記是N端6xHis標記，其相同於SEQ ID NO: 43。
[0027]
[0028]在另外的方面，提供了由如上文識別的核酸分子編碼的多肽。這種多肽包含細胞壁結合域，並且優選地包含內肽酶域和/或醯胺酶域(如在之前的部分中所定義的)。
[0029]本發明包括的多肽域與SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41和/或42優選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。優選地，本發明包括的多肽域優選包含一個或多個假定接頭(連接子，linker)並與SEQID 勵:51、52、53、54、55、56、57和/或58具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0030]本發明包括的多肽與SEQ ID勵:21、25、26、27、29和/或32優選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。更優選地，本發明包括的多肽與SEQ ID勵:25、26、27、29和/或32優選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0031]在本發明的實施方式中，多肽與SEQ ID N0:21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、和/或42優選具有至少80%的序列同一性，其由核酸構建體編碼，上述核酸構建體與 SEQ ID 勵:1、5、6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18和/或19分別具有至少80%的同一性。更優選地，本發明的多肽與 SEQ ID N0:25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、和 /或42具有至少80%的序列同一性，其由核酸構建體編碼，上述核酸構建體與SEQ ID N0:5、
6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18 和 / 或 19 分別具有至少 80% 的同一性。
`[0032]按照本發明的多肽可以具有至少94、95、96、100、110或120個胺基酸，優選127個胺基酸和/或至多1500、1400、1300或1200個胺基酸的長度。優選地，所述多肽的長度為至少 400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510 或 520 個胺基酸和 / 或至多1500、1400、1300或1200個胺基酸。還優選的是，根據本發明的多肽的長度為至少630、640、650、660、670、680、690、700、710 或 720 個胺基酸和 / 或至多 1500、1400、1300 或 1200 個胺基酸。
[0033]本發明包括的胺基酸或核苷酸序列可以源自如本文中所識別的序列中的一種，其中分別取代、插入、缺失、或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或更多個核苷酸或胺基酸。本發明包括的胺基酸序列可以源自如本文中所識別的序列中的一種，其中通過添加另外的N端或C端胺基酸或化學部分，以增加穩定性、溶解性和活性。
[0034]本發明的實施方式包括變體多肽。變體多肽可以是多肽的非天然存在形式。多肽變體可以以一些工程化方式不同於分離自其天然來源的多肽。可以通過開始自SEQ IDNO: 1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20的核苷酸序列的定位誘變來製備變體。優選地，多肽變體包含這樣的突變，其並不改變編碼的多肽的生物功能。按照優選的實施方式，多肽變體呈現葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性，相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內溶素的葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性，其是相同的或增強的。本發明的多肽變體優選是SEQ ID N0:21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41和/或42的變體。具有相同的或增強的葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性的多肽變體是呈現金黃色葡萄球菌肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性的多肽，相比於由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內溶素的葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性(以如上文確定的測定所測得)，其是相同的或增加的。
[0035]按照另一種優選實施方式，本發明的核苷酸序列是SEQ ID N0:l、5、6、7、9、12、13、
14、15、16、17、18、19和/或20的核苷酸序列的變體。核苷酸序列變體可以用於製備如之前定義的多肽變體。核酸變體可以是如上文所定義的任何核苷酸序列的片段。核酸變體還可以是核苷酸序列，其與SEQ ID勵:1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20的差別在於遺傳密碼的簡併度。核酸變體還可以是SEQ ID N0:l、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、
18、19和/或20的等位變體。等位變體表示佔據相同染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式的任何一種。優選的核酸變體是核苷酸序列，其包含沉默突變。可替換地或組合地，還可以通過引入核苷酸取代來獲得核酸變體，上述核苷酸取代並不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另一種胺基酸序列，而是對應於用於產生本發明的多肽的宿主生物體的密碼子選擇。按照優選的實施方式，核酸變體編碼仍然呈現其生物功能的多肽。更優選地，核苷酸序列變體編碼呈現葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性的多肽。甚至更優選地，核酸變體編碼具有如之前定義的增強的葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性的多肽。編碼呈現葡萄球菌屬肽聚糖細胞壁結合和/或裂解活性的多肽的核酸可以分離自任何微生物。
