一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法及其配用的試劑盒和其用途的製作方法

2023-05-10 15:19:51

專利名稱：一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法及其配用的試劑盒和其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學檢驗測定技術領域，具體涉及一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方
法及其配用的試劑盒和其用途。
背景技術：
現有技術中用Trinder氏法定量測定腺苷脫氨酶活性在臨床化學檢驗上較為普遍，但是，Trinder氏法缺點在於沒能使用一種公認的標準法測定的腺苷脫氨酶標準品，從而造成測試精確度下降、不同實驗室應用不同生化分析儀引起的儀器誤差，此外還是腺苷脫氨酶正常參考範圍數據混亂、不可比擬性的主要原因。 腺苷脫氨酶脫氫酶法應用腺苷脫氨酶解腺嘌呤核苷酸生成次黃嘌呤核苷和氨，氨和a-酮戊二酸以及還原性輔酶在穀氨酸脫脫氫酶的作用下反應生成穀氨酸及輔酶，在340nm處檢測NADH的消耗速率來測定腺苷脫氨酶活性通過制定氨標準曲線，可定量腺苷脫氨酶活性，腺苷脫氨酶活性定義為在腺苷脫氨酶脫氫酶法條件下37t:每分鐘產生一個P mol氨所需腺苷脫氨酶的量，其原理反應方程式如下
腺苷脫氨酶
腺嘌呤核苷酸+水--^次黃嘌呤核苷+氨
穀氨酸脫氫酶
氨+ a —酮戊二酸+還原性輔酶I 二鈉鹽--^穀氨酸+輔酶 但是腺苷脫氨酶脫氫酶法可定量測定腺苷脫氨酶活性，但此法易受外源性氨的幹擾，不適於臨床生化檢驗。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，而提供一種在Trinder氏法中加入腺苷脫氨酶標準品，用腺苷脫氨酶脫氫酶法確定腺苷脫氨酶標準品的活性，再應用Trinder氏法以腺苷脫氨酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中腺苷脫氨酶活性，從而保證精確度高，測定速度快，且減少了儀器誤差以及增強了腺苷脫氨酶正常參考範圍數據的可比性的定標測定腺苷脫氨酶活性的方法。 本發明的另一個目的是提供用以實現定標測定腺苷脫氨酶活性的方法的配用的試劑盒。 本發明的第三個目的是用以實現定標測定腺苷脫氨酶活性的方法的配用的試劑盒的用途，以提供腺苷脫氨酶的活性測定用於急性肝損傷及殘留病變的診斷以及協助慢性肝病及肝纖維化的診斷。 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種定標測定腺苷脫氨酶活性的
4方法，其特徵是包括以下步驟 步驟一是確定腺苷脫氨酶標準品的活性； 步驟二是再通過腺苷脫氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黃嘌呤氧化酶及過氧化物酶酶解生成醌化合物； 步驟三是以連續監測醌化合物在546nm處吸光度的上升速率結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中腺苷脫氨酶的活性。
採取的措施還包括 在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法中，所述的步驟一中具體操作為將腺苷脫氨酶樣本與試劑RI同時加入，並孵育180秒，然後加入試劑RII，再孵育420秒加入試劑RIII，在340nm處定量測定吸光度，並用不同濃度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm處用測試儀定量測定吸光度，以此畫出標準曲線，有腺苷脫氨酶標準品的吸光度從標準曲線上求出對應的氨濃度，並將其除以反應時間既得出腺苷脫氨酶標準品活性。
在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法中，所述的試劑RI包括0. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/L的還原型輔酶I 二鈉鹽、1. 50X 10—3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸單鈉鹽以及0. 1Omol/L的且pH值為7. 20的磷酸緩衝液，所述的試劑RII為200U/ml的穀氨酸脫脫氫酶，所述的試劑RIII包括1. 20X 10—2mol/L的腺苷，2. 00X 10—5mol/L的乙二胺四乙酸二鈉，其中所述的試劑RII和試劑RIII均用pH7. 20磷酸緩衝液配置。
在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法中，所述的腺苷脫氨酶樣本為10iiL，試齊U I為200iiL，試劑II為20iiL，試齊U III為50 y L，腺苷脫氨酶樣本與試劑I同時加入，在第180秒加入試劑II，在第420秒加入試劑III，且溫度反應溫度控制37°C。
在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法中，所述的波長的主波長為340nm，副波長為430nm。 在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法中，所述的步驟三中的計算按以下公式進行計算 測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(A A/min)，
