淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法

2023-05-10 03:43:36

專利名稱：：淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及的魚類肌球蛋白調節輕鏈基因表達量的快速檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(l)PCR擴增反應液包括10XPCR反應緩衝液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dTTP)、2-4mmol/L硫酸鎂、l-2UTaq酶、0.2-0.6翻1/L上遊引物、0.2-0.6翻1/L下遊引物、1X0.2XSY服GreenI染料其中10XPCR反應緩衝液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100;其中目的基因引物和內參基因引物參數如表1。表1用於螢光定量分析的目的基因引物和內參基因引物參數tableseeoriginaldocumentpage4其中上遊引物、下遊引物、SYBRGreenI染料的體積比為1:1:1;其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。(2)對照cDNA實驗組上面所述PCR擴增反應液，每管24uL的最佳組成為2.5uLIOXPCR反應緩衝液、2uL2.5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL10umol/L目的基因上遊引物、luL10umol/L目的基因下遊引物、luLSYBRGreenI染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(滅菌雙蒸水)。對照組上面所述PCR擴增反應液，每管24uL的最佳組成為2.5uL10XPCR反應緩衝液、2uL2.5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL10umol/L內參基因上遊引物、luL10umol/L內參基因下遊引物、luLSYBRGreenI染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(滅菌雙蒸水)。使用上述試劑盒檢測魚類肌球蛋白調節輕鍊表達量的方法，依次包括下列步驟(1)_(3):(1)待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成採用Trizol—步抽提法提取待檢樣品總RNA，然後用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成；(2)魚類肌球蛋白調節輕鏈的實時螢光PCR擴增A.在裝有24uL分別含目的基因引物、內參基因引物的兩支PCR擴增反應液A的反應管中加入luL待檢樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95°ClOs，l個循環；95°C5s，1個循環，預變性；58°C20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。(3)應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。第一步判斷能否檢測出肌球蛋白調節輕鏈。如待測樣品出現擴增曲線，且Ct值小於或等於41，陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白輕鏈。如待測樣品Ct值大於或等於45，陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品未檢出肌球蛋白輕鏈。如待測樣品Ct值在41—45之間，應重作實時螢光PCR擴增。再次擴增後的結果Ct值仍小於45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白輕鏈；再次擴增後的結果Ct值大於45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品未檢出肌球蛋白調節輕鏈。第二步通過比較閾值法來測定目的基因的相對表達量。根據數學推導得出，肌球蛋白調節輕鏈基因的量=2—AACt，在該公式中，Ct是熱循環儀檢測到反應體系中螢光信號的強度值，AACt=(Ct目的基因_Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。實時螢光定量PCR結束後，目的基因的量的實驗數據用Excel2003軟體進行初步處理，接著採用SPSS12.0或SASS軟體對所得表達豐度數據進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，最後採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比較，以對比樣品中調節輕鏈基因的表達量。本發明建立了淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量的實時螢光PCR檢測試劑盒及檢測方法。本試劑盒根據淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因的保守序列，設計了特異性引物。該保守基因序列通過對Genebank登錄的各魚種肌球蛋白調節輕鏈基因的核酸序列的比對獲得，可保證不同魚種、不同組織、不同發育時期肌球蛋白輕鍊表達量的檢出。本發明採用Trizol—步抽提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、需要量少但提取質量高的特點，採用實時螢光PCR法進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用於魚類樣品量少的肌球蛋白調節輕鏈基因表達量的對比。有益效果本發明建立了淡水魚類淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量的實時螢光PCR檢測試劑盒及檢測方法。本試劑盒根據淡水魚類淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因的保守序列，設計了特異性引物。該保守基因序列通過對Genebank登錄的各魚種淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因的核酸序列的比對獲得，可保證不同魚種、不同組織、不同發育時期淡水魚類肌球蛋白調節輕鍊表達量的檢出。本發明採用Trizol(Invitrogen)—步抽提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、需要量少但提取質量高的特點，採用實時螢光PCR法進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用於魚類樣品量少的淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因表達量的對比。圖1用實時螢光PCR技術檢測某待測草魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；圖2數據處理後胚胎發育時期MLC2mRNA相對表達量；圖3用實時螢光PCR技術檢測某待測鱖魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；圖4數據處理後胚胎發育時期MLClmRNA相對表達量。具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發明。實施例1:按下列配方製作原腸階段(gastrula)和尾芽階段(tailbud)的草魚普通肌肌球蛋白調節輕鏈的實時螢光PCR檢測試劑盒包括10XPCR反應緩衝液、0.2mmol/LdNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸鎂、1.5UTaq酶、1X—0.2XSYBRGreenI染料、0.4umol/L上遊引物0.4umol/L下遊引物；其中10XPCR反應緩衝液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X—00;其中dNTlP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。按照以下程序進行檢測具體步驟如下1、採用Trizol—步抽提法提取不同階段草魚普通肌總RNA，併合成cDNA第一鏈(1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmLTrizol溶液，然後剪碎魚樣約100mg，置於該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。(2)將勻漿液轉移至1.5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分裂解。(3)將第(2)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心10min。