[0036]可以利用技術人員已知的技術來獲得所有這些變體，如在低至中等至高雜交條件下通過雜交篩查文庫(蛋白質印跡(southern blotting)法)可以用來設計探針的核苷酸序列 SEQ ID 勵:1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20或其變體。低到中到高嚴格性條件是指在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200pg/ml剪切和變性鮭魚精DNA中，以及在分別用於低到中到高嚴格性的25%、35%或50%甲醯胺中的預雜交和雜交。隨後，洗滌雜交反應三次，時間為 30分鐘，每次利用2X SSC、0.2%SDS以及用於低到中到高嚴格性的55°C、65。。、或 75。。。
[0037]如本文提供的序列信息不應狹義地解釋為需要包括錯誤識別的鹼基。技術人員能夠確定上述錯誤識別的鹼基並且知道如何校正這樣的錯誤。
[0038]核酸構建體
[0039]在另外的方面，提供了一種核酸構建體，其包含如在前述部分中所識別的核酸分子。這種核酸構建體可以包含第一核酸序列，該第一核酸序列編碼以下多肽，其包含細胞壁結合域，可以進一步包含如在前述部分中所定義的第二和第三以及可選的第四核酸序列。
[0040]本發明還涉及一種表達載體，其包含本發明的核酸構建體。優選地,表達載體包含本發明的核苷酸序列，其可操作連接於一個或多個控制序列，該控制序列引導編碼的多肽在細胞、受試者、或無細胞表達系統中的生產或表達。
[0041 ] 表達載體可以被看作是重組表達載體。可以通過引入根據本發明的核酸分子將質粒、黏粒、噬菌體或病毒轉化，來構建這種載體。根據待轉化的宿主生物體的上述轉化載體是本領域技術人員公知的並且廣泛描述於文獻中。
[0042]本發明的又一個主題是用於宿主生物體的轉化方法，其中通過整合(合併，integrating)本發明的至少一種核酸分子，可以通過任何適當的已知方式來進行上述轉化，其中上述已知方式廣泛描述於專題文獻以及尤其描述於在本申請中引用的參考文獻中，更特別地通過根據本發明的載體。
[0043]MM
[0044]在另外的方面，本發明涉及一種細胞，其包含如本文所定義的本發明的核酸構建體或表達載體。細胞可以是任何微生物、原核或真核細胞，其適用於表達本發明的多肽。在優選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌。在甚至更優選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌 CLlblue MRF。
[0045]方法
[0046]在另外的方面，提供了一種用於生產、可選純化和可選冷凍乾燥如在之前部分中所定義的多肽的方法。所述方法包括以下步驟:
[0047]i)在細胞中生產所述多肽，其中上述細胞包含如在前述部分中所定義的核酸構建體，可選地，
[0048]ii)純化所述多肽，以及可選地，
[0049]iii)冷凍乾燥所述純化多肽。
[0050]在優選的實施方式中，大腸桿菌用於步驟i):用於生產多肽，其中利用重組技術。更優選地，大腸桿菌XLlblueMRF用於步驟i):用於生產多肽，其中利用重組技術。優選地，在步驟ii)中，填充有5mL低密度鎳螯合瓊脂糖珠(ABT珠)的IMAC和Econo-Pac層析柱(Biorad)連同重力流一起用於純化所述(6xHis標記的重組)多肽。可以相對於3x11冷凍乾燥緩衝液透析洗脫的多肽2、4、和12小時，所述緩衝液優選包含50mM磷酸鹽、500mM蔗糖、200mM甘露醇、0.005%聚山梨酯20，ρΗ7.4。
[0051]方法
[0052]在另外的方面，本發明還涉及用於生產具有增強的裂解活性的多肽的方法，其中通過處理如在前述部分中所定義的或如通過上文描述的方法可獲得的多肽。所述處理包括取代二價金屬離子，用於增加裂解活性(相比於未經處理的多肽)，優選地所述方法包括以下步驟:
[0053]i )相對於包含螯合化合物的緩衝液透析(滲析)所述多肽；
[0054]ii)相對於包含二價金屬離子的緩衝液透析(滲析)所述多肽，優選地所述二價金屬離子選自由Mn2+、Co2+、Cu2+、和Zn2+組成的組。
[0055]「螯合化合物」在本文中被定義為結合金屬離子的化合物。公知的螯合化合物是乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)。優選地，EDTA用於本發明的方法的步驟i )。
[0056]優選地，步驟ii)的二價金屬離子選自由Mn2+、Co2+、Cu2+組成的組，更優選地，所述二價金屬離子選自由Mn2+和Co2+組成的組，甚至更優選地，所述二價金屬離子是Mn2+。
[0057]我們示出，通過上文限定的任一種取代二價金屬離子致使Ply2638的裂解活性增加2-2.5倍。用如本文所定義的分光光度法來評估裂解活性。優選地，相比於未經處理的多肽，所述方法致使裂解活性增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍。甚至更優選地，上述方法致使裂解活性增加至少2.5倍。優選地，相比於未經處理的由SEQ IDNO:1編碼的多肽，經處理的 多肽呈現裂解活性增加0.7,0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、
1.5,1.6,1.7,1.8,1.9 至 2 倍。
[0058]組合物[0059]在另外的方面，提供了一種組合物，該組合物包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構建體或多肽或載體或細胞。優選地，本發明涉及一種組合物，該組合物呈現如本文所定義的裂解活性。更優選地，所述組合物用作藥劑。這種藥劑優選用於治療、預防和/或延遲傳染病。本發明還涉及一種藥物或藥用組合物。甚至更優選地，本發明涉及一種用於治療傳染病的藥物或藥用組合物。優選地，本發明涉及一種藥物組合物，用於治療由細菌、優選地葡萄球菌屬的細菌、更優選地金黃色葡萄球菌種的細菌引起的傳染病。優選地，所述傳染病是皮膚感染、乳腺炎、肺炎、腦膜炎、心內膜炎、中毒性休克症候群(TSS)、膿毒症、敗血症、菌血症、或骨髓炎。優選地，所述皮膚感染選自由丘疹、膿皰病、癤、疔瘡、蜂窩織炎、毛囊炎、癰、鱗狀皮膚症候群和膿腫組成的組。
[0060]如本文所定義的組合物可以包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的不同核酸分子、和/或核酸構建體和/或多肽和/或載體和/或細胞的混合物。
