與豬生長速度相關的snp標記及其應用的製作方法

2023-05-10 03:41:31

與豬生長速度相關的snp標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種與豬生長速度相關的SNP標記及其應用，其位於豬LXRα基因第5外顯子的201bp處，此處鹼基為A的豬的生長速度顯著高於此處鹼基為C的豬的生長速度。本發明採用聚合酶鏈式反應(PCR)和測序技術篩選到與豬生長速度相關的SNP標記，並通過限制片段多態性(RFLP)方法來檢測待測豬的基因型，根據基因型進行生長速度快的優勢豬品種的選育，從而加快豬的育種進程。
【專利說明】與豬生長速度相關的SNP標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於豬分子標記遺傳育種領域，具體地說，涉及一種與豬生長速度相關的 SNP標記及其應用。

【背景技術】
[0002] 養豬業是我國畜牧業生產的主體，其產值長期以來始終都是畜牧業總產值的第一 位。隨著人們生活水平的提高，對肉食品的數量和質量需求不斷提高，如何培育出生長速度 快並且肉質風味好的豬種是當前豬育種工作的熱點。
[0003] 我國豬種資源豐富，為豬育種提供良好的素材，也為研究重要經濟性狀的基因和 分子標記提供良好的材料。藏豬是我國特有的高原型豬種，體小皮薄、肉嫩味美，風味濃鬱， 肉質細膩、風味獨特，素有"高原之珍"的美譽（劉軒，強巴央宗，王強等.藏豬繁殖性狀多 基因效應分析·遺傳，2010, 32 (5): 480-485)。藏豬產於我國青藏高原海拔2500?4300m 區域，對高原低氧、低溫和粗放的飼養環境有較強的適應性，是發展我國高海拔地區養豬業 的重要品種資源。滇南小耳豬是雲南省西雙版納州小型地方品種，具有適應熱帶雨林的區 高溫潮溼的生態環境，早熟易肥、屠宰率高、抗逆性強、皮薄骨細、肉質鮮嫩、營養豐富等優 點（馬俊松，馬啟文，段勇，連林生.原生態養殖版納小耳豬肥育性能、胴體及肉質測定.養 豬，2009,（2) :37-38)。藏豬和滇南小耳豬均屬於小型地方品種，是研究豬生長和肉質性狀 基因的良好材料。
[0004] 隨著分子數量遺傳學、分子生物學技術的飛速發展，有關分子遺傳標記和標記 輔助選擇的研究被廣泛開展，並在畜禽育種中應用，產生了巨大的影響。生長性狀是豬 育種中選擇的主要目標之一，不同品種或類型的豬生長速度有明顯的差別。從分子水 平上鑑定影響生長速度的基因或標記是目前豬功能基因研究的熱點之一（姜運良，李 寧，杜立新，吳常信.豬肌肉生長抑制素基因5'調控區T - A突變與生長性狀的關係分 析.遺傳學報.2002,29(5):413 ?416;六81&]1〇，]^111；[111?，03￥67 6，]\1。1^'5^11了，]\11111611 A,Gispert Mj Sweeney T!Variation in the IGF2gene promoter region is associated with intramuscular fat content in porcine skeletal muscle. MolBiol Rep, 2012, 9(4) :4101 - 4110)。研究者曾通過對基因的多態性與生長性狀的關聯分析，認為生 長激素基因 （Paszek A A，Wilkie P J，Wilkie P J，Flickinger G H，et al. Interval mapping of growth in divergent swine cross. MammGenome. 1999,10(02) :117 ?122; Bidanel J P，Milan D，Iannuccelli N，et al. Detection of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs. Genet Sel Evol. 2001，5-6,33 (03) :289 ?309 ;LEE S J，McPherron A C. Myostatin and the control of skeletal muscle mass. CurrOpin Genet Dev. 1999,9(05) :604_607)、類膜島素生長因子 II 基因 （Burgos C，Galve A，Moreno Cj et al. The effects of two of IGF2on fat content in pig carcasses and pork. Meat Sci，2012, 90 (2) :309-313)、PITl 基因 （Yu T P，Schmitz C B，Rothschild M F，Tuggle C K.Association of PlTlpolymorphisms with growth and carcass traits in pigs. J Anim Sci. 1995, 73 (05) : 1282 ?1288)、MC4R 基因 （Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin_4receptor(MC4R)gene is associated with fatnsee growth, and feed intake traits. Mamm Genome. 2000,11:131 ?135)和 瘦素受體（Kennes Y M，Murphy B D，Pothier F，Palin M F. Characterization of swine leptin(LEP)polymorphisms and their association with production traits.Anim Genet. 2001,32(04):215-218)等與豬的生長速度有關。但目前，在豬分子育種實踐中仍然 缺少功能明確、效應顯著主效基因和分子標記。
