重組醯胺酶Dt-Ami7、編碼基因、載體、工程菌及應用的製作方法

2023-05-09 21:51:26 1

重組醯胺酶Dt-Ami 7、編碼基因、載體、工程菌及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種來源於代爾夫特菌Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的重組醯胺酶Dt-Ami 7、編碼基因、重組載體及工程菌。該醯胺酶基因可與表達載體連接構建得到含該基因的胞內表達重組質粒，轉化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組醯胺酶，可以利用重組大腸桿菌或純化的重組醯胺酶為催化劑催化系列醯胺化合物的水解。
【專利說明】重組醯胺酶Dt-Ami 7、編碼基因、載體、工程菌及應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種醯胺酶Dt-Ami 7及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和 重組表達轉化體，以及該醯胺酶Dt-Ami 7或含有該酶的重組細胞為催化劑在催化一系列 脂肪族醯胺中的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 醯胺酶（Amidase，EC 3. 5. 1. 4)能水解醯胺生成相應的羧酸和氨，若在羥胺或者 肼存在的條件下則生成相應的氧肟酸和醯肼。作為腈轉化酶家族中的重要一員，醯胺酶具 有良好的立體選擇性，在動力學水解外消旋醯胺或前手性化合物的去對稱作用中發揮重要 作用。在化學工業中，醯胺酶通常與腈水合酶耦聯用於製備各類有機酸，如苯甲酸、丙烯酸、 吡嗪酸及煙酸等；同時也被應用於藥物合成、廢水處理等。在近幾年，醯胺酶已成為綠色合 成化學的一類關鍵生物催化劑，日益受到工業界的重視。
[0003] 醯胺酶的來源十分廣泛，包括細菌、酵母、真菌，甚至植物和動物。根據劃分標準 的不同，醯胺酶可以分為很多種。如根據醯胺酶基因的上下遊是否存在有編碼腈水合酶基 因，可以分為與腈水合酶耦聯的醯胺酶和非耦聯的醯胺酶；根據它們立體選擇性的不同， 可以劃分為S-型醯胺酶和R-型醯胺酶；根據它們的底物專一性可分為短鏈和中鏈脂肪 族醯胺水解酶；還可以根據胺基酸序列保守區域的不同，劃分為醯胺酶標籤家族（Amidase Signature Family, AS)和腈水解酶家族（Nitrilase Family, NF)兩大類。
[0004] 目前，國內外報導克隆的醯胺酶多以AS家族為主，關於其酶學特性的表徵和研究 也較為系統。相對於AS家族醯胺酶，NF家族的醯胺酶研究較少。通常NF家族醯胺酶底物 譜較窄，一般只能催化短鏈脂肪族醯胺水解。克隆該家族的醯胺酶並對其進行表徵，可為完 善醯胺酶的應用和系統研究，為其分子水平上的分類定義提供堅實的理論基礎。 (三）


【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供一種來源於代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis)ZJB_05174 的醯胺酶Dt-Ami 7及編碼基因、載體，工程菌，以及該醯胺酶的應用。
[0006] 本發明採用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種來源於代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis)ZJB_05174的重組 醯胺酶Dt-Ami 7,所述醯胺酶的胺基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 醯胺酶Dt-Ami 7通過基因挖掘的方法獲得，所設計的挖掘方法具體為：根據NF家 族醯胺酶保守序列有針對性地尋找NCBI收錄的基因編碼的胺基酸序列，進一步篩選可匹 配催化三聯體Cys-Glu-Lys的目的序列。選定一批預測的醯胺酶，將所選的醯胺酶進行克 隆表達，構建重組大腸桿菌細胞。通過本實驗室方法（ZL200510062182)進行醯胺酶活力的 篩選，最終獲得催化性能較佳的醯胺酶Dt-Ami 7。
[0009] 由於胺基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO :2所示胺基酸序列的多肽的片段或 其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬於本發明保護範圍之列。具體的，所述改變可包括胺基酸 序列中胺基酸的缺失、插入或替換；其中，對於變體的保守性改變，所替換的胺基酸具有與 原胺基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。
[0010] 本發明還提供一種所述重組醯胺酶Dt-Ami 7在水解醯胺製備羧酸中的應用， 所述的應用為：將含重組醯胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌經發酵培養獲得的溼菌體用pH 8. OTris-HCl緩衝液懸浮後進行超聲破碎，取上清液純化（優選Ni-NTA柱層析）後為催化 齊U，以式（I )或式（II )所示化合物為底物，以PH 6?9的Tris-HCl緩衝液為反應介質 構成反應體系，在25?45°C下進行水解反應，反應結束後，將反應液分離純化，獲得羧酸產 物；
[0011]

【權利要求】
1. 一種來源於代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis)ZJB_05174的重組醯胺酶Dt-Ami 7,其特徵在於所述醯胺酶Dt-Ami 7的胺基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. -種權利要求1所述重組醯胺酶Dt-Ami 7在水解醯胺製備羧酸中的應用，其特徵 在於所述的應用為：將含重組醯胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌經發酵培養獲得的溼菌體用 pH 8.0Tris-HCl緩衝液懸浮後進行超聲破碎，取上清液純化後作為催化劑，以式（I )或 式（II )所示化合物為底物，以pH 6?9的Tris-HCl緩衝液為反應介質構成反應體系，在 25?45°C下進行水解反應，反應結束後，將反應液分離純化，獲得羧酸產物；
式（I )中札為C1?C4烷基，式（II )中R2為C1?C4烷基。
3. 如權利要求2所述應用，其特徵在於所述催化劑的用量以破碎前溼菌體重量計為 1?10g/L反應體系，所述底物初始濃度為20mmol/L反應體系。
4. 如權利要求2所述應用，其特徵在於所述底物為丙醯胺、正丁醯胺、丙烯醯胺、戊醯 胺、己醯胺、（S)-乳醯胺或（R)-乳醯胺。
5. 如權利要求2所述應用，其特徵在於所述催化劑按如下方法製備：將含重組醯胺酶 Dt-Ami 7基因的工程菌經發酵培養獲得的溼菌體用pH 8. OTris-HCl緩衝液懸浮後進行超 聲破碎，將破碎混合液離心，取上清液進行Ni-NTA柱層析，以洗脫緩衝液洗脫，收集目標蛋 白，將收集的目標蛋白在20mM，pH 8. 0的Tris-HCl中透析過夜，取透過液即獲得催化劑；所 述洗脫緩衝液為含終濃度500mM咪唑和終濃度500mM NaCl的20mM、pH 8. OTris-HCl的緩 衝液。
6. -種編碼權利要求1所述重組醯胺酶Dt-Ami 7的基因。
7. 如權利要求6所述編碼基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
8. -種由權利要求6所述編碼基因構建的重組載體。
9. 一種含權利要求6所述編碼基因或權利要求8所述重組載體的基因工程菌。
10. -種權利要求6所述編碼基因在構建能夠生物催化醯胺製備羧酸的重組醯胺酶 Dt-Ami 7中的應用，其特徵在於所述的應用為：構建含有所述重組醯胺酶Dt-Ami 7基因的 重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養 液分離純化獲得含有重組醯胺酶Dt-Ami 7的菌體細胞。
【文檔編號】C12N15/55GK104293753SQ201410481953
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優先權日:2014年9月19日
【發明者】鄭裕國, 鄭仁朝, 吳哲明, 沈寅初 申請人:浙江工業大學