[0061]如本文所定義的組合物可以包含一種或多種另外的活性組分。活性組分優選地在本文中被定義為顯示如本文所定義的裂解活性。優選地，所述一種或多種另外的活性組分選自由噬菌體或抗菌素和抗生素組成的組。在本文中涵蓋的噬菌體可以是在文獻中已知的任何噬菌體。優選地，本發明所包括的噬菌體屬於，但不限於，由肌噬菌體科(Myoviridae)、長尾曬菌體科(Siphoviridae)和短尾曬菌體科(Podoviridae)組成的列表中的科。本發明所包括的噬菌體還可以屬於由復層噬菌體科(Tectiviridae)、覆蓋噬菌體科(被脂病毒科，001'1:;[(30￥；[1'丨(136)、脂毛卩遼菌體科(脂毛病毒科，Lipothrixviridae)、芽生卩遼菌體科(Plasmaviridae)、古卩遼菌科(Rudiviridae)、微小紡錘形曬菌體科(福賽爾曬菌體科，Fusel 1viridae )、絲杆曬菌體科(Inoviridae )、微小曬菌體科(Microviridae )、輕小卩遼菌體科(Leviviridae)和囊狀曬菌體科(Cystoviridae)組成的列表中的科。更優選地，所述一種或多種活性組分包含溶葡萄球菌素和/或由溶葡萄球菌素構成，優選與SEQ ID NO:34具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素，更優選SEQ ID NO: 34的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素。甚至更優選地，所述一種或多種活性組分包含一種或多種不同噬菌體以及溶葡萄球菌素和/或由上述兩者組成，優選地，一種或多種不同噬菌體以及模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素(SEQ ID N0:34)。在本發明的範圍內，可以順序和/或同時給予如本文所定義的活性組分的組合。
[0062]如本文所定義的組合物可以進一步包含藥用載體。上述組合物優選用作藥物或藥劑。優選地，藥劑用於治療傳染病。組合物可以具有液體、固體、或者半液體或半固體形式。
[0063]本發明的組合物可以用來治療感染金黃色葡萄球菌的動物(包括人類)。任何適宜的給予途徑可以用來給予所述組合物，包括，但不限於:口服、氣霧劑或用於遞送到肺的其它裝置、鼻噴入、靜脈內、肌內、腹腔內、鞘內、陰道、直腸、局部、腰椎穿刺、鞘內、以及直接施用到腦和/或腦脊膜。
[0064]包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構建體或多肽或載體或細胞的組合物，當它降低在患者中或在所述患者的細胞中或在細胞系中或在無細胞體外系統中存在的葡萄球菌屬的量時，優選是活性的、功能性的、或治療活性的，或者能夠治療、預防和/或延緩傳染病，以及優選意味著葡萄球菌屬的初始量的99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更少仍然是可檢測的。優選地，沒有葡萄球菌屬是可檢測的。在此段落中，短語「葡萄球菌屬的量」優選指活的葡萄球菌屬。可以利用技術人員已知的標準技術來檢測葡萄球菌屬，這些標準技術如免疫組織化學技術(利用葡萄球菌屬特異性抗體)、管凝固酶測試(其檢測葡萄球菌凝固酶或"游離凝固酶")、表面蛋白如凝聚因子(玻片凝固酶測試)和/或蛋白A (商用膠乳測試)的檢測。可以利用技術人員已知的標準技術來檢測活的葡萄球菌屬，如微生物細菌培養技術和/或實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(用來測定細菌mRNA)。優選地,在組織中或者在個體或患者的細胞中，通過比較在用本發明的所述組合物或多肽進行治療以前在所述個體或患者中存在的量，評估所述降低。可替換地，可以與所述個體或患者的組織或細胞進行比較，其中在治療是局部的情況下上述組織或細胞還未用所述組合物或多肽加以治療。
[0065]可以將包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構建體或多肽或載體或細胞的組合物給予患者或所述患者的細胞、組織或器官至少一周、一個月、六個月、一年或更長時間。
[0066]在另一種實施方式中，本發明涉及一種非醫療用組合物，其呈現如本文所定義的結合和/或裂解活性。優選地，本發明涉及一種抗菌劑。優選地，本發明涉及一種抗菌劑，其用於溶解細菌、優選葡萄球菌屬的細菌、更優選金黃色葡萄球菌種的細菌。優選地，本發明涉及一種抗菌劑，其作為食品防腐劑或消毒劑。
[0067]
[0068]在另外的方面，本發明涉及包含由如本文所定義的第一、第二、第三和可選的第四核酸序列編碼的域的多肽的應用，編碼上述多肽的核酸分子的應用，包含上述核酸分子的構建體的應用，包含上述構建體的載體的應用，包含上述載體的細胞的應用，和/或包含任何上述的組合物的應用，優選作為抗菌劑。優選地，本發明涉及作為抗菌劑的應用，用於溶解細菌、優選葡萄球菌屬的細菌、更優選金黃色葡`萄球菌種的細菌。優選地，本發明涉及作為食品防腐劑或消毒劑的抗菌劑。可能地，上述食品防腐劑或消毒劑連同其它抗菌劑一起使用。優選地，上述食品防腐劑或消毒劑連同如本文所定義的一種或多種另外的活性組分一起使用。優選地，所述一種多種另外的活性組分選自由如本文所定義的噬菌體或抗菌素和抗生素組成的組。
[0069]上面提到的多肽、核酸分子、構建體、載體、細胞和/或組合物可以通過許多方式應用於食品、和/或各種待消毒的物理部位，上述方式包括，但不限於，將所述多肽和/或包含本發明的多肽的細胞摻入食品，將所述多肽和/或包含本發明的多肽的細胞噴灑到食品或待消毒的物理部位上。
[0070]本發明的多肽可以分離自細胞，或可以直接應用或給予包含本發明的所述多肽的細胞而無需所述多肽的分離。例如，可以將產生本發明的多肽的細胞給予受試者(人或動物)或應用於表面，其中本發明的多肽將被分泌進入食品，分泌到表面或分泌進入受試者的腸中。然後，本發明的多肽可以結合併可選地溶解在此環境中存在的細菌細胞，優選葡萄球菌屬的細菌，更優選金黃色葡萄球菌種的細菌。
[0071]進一步提供了包含由如本文所定義的第一核酸序列編碼的域的多肽的應用、編碼上述多肽的核酸分子的應用、包含上述核酸分子的構建體的應用、包含上述構建體的載體的應用、包含上述載體的細胞的應用、和/或包含任何上述的組合物的應用，優選用於檢測細菌，更優選用於檢測葡萄球菌屬的細菌，更優選金黃色葡萄球菌種的細菌。優選地，所述多肽、核酸分子、構建體、載體、細胞和/或組合物用於診斷應用。可能地，所述多肽、核酸分子、構建體、載體、細胞和/或組合物連同其它檢測劑一起使用。
[0072]通
[0073]在另外的方面，本發明進一步涉及通過給予如前文所定義的組合物用於治療、延緩和/或預防傳染病的方法。這種方法的所有特點已在本文中加以定義。
[0074]定義