[0005] 肝X受體（包括LXRa和LXRP )是核激素受體超家族的成員，在 動物的肝臟、脂肪組織和骨骼肌中表達水平較高（Joyce J. R印a，Guosheng Liang, JiafuOu, et al. Regulation of mouse sterol regulatory element-binding protein-lc gene(SREBP-lc)by oxysteroI receptors, LXRa and LXR β [J]. Mol CellBiol，2000, 14:2819?2830)，對骨骼肌細胞內脂肪沉積起重要作 用(George E.0.Muscat, Brandee L.Wagner, JinzhaoHou, et al.Regulation of cholesterol homeostasis and lipid metabolism in skeletal muscle by liver X receptors[J]· JBiol Chem，2002,277,40722 ?40728)。Malek 等（MassoudMalek，Jack C. M. Dekkers, Hakkyo K. Lee, et al.A molecular genome scan analysis to identify chromosomal regions influencing economic traits in the pig.I. Growth and body composition [J] · MammGenome, 2001，12 (8) : 630 ?636)報導，豬眼肌面積、大理石紋的 QTL 和背最長肌總脂肪含量的QTL在LXRa和LXR β基因區域。Yu等發現豬LXRa基因 Exon 2 的 Bsl I 位點多態性與瘦肉率相關（Μ. Yu, Β. Geiger, Ν. Deeb, et al. Liver X receptor alpha and beta genes have the potential role on loin lean and fat content in pigs [J]· J Anim fceed Genet，2006 (123) :81 ?88)。李慶崗等（李慶崗，王志秀，張 博等.淮豬新品系LXRa基因 Bsl I位點多態性及其與生長性能的相關性分析[J].養 豬，2013, 5:46?48)進一步分析發現LXRa基因 Exon2-Bsl I基因型豬生長速度相關。 祝繼原等（祝繼原，劉娣，俄廣鑫等.豬LXR a基因多態性及其與生長性狀的相關性分析 [J]·東北農業大學學報，2011，42 (3): 127?130.)發現豬LXR a基因 Intron2內一個SNP 對法系長白豬個體的出生胸圍有顯著影響。然而，目前已經報導的豬LXRa基因多態位點， 要麼基因型效應不高，要麼檢測方法不夠準確方便。因此，需要繼續對該基因進行功能SNP 位點的篩選和鑑定，開發快速準確的檢測方法。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種與豬生長速度相關的SNP標記及其應用。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明將豬LXRa基因作為生長相關的候選基因，採用PCR 測序技術篩選不同類型豬群體間差異的SNP位點，建立了快速檢測方法，在品種間和品種 內鑑定SNP位點與豬生長速度的相關性，獲得了影響豬生長性狀的SNP位點及基因型效應。
[0008] 本發明的一種與豬生長速度相關的SNP標記，其位於豬LXRa基因第5外顯子的 201bp處（或如SEQ ID No. 1所示序列的172bp處），此處鹼基為A的豬的生長速度顯著高 於此處鹼基為C的豬的生長速度。
[0009] 本發明還提供用於檢測所述與豬生長速度相關的SNP標記的引物，包括正向引物
[0010] 本發明還提供所述與豬生長速度相關的SNP標記在鑑定快速生長的優勢豬品種 中的應用，其包括步驟：
[0011] 1)提取待測豬的基因組DNA ;
[0012] 2)以待測豬的基因組DNA為模板，利用引物F和R，通過PCR反應擴增出豬LXRa 基因462bp片段；
[0013] 3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中172bp處的鹼基為A，則待測豬屬於快 速生長的優勢豬品種。
[0014] PCR反應使用的擴增體系以25μ 1計為：100ng/yL模板DNA lyL，5pmol/yL引 物 F和 R各 lyL，10mmol/L dNTP mix 2.0yL，5U/yL Taq DNA聚合酶0.5 4 1^，10父？0?反 應緩衝液2.5 μ L，餘量為水。
[0015] PCR反應使用的條件為：95°C 5分鐘；95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 20秒，36個循 環；72°C 7分鐘。