(4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1.5mL離心管中。並加入0.2mL的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。(5)將第(4)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心15min。(6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然後再在12000rpm，4t:離心10min。(7)棄上清，用1ml75%乙醇洗滌沉澱。(8)棄75%乙醇，重複步驟(7)，並於8000rpm4。C離心10min。(8)棄75%乙醇，真空乾燥5min，使剩餘酒精完全揮發。(9)沉澱用100ii1DEPC處理H20溶解，_80"凍存或直接用於RT—PCR。取上述DNaseI處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，獲得樣品的cDNA，反轉錄產物(RTProducts)於-20。C保存備用2、待測樣品cDNA的實時螢光PCR擴增A.在裝有24uL分別含目的基因引物、內參基因引物的兩支PCR反應管中加入PCR反應液A和luL樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95。C10s，1個循環，預變性;95。C5s，1個循環，變性;58°C20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。3、應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。樣品出現擴增曲線，見圖1。實驗數據經過Excel2003軟體的初步處理，再採用SPSS12.0軟體對所得表達豐度數據進行單因素方差分析(0ne-WayAN0VA)並採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比較，見圖2，發現原腸階段MLC2相對表達量與尾芽階段相比有差異(p<0.05)，即尾芽階段的MLC2要多。實施例2:按下列配方製作肌肉效應期和仔魚期鰱魚普通肌的肌球蛋白調節輕鏈基因的實時螢光PCR檢測試劑盒包括10XPCR反應緩衝液、0.2mmol/LdNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸鎂、1.5UTaq酶、0.4umol/L上遊引物0.4umol/L下遊引物、1X—0.2XSYBRGreenI染料；其中10XPCR反應緩衝液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X—100;其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。按照以下程序進行檢測1、採用Trizol—步抽提法提取不同時期鱖魚普通肌的總RNA，併合成cDNA第一鏈(1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmLTrizol溶液，然後剪碎魚樣約100mg，置於該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。(2)將勻漿液轉移至1.5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分裂解。(3)將第(2)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4t:離心10min。(4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1.5mL離心管中，並加入0.2mL的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。(5)將第(4)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心15min。(6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然後再在12000rpm，4t:離心10min。(7)棄上清，用1ml75%乙醇洗滌沉澱。(8)棄75%乙醇，重複步驟(7)，並於8000rpm，4。C離心10min。(8)棄75%乙醇，真空乾燥5min，使剩餘酒精完全揮發。(9)沉澱用100ii1DEPC處理H20溶解，_80"凍存或直接用於RT—PCR。取上述DNaseI處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，獲得樣品的cDNA，反轉錄產物(RTProducts)於-20。C保存備用。(2)待測魚樣cDNA的實時螢光PCR擴增A.分別在兩支PCR反應管中加入24uL分別含目的基因MLC2、內參基因GAPDH的PCR反應液和luL樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95°ClOs，l個循環；95°C5s，1個循環，預變性；58°C20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。(3)應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，，比較表達量的多少。樣品出現擴增曲線，見圖3。實驗數據經過Excel2003軟體的初步處理，再採用SPSS12.0軟體對所得表達豐度數據進行單因素方差分析(0ne-WayAN0VA)並採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比較，見圖4發現肌肉效應階段MLC2相對表達量與仔魚階段相比有顯著差異(P<0.05)，即仔魚階段的MLC2要多。權利要求淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特徵在於，PCR擴增反應液A包括10×PCR反應緩衝液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dTTP)、2-4mmol/L硫酸鎂、1--2UTaq酶、0.2-0.6umol/L上遊引物、0.2-0.6umol/L下遊引物、1×0.2×SYBRGreenI染料；其中10×PCR反應緩衝液含有100mmo/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷--鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通x--100；2.根據權利要求l中所述的淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特徵在於，所述的上遊引物、下遊引物、SYBRGreenI染料的體積比為1:1:1。3.根據權利要求1中所述的淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特徵在於，所述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。4.快速檢測魚類淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因表達量的方法，其特徵在於，依次包括下列步驟(1)待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成；(2)魚類淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈的實時螢光PCR擴增；A.在裝有24uLPCR擴增反應液A的反應管中加入luL待檢樣品DNA，混勻；B.將PCR反應管放入螢光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增；95°ClOs，l個循環，預變性;95°C5s，l個循環，變性;58°C20s，退火延伸，45個循環，PCR擴增。(3)應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。全文摘要本發明為淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法，試劑盒包括PCR擴增反應液A、對照cDNA；PCR擴增反應液A含有10×PCR反應緩衝液、硫酸鎂、dNTP(含dUTP)、Taq酶、上遊引物、下遊引物、SYBRGreenI染料，魚類淡水魚類肌球蛋白調節輕鏈基因表達量的快速檢測方法包括魚的總RNA提取、魚類肌球蛋白基因的實時螢光PCR擴增和結果判定。本發明的優點是需要量少、快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重複性好。文檔編號C12Q1/68GK101736086SQ20101002200公開日2010年6月16日申請日期2010年1月5日優先權日2010年1月5日發明者周瑞雪,張建社,蒙濤,褚武英,趙發蘭,陳敦學申請人:長沙學院