[0075]序列同一件
[0076]"序列同一性"在本文中被定義為在兩個或更多胺基酸(肽、多肽、或蛋白質)序列或兩個或更多核酸(核苷酸、多核苷酸)序列之間的關係，如通過比較序列所確定的。在本領域中，"同一性"還指在胺基酸或核苷酸序列(根據具體情況)之間序列相關的程度，如通過在一系列上述序列之間的匹配所確定的。通過比較一種肽或多肽的胺基酸序列和它的保守胺基酸取代與第二肽或多肽的序列來確定在兩個胺基酸序列之間的"相似性"。在優選的實施方式中，針對如本文中所識別的整個SEQ ID NO計算同一性或相似性。可以通過已知方法容易地計算〃同一性〃和〃相似性〃，包括但不限於以下方法，其描述於Computational Molecular Biology, Lesk, A.Μ., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing:1nformatics and Genome Projects, Smith, D.ff., ed., AcademicPress, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jers ey,1994;Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987;and Sequence AnalysisPrimer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ；以及CariIΙο, Η., and Lipman, D., SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。
[0077]設計用來確定同一性的優選方法以在待測試的序列之間產生最大匹配。用來確定同一性和相似性的方法編碼在可公開獲得的電腦程式中。用來在兩個序列之間確定同一性和相似性的優選電腦程式方法包括例如，GCG程序包(Devereux, J.，et al.，NucleicAcids Researchl2(I):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、和 FASTA (Altschul, S.F.etal.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990) )。BLAST X 程序可公開獲自 NCBI 和其它來源(BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul, S.，et al., J.Mol.Biol.215:403-410 (1990))。公知的 Smith Waterman 算法還可以用來確定同一性。
[0078]用於多肽序列比較的優選參數包括以下各項:算法:Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)；比較矩陣:BL0SSUM62，來自 Hentikoff 和 Hentikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.89:10915-10919(1992);空隙罰分(空位罰分):12 ;以及空隙長度罰分:4。可用於這些參數的程序可公開獲得為來自Genetics Computer Group (位於Madison, WI)的〃0gap〃程序。上述參數是用於胺基酸比較的默認參數(連同沒有對端間隙的罰分)。
[0079]用於核酸比較的優選參數包括以下各項:算法:Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453(1970);比較矩陣:匹配=+10，錯配=0 ;空隙罰分:50 ;空隙長度罰分:3。可獲得為Gap程序，來自Genetics Computer Group (位於Madison, Wis)。上面給出的是用於核酸比較的默認參數。
[0080]可選地，在確定胺基酸相似性的程度時，技術人員還可以考慮所謂的〃保守〃胺基酸取代，如技術人員將清楚的。保守胺基酸取代是指具有類似側鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂族側鏈的胺基酸的組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、和異亮氨酸；具有脂族羥基側鏈的胺基酸的組是絲氨酸和蘇氨酸；具有包含醯胺的側鏈的胺基酸的組是天冬醯胺和穀氨醯胺；具有芳族側鏈的胺基酸的組是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有鹼性側鏈的胺基酸的組是賴氨酸、精氨酸、和組氨酸；以及具有含硫側鏈的胺基酸的組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守胺基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、和天冬醯胺-穀氨醯胺。本文披露的胺基酸序列的取代變體是那些變體，其中在所披露的序列中的至少一個殘基已被除去並在其位置插入不同的殘基。優選地，胺基酸變化是保守的。對於每種天然存在的胺基酸的優選的保守取代是如下:Ala 對 ser ；Arg 對 Iys ；Asn 對 gin 或 his ；Asp 對 glu ；Cys 對 ser 或 ala ；Gln 對 asn ；Glu 對asp ；Gly 對 pro ；His 對 asn 或 gin ；Ile 對 Ieu 或 val ；Leu 對 ile 或 val ；Lys 對 arg、gin或 glu ；Met 對 leu 或 ile ；Phe 對 met、leu 或 tyr ；Ser 對 thr ；Thr 對 ser ；Trp 對 tyr ；Tyr對trp或phe ；以及Val對ile或leu。
[0081]核酸構建體、轉化、表達載體、可操作地連接、表達、控制序列、多肽
[0082]構律體
[0083]由核苷酸序列表示核酸分子。由胺基酸序列表示多肽。核酸構建體定義為核酸分子，其分離自天然 產生的基因或其已被改變以包含以本來不會存在於天然界的方式被合併或並列的核酸區段。通過核苷酸序列表示核酸分子。可選地，存在於核酸構建體中的核苷酸序列可操作地連接於一個或多個控制序列，其引導所述肽或多肽在細胞或在受試者中產生或表達。
[0084]「可操作地連接」在本文中定義為以下構型，其中控制序列被適當地放置在相對於編碼本發明的多肽的核苷酸序列的位置，以使控制序列引導本發明的肽或多肽在細胞和/或受試者中的產生/表達。
[0085]「可操作地連接」還可以用於定義以下構型，其中序列被適當地放置在相對於編碼功能域的另一序列的位置，以使嵌合多肽在細胞和/或受試者中被編碼。