[0016] 檢測PCR擴增產物採用RFLP法，具體為：用內切酶Taq I對PCR擴增產物進行酶 切，並對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結果為兩條帶，則判定基因型為AA 型，待測豬屬於生長快速的優勢豬品種；檢測結果出現三條帶，則判定基因型為CC型，待測 豬屬於普通品種；檢測結果為四條帶，則判定基因型為AC型，待測豬屬於生長快速的優勢 豬品種。
[0017] 本發明還提供含有上述引物F和R的用於檢測豬生長速度的試劑盒。優選地，所 述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩衝液中的一種或多種。更優選地， 所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0018] 本發明進一步提供所述與豬生長速度相關的SNP標記在豬分子標記輔助育種中 的應用。
[0019] 本發明提供了一種與豬生長速度相關的SNP標記及其應用，既採用聚合酶鏈式反 應（PCR)和測序技術篩選到與豬生長速度相關的SNP標記，並通過限制片段多態性（RFLP) 方法來檢測待測豬的基因型，根據基因型進行生長速度快的優勢豬品種的選育，從而加快 豬的育種進程。
[0020] 本發明優點在於：（一）本發明提供的分子遺傳標記不受豬的年齡、性別等限制， 可用於豬的早期選育，甚至在豬剛出生時就可準確地進行篩選，可大大縮短世代間隔，加快 豬的育種進程；（二）檢測方法快速、準確。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明實施例1中豬LXRa基因 Exon5位置測序圖。
[0022] 圖2為本發明實施例2中豬LXRa基因 Exon5擴增結果；瓊脂糖膠濃度為1%;圖 中Marker為DM2000Plus ;1-12泳道片段大小均為462bp。
[0023] 圖3為本發明實施例2中豬LXR α基因 PCR-Taq I-RFLP檢測結果；瓊脂糖膠濃度 為 3% ;圖中 Marker 為 DM2000Plus ;泳道 1、2、3、6、7、9、10、13、14 為 AA 基因型；泳道 4、5、 8、11、12為AC基因型；泳道15、16為CC基因型。

【具體實施方式】
[0024] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
[0025] 實施例1豬LXRa基因 SNP位點的篩選
[0026] 選擇中國地方品種"藏豬"（採自西藏農牧學院教學實習牧場）、
[0027] "滇南小耳豬"（採自雲南省西雙版納州滇南小耳豬資源保護場）和引進品種"大 約克豬"（採自安徽科鑫養豬育種有限公司）的耳組織樣本，採用苯酚/氯仿法提取組織基 因組DNA。
[0028] 從NCBI上下載豬LXRa基因序列（GenBank登錄號：NC_010444.3)，利用軟體 Primer Premier 5.0,根據從NCBI上下載的LXRa基因的DNA序列，設計以下引物：
[0029] 正向引物 F : 5' -ATCTCTTCCTTGTCTTTACCC-3'
[0030] 反向引物 R : 5' -CAATCCCTTTGTGATCTCAG-3'
[0031] 用上述引物在藏豬、滇南小耳豬、大約克豬基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體 係為25 4 1^，其中10\?0?反應緩衝液2.5 4 1^，10臟〇1/1(1階1311^叉2.(^1^，5口111〇1/^1^的 正反向引物各14 1^，了&9〇嫩聚合酶（5"4 1^)0.5 4 1^，0嫩模板14 1^嫩約10〇1^)，加(1(1 H2O至25 μ L。PCR反應條件為：第1步95°C變性5min ;第2步95°C變性30s ;第3步58°C 復性30s ;第4步72°C延伸30s ;重複第2至第4步36個循環；然後72°C延伸7min，最後降 溫至4°C保存。
[0032] 對上述3個豬種的PCR產物經Gel Extraction Kit試劑盒（購自上海生物工程 技術有限公司，按照試劑盒說明書操作）純化。每個豬種分別選10個個體進行PCR擴增， 每個體的PCR產物各取8 μ L，混池成一個樣本進行測序（北京諾賽生物科技公司）。擴增 產物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0033] 三個豬種的測序結果經Chromas和DNAMAN軟體比對，在如SEQ ID No. 2所示的序 列中第323bp處存在一個A鹼基到C鹼基的突變（圖1)，該位點位於LXRa基因外顯子5 區域的第201bp處，因此記為Exon5-A201C。經序列分析LXRa基因 Exon5-A201C為錯義突 變，導致編碼蛋白的胺基酸由丙氨酸突變為絲氨酸。
[0034] 實施例2豬LXR a基因 Exon5_A201C位點PCR-RFLP檢測方法的建立
[0035] 為了快速方便的檢測豬LXRa基因 Exon5-A201C處多態性，經序列限制性內切酶 分析，發現該位點突變可以被Taq I內切酶（TCGA)識別。針對Exon5-A201C突變位點的位 置，根據 LXRa 基因序列（GenBank 登錄號：NC_010444. 3)，利用軟體 Primer Premier 5.0 設計新的擴增引物，引物序列為：
[0036] 正向引物 F : 5' -AAGAAACTGAAGCGGCAAGAG-3'
[0037] 反向引物 R : 5, -ATCGCAGAGGTCTTTAGGAGG-3'