[0086]「表達」將理解為包括任何涉及肽或多肽的生產的步驟，包括，但不限於，轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
[0087]控制序列在本文中定義為包括所有以下組件，其是多肽表達所必要的或者有利於多肽的表達。在最低限度，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。可選地，由在核酸構建體中存在的核苷酸序列表示的啟動子可操作連接於編碼如本文中所識別的肽或多肽的另一種核苷酸序列。
[0088]術語〃轉化〃是指在併入新DNA (即，細胞的外源DNA)以後，在細胞中誘導的永久或瞬時基因變化。當細胞是細菌細胞時，如在本發明中所旨在的，該術語通常是指染色體外的、自我複製的載體，其具有可選擇的抗生素耐受性。
[0089]表達載體可以是任何載體，其可以方便地進行重組DNA程序並且可以引起編碼本發明的多肽的核苷酸序列在細胞和/或受試者中的表達。如在本文中所使用的，術語"啟動子"是指核酸片段，其作用是控制相對於基因的轉錄起始位點的轉錄方向位於上遊的一個或多個基因或核酸的轉錄。它關係到通過針對DNA依賴性RNA聚合酶的結合位點的存在所識別的結合位點、轉錄起始位點、和任何其它DNA序列，包括，但不限於，轉錄因子結合位點、阻抑和激活蛋白結合位點、和本領域技術人員已知的直接或間接地用來調節從啟動子開始的轉錄量的任何其它序列的核苷酸。在本發明的上下文中，啟動子優選終止於轉錄起始位點(TSS)的核苷酸-1。
[0090]如在本文中所使用的，「多肽」是指任何肽、寡肽。多肽、基因產物、表達產物、或蛋白質。多肽由連續胺基酸組成。術語〃多肽〃涵蓋天然存在的或合成的分子。
[0091]在本文件和其權利要求中，動詞〃包含〃和它的結合形式在其非限制性意義上用來指包括在該詞語以後的事項，但並不排除未具體提及的事項。另外，動詞「由……組成」可以由「基本上由……組成」代替，意思是產物或組合物或如本文所定義的核酸分子或核酸構建體或載體或細胞的肽或多肽可以包含除具體識別的成分以外的另外成分，所述另外成分並不改變本發明的獨特特徵。另外，通過不定冠詞〃一 〃或〃 一種〃提及要素並不排除存在多於一種要素的可能性，除非上下文明顯地要求，否則存在一種且僅一種要素。因此不定冠詞〃一 〃或〃 一種〃通常是指〃至少一種"。在本說明書中引用的所有專利和參考文獻的全部內容以引用方式結合於本文。
[0092]以下實施例僅用於說明的目的，而不是用來限制本發明的範圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0093]圖1 對抗金黃色葡萄球菌 SA2638/2854 細胞，Ply2638 (SEQ ID N0:21,由 SEQ IDNO:44編碼)活性依賴於內溶素濃度的線性關係。在標準條件(PBS緩衝液，pH7.4，120mM氯化鈉)下並用光度裂解測定進行測定。最大活性由來自S形裂解曲線的回歸擬合的第一導數確定，藉助於SigmaPlot軟體計算。誤差棒表示標準偏差，其由重複三次的技術實驗計
[0094]圖2 二價陽離子對Ply2638 (SEQ ID N0:21，由SEQ ID NO:44編碼)的裂解活性的影響。用EDTA處理酶，隨後通過針對包含MgCl2、CaCl2, ZnCl2, CuCl2, CoCl2、或MnSO4的MOPS緩衝液的透析取代金屬離子。針對MOPS緩衝液的Ply2638透析(滲析)(省略EDTA處理)用作參比。誤差棒表示標準偏差，其由重複三次的技術實驗計算。
[0095]圖3 在凍幹和重建以後，50nM Ply2638 (SEQ ID NO: 21，由 SEQ ID NO:44 編碼)對金黃色葡萄球菌SA2638/2854細胞的裂解活性。在標準條件下，用濁度降低測定來測量活性。凍幹緩衝液作為對照。在冷凍乾燥以後，三域(三重結構域，triple domain)酶恢復全裂解活性。
[0096]圖4在凍幹和重建(表示為凍幹)以後，相比於新製備的M23_LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID N0:29，由 SEQ ID NO:48 編碼)和 Ply2638 (SEQ ID N0:21，由 SEQ IDN0:44 編碼)，50nMM23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID N0:29，由 SEQ ID N0:48 編碼)對金黃色葡萄球菌SA2638/2854細胞的裂解活性。凍幹緩衝液作為對照。在標準條件下用濁度降低測定來測量活性。在冷凍乾燥以後，三域酶恢復全裂解活性。
[0097]圖5 溶葡萄球菌素(LST ；SEQ ID NO:34,由 SEQ ID NO:33 編碼)和 Ply2638 衍生物(SEQ ID N0:31、30、29、21 和 24，分別由 SEQ ID NO: 11、10、48、44 和 4 編碼)依賴於濃度的相對活性。在50nM下LST的活性設定為參比。在標準條件(37°C，pH7.4和120mM氯化鈉濃度)下並利用來自冷凍儲備液的金黃色葡萄球菌SA2638/2854底物細胞進行所有測定。
[0098]圖6在各種pH值(左圖)和氯化鈉濃度(右圖)下用濁度降低測定確定的截短和(具有PlyTw域)改造Ply2638變體的相對活性。通過兩種催化結構域的一種,酶的截短導致受損的活性。在鹼性pH值和升高鹽濃度下，CBD (M23_Ami_SH3b_SH3b ；SEQ ID NO: 32，由SEQID NO;49編碼)的複製加速裂解。具有CHAPll域的Ply2638改造得到以下酶，其假定會攻擊在葡萄球菌屬的肽聚糖層中的三種不同的鍵。其PH最適點改變到稍酸性條件並改善抗菌活性。然而，嵌合酶的蛋白質穩定性仍然是一個挑戰。在標準條件(PH7.4和120mM氯化鈉濃度)下，Ply2638的最大的溶解速度設定為參比。棒表示重複三次測定的平均值，標準偏差未示出。(CHAP_M23_Ami_SH3b=SEQ ID N0:25，由 SEQ ID NO:45 編碼；Ami_M23_Ami_SH3b=SEQ ID NO: 26，由 SEQ ID NO:46 編碼；M23_Ami_SH3b_SH3b=SEQ ID NO: 32，由 SEQ IDN0:49編碼；M23_Ami_SH3b=SEQ ID NO: 21，由 SEQ ID N0:44編碼；Ami_SH3b=SEQ ID NO: 22，由 SEQ ID N0:2 編碼；M23_SH3b=SEQ ID N0:23，由 SEQ ID N0:3 編碼)。
[0099]圖7在標準條件下，針對使用金黃色葡萄球菌SA2638/2854底物細胞，50nM四域酶(四重結構域酶)(SEQ ID NO: 27 和 28，分別由 SEQ ID NO: 47 和 8 編碼)、Ply2638 (SEQ IDN0:21，由SEQ ID N0:44編碼)、和溶葡萄球菌素(SEQ ID N0:34，由SEQ ID N0:33編碼)的活性。凍幹緩衝液作為對照。通過結合Ply2638、PlyTw、和溶葡萄球菌素的域來構建四域酶。
實施例
[0100]材料和方法
[0101]菌株、培養條件、噬菌體和質粒
[0102]大腸桿菌XLlBlueMRF和大腸桿菌Sure用於6x-His-標記的(SEQ ID N0:43)融合蛋白的過表達。在30°C下，在LB-PE培養基中培養兩種菌株，含有100 μ g/ml氨苄青黴素和30yg/ml四環素，用於質粒選擇。噬菌體2638A裂解液作為模板，用於Ply2638A基因或其域編碼區的擴增。CHAPTw域(SEQ ID NO: 19)由噬菌體Twort裂解液擴增。來自噬菌體11的半胱氨酸-組氨酸依賴性醯胺酶/肽酶(CHAP)域和醯胺酶域(分別為SEQ ID N018和 17 ；Donovan, et al., 2006and2008;Navarre et al., 1999;Sass and Bierbaum2007)由包含phill自溶素基因的pet21a載體擴增,其來自Donovan, D.M.的善意饋贈。包含成熟溶葡萄球菌素的序列(SEQ ID Ν0:33)的質粒LT1215作為模板，用於域擴增M23-LST (SEQID NO:15)和 CWT-LST (SEQ ID NO:13)。
[0103]pQE-30 載體(目錄號:32915，Qiagen，Hilden，德國；SEQ ID NO:50)作為克隆和表達載體，用於分別在大腸桿菌XLlBlueMRF或大腸桿菌Sure中產生6x_His標記的重組融合蛋白。
[0104] DNA技術和克隆程序
[0105]按照Sambrook, Maniatis et al.(1989)的標準技術用於克隆單基因和產生融合蛋白。高保真PCR酶混合物(Fermentas)用於PCR反應。藉助於分光光度計(NanoDropND-1000分光光度計)來確定DNA濃度。
[0106]通過將Ply2638 (SEQ ID NO:1)編碼序列 Metl - Lys486 插入 pQE30 (SEQ IDNO: 50)部位BamH1- Sail 來構建PHP126380PHP12638-P12638 構建體具有連續插入BamH1-Sac1- SalI 部位的相同序列。CHAPll (SEQ ID NO: 18)、Amill (SEQ ID 勵:17)和(:通?_Amill被N端引入BamHI消化的pHPL2638A。在連接反應以前，利用蝦鹼性磷酸酶(SAP，Fermentas)使載體去磷酸化。利用BamHI和SacI限制位點,通過用各自的插入片段替換來自 pHGFP_CBD2638A_c 載體(SEQ ID NO: 59)的 GFP 編碼區來構建 pHM23_CBD2638 (SEQ IDN0:3)和 pHM23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638 (SEQ ID N0:49)。 pHM23_LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO:48)具有pQE_30主鏈，其具有插入BamHI和SacI中的成熟溶葡萄球菌素(SEQ ID NO: 33)編碼序列Alal-Gly 154以及Ply2638部分序列，其編碼在SacI和SalI位點處的 Leul38-Lys486。pHM23-LST_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID NO: 11)具有插入 BamHI和SacI中的成熟溶葡萄球菌素(SEQ ID NO: 33)序列Alal - Gly 154以及插入pQE30的SacI和SalI位點的Alal-Lys246。以相同的方式來構建pHLST-LST (SEQ ID N0:10)，其中在BamH1- SacI和Sac1- Sail位點重複地具有Alal - Lys246。在編碼四域構建體pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CBD2638 (SEQ ID NO:47)和 pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT_LST (SEQID N0:8)的質粒中，通過剪接重疊延伸PCR (SOE)和插入pQE30BamHI和SalI位點，來直接融合域。在兩種構建體中，藉助於生物信息學(未發表的數據)來確定單個域的邊緣區(boarder region)(CHAPTw,SEQ ID NO:19:Metl -1lel40,Ami2638, SEQ ID NO:16:SEQ IDN0:1 的 Lysl41-Gly358，CBD2638，SEQ ID NO: 12:SEQ ID NO:1 的 Trp393-Lys486，M23_LST，SEQ ID NO: 15:SEQ ID NO: 33 的 Alal - Glyl54，CWT-LST，SEQ ID NO: 13:SEQ ID NO: 33 的Trp155 - Lys246)。將具有重複順序的質粒轉移到大腸桿菌Sure菌株中，並將所有其它質粒轉移到大腸桿菌XLlBlueMRF中。
[0107]重組融合蛋白的表達和純化
[0108]基本上如之前由其他人(Loessneret al., 1996, Schmelcher et al.，2010)描述的，進行蛋白過表達和部分純化。簡單地說，在250ml改良LB培養基(15g/l胰蛋白，8g/I酵母提取物，5g/l NaCl, ρΗ7.8)中生長攜帶質粒的大腸桿菌，直到在600nm (0D600nm)處0.4至0.6的光密度並用ImMIPTG加以誘導。在30°C下進一步溫育細胞4小時，或在20°C下溫育18小時，冷卻至4°C，然後通過離心作用收穫。將細胞顆粒懸浮於5ml固定緩衝液(50mM NaH2PO4, 500mM NaCl，5mM咪唑，0.1%聚山梨酯20，pH7.4)中。藉助於通過在1200psi 下操作的弗氏壓力細胞破碎器(French Pressure Cell Press) (1200psi, SLMAminco, Urbana, IL, U.S.)的雙通道來釋放包含可溶性重組蛋白的細胞溶質大腸桿菌內含物。其它下遊處理步驟包括通過離心作用除去不溶性細胞碎片，過濾滅菌(0.2μπι PES膜，Millipore)，以及固定金屬親和層析(IMAC)純化，其中利用填充有低密度N1-NTA超流樹脂(Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland)的 MicroBiospinCBio-Rad, Hercules, CA, U.S.)柱。用5-10柱容積的固定緩衝液對N1-NTA固定蛋白質進行柱上重力流洗滌。然後用洗脫緩衝液(50mM NaH2PO4, 500mM NaCl，125mM咪唑，0.1%聚山梨酯20，pH7.4)洗脫蛋白部分，並針對兩種變化的透析緩衝液(50mM NaH2PO4, IOOmMNaCl, 0.1%聚山梨酯20，pH7.4)加以透析。用NanoDrop ND-1000分光光度計來確定蛋白質濃度，在280nm處校正吸收係數，如藉助於Vector NTI軟體(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.)由一級胺基酸序列計算,並通過SDS-PAGE來估計純度。在與50%甘油混合的情況下，將等分部分存儲於_20°C。