[0038] 用該對引物對藏豬、滇南小耳豬、大約克豬等基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應 體系為 25yL，其中 IOXPCR 反應緩衝液 2.5yL，10mmol/L dNTP mix 2.0yL，5pmol/yL 的引物各 luL，Taq DNA 聚合酶（5U/yL)0.5yL，DNA 模板 lyL(DNA 約 lOOng)，加 dd H2O 至25 μ L。PCR反應條件為：第1步95°C變性5min ;第2步95°C變性30s ;第3步58°C復性 30s ;第4步72°C延伸20s ;重複第2至第4步36個循環；然後72°C延伸7min，最後降溫至 4Γ保持。
[0039] PCR擴增產物用濃度為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統中 觀察PCR擴增效果，可見到片段大小為462bp的清晰條帶（圖2)。該PCR產物用Taq I內 切酶酶切，反應體系為：1〇Χ酶切緩衝液1 μ L，Taq I內切酶0.25 μ L(濃度為IOU/μ L)， PCR產物4yL，加 dd H2O至10yL。65°C酶切4-8h。然後，將得到的酶切產物在3%瓊脂糖 凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統中觀察（圖3)，判斷基因型。當擴增片段的172bp 處鹼基均為C時，Taq I內切酶可識別該位點，可將PCR擴增片段切成三個片段，長度分別 為290bp，113bp和58bp，該基因型記為CC型；當172bp處的鹼基都為A時，PCR擴增片段切 成兩個片段，長度分別為348bp和113bp，該基因型記為AA型；當172bp處既含有C鹼基又 含有A鹼基時，即凝膠電泳中含有四條帶，長度分別為348bp，290bp，113bp和58bp，該基因 型記為雜合型AC型。
[0040] 實施例3與豬生長速度相關的SNP標記在不同豬群中的多態性檢測
[0041] 採集藏豬（西藏林芝工布江達縣）、滇南小耳豬（雲南西雙版納）、大蒲蓮黑豬（山 東嘉祥）、大約克豬（安徽科鑫養豬育種有限公司）、長白豬（北京中順景盛養殖有限公司） 和杜洛克豬（安徽科鑫養豬育種有限公司）耳組織樣品，採用苯酚/氯仿法提取豬個體基 因組DNA樣品。
[0042] 採用實施例2中建立的PCR-RFLP技術，測定藏豬個體LXR α基因 Exon5_A201C的 PCR-Taq I-RFLP基因型，檢測結果如表1所示。
[0043] 表1豬LXR α基因 Exon5_A201C位點多態性分布
[0044]

【權利要求】
1. 一種與豬生長速度相關的SNP標記，其特徵在於，其位於豬LXR a基因第5外顯子的 201bp處，此處鹼基為A的豬的生長速度顯著高於此處鹼基為C的豬的生長速度。
2. 用於檢測權利要求1所述與豬生長速度相關的SNP標記的引物，其特徵在於，包括正
3. 權利要求1所述與豬生長速度相關的SNP標記在鑑定快速生長的優勢豬品種中的應 用，其包括步驟： 1) 提取待測豬的基因組DNA ; 2) 以待測豬的基因組DNA為模板，利用權利要求2所述引物F和R，通過PCR反應擴增 出豬LXRa基因462bp片段； 3) 檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中172bp處的鹼基為A，則待測豬屬於快速生 長的優勢豬品種。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟2)中PCR反應使用的擴增體系 以 25 ii 1 計為：lOOng/ ii L 模板 DNA1 ii L，5pmol/ ii L 引物 F 和 R 各 1 ii L，10mmol/L dNTP mix2.0iiL，5U/iiL Taq DNA 聚合酶 0.51^，10\?0?反應緩衝液2.51^，餘量為水。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟2)中PCR反應使用的條件為：95°C 5 分鐘；95 °C 30 秒，58 °C 30 秒，72 °C 20 秒，36 個循環；72 °C 7 分鐘。
6. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟3)中檢測PCR擴增產物採用RFLP 法，具體為：用內切酶Taq I對PCR擴增產物進行酶切，並對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳 檢測，如果檢測結果為兩條帶，則判定基因型為AA型，待測豬屬於生長快速的優勢豬品種； 檢測結果出現三條帶，則判定基因型為CC型，待測豬屬於普通品種；檢測結果為四條帶，則 判定基因型為AC型，待測豬屬於生長快速的優勢豬品種。
7. 含有權利要求2所述引物的用於檢測豬生長速度的試劑盒。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應緩衝液中的一種或多種。
9. 根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10. 權利要求1所述與豬生長速度相關的SNP標記在豬分子標記輔助育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404133SQ201410557725
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月20日 優先權日:2014年10月20日
【發明者】張 浩, 張博, 徐艾詩, 商鵬, 王志秀 申請人:中國農業大學