[0109]重組蛋白的凍幹
[0110]針對3次變化的300ml凍幹緩衝液(50mM磷酸鹽或Tris，500mM蔗糖，200mM甘露醇，pH7.4)等分部分透析(滲析)IMAC純化蛋白，並在液氮的氣相中冷凍。在-40°C和75毫託的真空下，進行冷凍乾燥60分鐘，接著在5小時期間提高溫度至-10°C，然後在-10°C和在相同真空水平下保持另外60分鐘。作為最後的步驟，在10小時期間，將溫度提高至25°C。在裂解測定中，在測試以前，通過添加水重建樣品。
[0111]細胞壁結合測定
[0112]作為用來確定CBD引導GFP融合於細菌表面和介導緊密結合於細胞壁配體的能力的標準測定，使用了以下條件:通過離心作用收穫來自晚對數期的細菌，優選金黃色葡萄球菌 BB255，再懸浮於 1/10 容積的 PBS-T(50mM NaH2PO4,120mM NaCl [ρΗ8.0]，0.01% 聚山梨酯20)中，然後存儲在冰上。將GFP-CBD蛋白，優選SEQ ID Ν0:64，由SEQ ID Ν0:60編碼，在相同的緩衝液中稀釋至400ηΜ的濃度(2x GFP-CBD)，並同樣存儲在冰上。在1.5ml微型離心杯中，混合100 μ I細胞和100 μ I的2xGFP-CBD，並在室溫下溫育5分鐘。然後通過在微型離心中的離心作用(16000g，60s)從上清液除去細胞。丟棄上清液並用500 μ I的PBS-T緩衝液洗滌細胞兩次。對於螢光顯微鏡檢術，最後將顆粒再懸浮於50 μ I緩衝液中。對於螢光計測定，最後將顆粒再懸浮於200 μ I的PBS-T中並轉移到微量板孔中。可以利用多標記計數裝置(Victor3, Perkin Elmer, Massachusetts, U.S.)並藉助於無菌的未經處理的黑色96-孔聚苯乙烯微量板(Nunc, Roskilde, Denmark)進行定量突光測定。作為陰性對照，可以使用GFP。
[0113]定量螢光測定
[0114]通過用7.5yg GFP-CBDS2638 融合蛋白(SEQ ID NO: 64，由 SEQ ID NO: 60 編碼)溫育來自Iml容積的設定為(?_Μ1+/-0.05 (約4χ109個細胞)的細胞研究pH和鹽對CBD2638與金黃色葡萄球菌BB255細胞表面配體相互作用的依賴性。這種細胞蛋白比接近飽和點(如在前述實驗中確定的)並使得能夠檢測結合效率的變化。利用檸檬酸鹽緩衝液(PH4.5至
6.5)和磷酸鹽緩衝液(pH6至9)測試不同的pH值。在使用在pH緩衝液中的GFP-CBD2638蛋白溫育以後，用相應的PH緩衝液洗滌細胞，接著是標準PBS-T (pH8)洗滌。最後，將細胞調節到OD595nm=0.3，以藉助於Victor3多標記計數器檢測來自其200 μ I懸浮液的螢光。利用藉助於增加氯化鈉濃度(IOmM NaH2PO4,0 -1OOOmM NaCl, 0.1%聚山梨酯20，ρΗ6)所製備的緩衝液進行類似的實驗。
[0115]通過記錄洗滌和熱滅活細胞(之前用過量GFP-CBD2638蛋白溫育)的相對螢光單位(RFU)來測試具有改變的細胞表面特性的葡萄球菌屬菌株的CBD結合能力的量化。利用在多標記計數裝置中的適當的濾光片組合，來測量相同容積(200 μ I)的GFP-CBD2638標記細胞(調節到OD595nm=0.3)的螢光。以相同方式，對金黃色葡萄球菌ΒΒ255細胞和SDS處理的細胞進行 GFP-CBD2638 (SEQ ID Ν0:64，由 SEQ ID Ν0:60 編碼)、GFP_CBD2638_CBD2638 (SEQID N065 和 / 或 66，分別由 SEQ ID NO: 61 和 62 編碼)、和 GFP-CBD2638-CBD2638-CBD2638(SEQ ID N0:67，由SEQ ID NO:63編碼)的吸收水平的比較和量化。
[0116]裂解測定
[0117]使用於裂解活性測定的底物細胞生長至在600nm(0D600)處0.4的光密度，用PBST(pH7.4)洗滌兩次，並再懸浮於包含15%甘油的PBS緩衝液(pH7.4)中，同時將其濃縮100倍。在_20°C下存儲細胞。為了進一步用於結合或裂解活性測定，融化細胞，用PBS(pH7.4)洗滌，並稀釋至1±0.05的0D600。在標準裂解活性測定中，將蛋白樣品稀釋至等摩爾量並分布於透明的96-孔組織培養試驗板(SPL life sciences, Pocheon, Korea)。加入底物細胞至最終體積並在37°C下記錄在595nm (0D595nm)處的光密度降低約I小時。
[0118]在裂解測定中，針對來自冷凍儲備液的噬菌體26 38A繁殖株金黃色葡萄球菌SA2638/2854，測試Ply2638的改造和檢測構建體的裂解活性。我們測試了在各種緩衝液條件下的活性。利用檸檬酸鹽/磷酸鹽緩衝液(25mM檸檬酸鹽、25mM磷酸鹽、120mM NaCl,pH4.6-6.6)和Tris/磷酸鹽緩衝液(25mM Tris、25mM磷酸鹽、120mM NaCl)，測試了增量為
0.4的從4.6至9的pH值。在0至1000mM氯化鈉(在IOmM磷酸鹽緩衝液中，pH7.4)的鹽濃度下，測試了 Ply2638A衍生物的活性。在裂解測定中，在其施加之前，用MQ將Ply2638A衍生物稀釋至10 PM的最終濃度。此處，利用多通道移液管，將4 ill的IOiiM Ply2638A衍生物施加於196 ill基底細胞懸浮液，從而得到200nM蛋白的測定濃度。基底細胞懸浮液製備自冷凍儲備液:用PH或鹽緩衝液將其稀釋並用分光光度法(Libra S22, Biochrom)將其標準化至1±0.05的初始0D600。在I小時期間，利用Victor31420多標記分析儀(MultilabelCounter instrument) (Perkin Elmer)來測量在 595nm (0D595)處光密度的降低。在每個單讀數以後，劇烈搖晃平板I秒(雙軌道，0.1mm直徑)。作為陽性對照，使用N端6xHis標記的溶葡萄球菌素(HLST),市售溶葡萄球菌素(重組,源自大腸桿菌，Sigma)。作為陰性對照，使用MilliQ水。
[0119]二價金屬離子對Ply2638的活性的影響
[0120]針對包含EDTA的緩衝液(50mM MOPS、IOOmM氯化鈉、0.005%聚山梨酯20、IOmMEDTA)透析部分純化的Ply2638 (SEQ ID N0:21) 2小時，接著針對包含相應的二價金屬離子的緩衝液(50mM MOPS，IOOmM氯化鈉，0.005%聚山梨酯20，以及分別IOmM CaCl2UOmMMgCl2UmM CoCl2UmM CuCl2UmM MnSO4、或ImM ZnCl2)進行透析。在用於標準裂解測定中之前，SDS處理和EDTA洗滌用作底物的細胞。
[0121]表 L SEQ ID NO 識別
[0122]
【權利要求】
1.一種包含第一核苷酸序列的核酸分子，其中，所述核苷酸序列與SEQ ID N0:12具有至少80%的序列同一性。
2.根據權利要求1所述的核酸分子，其中，所述第一核苷酸序列編碼細胞壁結合域，所述細胞壁結合域結合葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁。
3.根據權利要求1和/或2所述的核酸分子，其中，所述第一核苷酸序列源於金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內溶素。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子與SEQID NO:1具有至少80%的序列同一性，或者其中所述核酸分子進一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子進一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列，其中所述裂解域是第二和第三核苷酸序列，以及其中所述第二核苷酸序列編碼M23內肽酶域並且所述第三核苷酸序列編碼醯胺酶域。
6.根據權利要求5所述的核酸分子，其中，所述第二和第三核苷酸序列源於編碼酶的基團，所述酶選自由金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 11內溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體?Twort內溶素、和模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素組成的組。
7.根據權利要求6所述的核酸分子，其中，所述第二核苷酸序列與SEQID: 14或15具有至少80%的序列同一性以及所述第三核苷酸序列與SEQ ID NO: 16或17具有至少80%的序列同一性。
8.根據權利要求7所述的核酸分子，其中，所述核苷酸分子與SEQID NO:9具有至少80%的序列同一性。
9.根據權利要求4-8中任一項所述的核酸分子，進一步包含編碼CHAP(半胱氨酸、組氨酸依賴性醯胺水解酶/肽酶)域的第四核苷酸序列。
10.根據權利要求9所述的核酸分子，其中，所述第四核苷酸序列源於金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11或金黃色葡萄球菌噬菌體OTwort內溶素。
11.根據權利要求10所述的核酸分子，其中，所述第四核苷酸序列與SEQID NO: 18或SEQ ID NO: 19具有至少80%的序列同一性。
12.根據權利要求4-11中任一項所述的核酸分子，編碼多肽，相比於由SEQID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內溶素，所述多肽具有相同或增加的裂解活性和/或相同或降低的PH最適點。
13.一種多肽，由如在權利要求1-12中任一項所識別的核酸分子編碼。
14.一種核酸構建體,包含如在權利要求1-12中任一項所識別的核酸分子。
15.一種表達載體，包含如在權利要求14中所限定的核酸構建體，可操作地連接於一個或多個控制序列，所述一個或多個控制序列引導所編碼的多肽在細胞、受試者、或無細胞表達系統中的產生或表達。
16.一種細胞，包含如在權利要求14中所識別的核酸構建體或如在權利要求15中所識別的表達載體，所述細胞是微生物、原核或真核細胞。
17.一種用於生產、可選地純化和可選地冷凍乾燥如在權利要求13中所限定的多肽的方法，所述方法包括以下步驟:i)在如在權利要求16中所識別的細胞中產生所述多肽，包括如在權利要求14中所限定的核酸構建體，可選地， ii)純化所述多肽，以及可選地， iii)冷凍乾燥純化的所述多肽。
18.一種用於生產具有增強的裂解活性的多肽的方法，通過處理如在權利要求13中所識別的多肽和/或通過權利要求17所述的方法可獲得的多肽，其中，所述方法包括以下步驟: i)針對包含螯合化合物的緩衝液透析所述多肽， ii)針對包含二價金屬離子的緩衝液透析所述多肽，優選地所述二價金屬離子選自由Co2+、Cu2+、Mn2+、和 Zn2+ 組成的組。
19.一種組合物，包含如在權利要求1-12中任一項所識別的核酸分子、如在權利要求13中所識別的和/或通過如在權利要求17和/或18中所確定的方法可獲得的多肽、和/或如在權利要求14中所識別的核酸構建體、和/或如在權利要求15中所識別的載體、和/或如在權利要求16中所識別的細胞。
20.根據權利要求19所述的組合物，包含一種或多種另外的活性組分，優先選自由噬菌體和抗生素組成的組。
21.根據權利要 求19和/或20所述的組合物，用作藥劑。
22.根據權利要求21所述的組合物，用作治療傳染病的藥劑。
23.根據權利要求1-12中任一項所述的核酸分子、根據權利要求13和/或通過如在權利要求17和/或18中所確定的方法可獲得的多肽、根據權利要求14所述的核酸構建體、如在權利要求15中識別的載體、如在權利要求16中所識別的細胞、和/或根據權利要求19和/或20所述的組合物作為抗菌劑、優選作為食品添加劑或消毒劑的應用。
24.根據權利要求1-3中任一項所述的核酸分子，由上述核酸分子編碼的多肽，核酸構建體，和/或包含上述核酸構建體的載體和/或細胞，或者包含上述多肽、核酸分子、核酸、載體和/或細胞中的任一種的組合物用於檢測葡萄球菌、優選在診斷應用中的應用。
25.一種用於治療、延緩和/或預防傳染病的方法，通過給予如在權利要求19和/或20中所限定的組合物。
【文檔編號】C12N9/36GK103703127SQ201180072127
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2011年5月4日 優先權日:2011年5月4日
【發明者】馬丁·約翰內斯·勒斯納, 弗裡茨·艾興澤埃爾 申請人:邁克瑞歐斯人體健康有限公司