(△Aymin + AA2/min +...............AAt/min)△ A/min =-
t A A/min代表測試時間第lmin吸光度變化率
A A2/min代表測試時間第2min吸光度變化率 ............................................. A At/min代表測試時間第tmin吸光度變化率
t為測試時間 樣本腺苷脫氨酶活性=(A Ax/ A e) X Ec
其中AAX =樣本A A/min
AAC =標準品AA/min Ec =腺苷脫氨酶標準品的活性。 —種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成分組成包括試劑Rl、試劑R2、腺苷脫氨酶標準品、腺苷脫氨酶異常血清以及700測試/盒，所述的試劑Rl包括80mol/L的甘氨酸緩衝液、2mol/L的N_乙基_N_ (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲 基苯胺鈉鹽、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黃嘌呤氧化酶以及0. 6KU/L的過氧 化物酶，所述的試劑R2包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mo1/ L且pH值為4. 0的Tris-HCL緩衝液，所述的腺苷脫氨酶標準品為人源基因重組蛋白，腺苷 脫氨酶異常血清為人源基因重組蛋白和人血清。 在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒中，所述的試劑盒包 含試劑Rl為130ml，試劑R2為70ml，腺苷脫氨酶標準品2ml/1瓶，腺苷脫氨酶異常血清 lml/1瓶。 —種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒的用途，該測定用於判斷急性 肝損傷及殘留病變、協助診斷慢性肝病和肝纖維的診斷、黃疸的鑑別、結核性胸腹水診斷、 中樞神經系統疾病診斷和鑑別診斷以及傷寒引發的高熱診斷。 在上述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒的用途中，所依據的
原理反應方程式如下
腺苷脫氨酶
腺嘌呤核苷酸+水--^次黃嘌呤核苷+氨
嘌呤核苷磷酸化酶 次黃嘌呤核苷+磷酸鹽--^次黃嘌呤+核糖-1-磷酸
黃嘌呤氧化酶 次黃嘌呤+水+氧氣--^過氧化氫+尿酸
過氧化物酶
過氧化氫+4-氨基安替比林+N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽--^
醌化合物+水。 與現有技術相比，本發明的優點在於用腺苷脫氨酶脫氫酶法確定腺苷脫氨酶標準 品的活性，再應用Trinder氏法以腺苷脫氨酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中 腺苷脫氨酶活性，本發明解決了 Trinder氏法的缺陷，提高了測試精確度、減少了儀器誤差 和增強了腺苷脫氨酶正常參考範圍數據的可比性，也方便了通過測定腺苷脫氨酶的活性用 於判斷急性肝損傷及殘留病變、協助診斷慢性肝病和肝纖維的診斷、黃疸的鑑別、結核性胸 腹水診斷、中樞神經系統疾病診斷和鑑別診斷以及傷寒引發的高熱診斷等，適合在醫院中 進行推廣使用。
具體實施例方式
以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的描述，但本發明並 不限於這些實施例。 1、腺苷脫氨酶標準品和其活性的確定 (1)腺苷脫氨酶標準品活性0-150U/L人源基因重組腺苷脫氨酶
(2)腺苷脫氨酶標準品活性的確定
試劑組成 試劑RI :包括0. 015mol/L的a_酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/L的還原型輔酶I 二鈉 鹽、1. 50X10—3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸單鈉鹽以及O. 1Omol/L的且pH值為7. 20的磷酸 緩衝液； 試劑RII :為200U/ml的穀氨酸脫脫氫酶； 試劑RIII :包括1. 20X 10—2mol/L的腺苷，2. 00X 10—5mol/L的乙二胺四乙酸二鈉， 其中試劑RII和試劑RIII均用pH7. 20磷酸緩衝液配置。
試驗參數及操作步驟 樣本lOii L，試齊U I200ii L，試劑II20ii L，試劑I工I50ii L ; 樣本與試劑同時加入，第180S加入試劑11，第420S加入試劑III ; 反應溫度37 °C 空白時間開始第240秒，結束第360秒
反應時間開始第540秒，結束第660秒
波長主波長340nm副波長430nm
測試儀貝克曼CX7全自動生化分析儀 腺苷脫氨酶活性(U/L)定義為在腺苷脫氨酶脫氫酶法條件下37t:每分鐘產生一 個P mol氨所需腺苷脫氨酶的量，參照腺苷脫氨酶脫氫酶法，具體操作為將10 L的腺苷脫 氨酶樣本與200 ii L的試劑RI同時加入，並孵育180秒，然後加入20 ii L的試劑RII，再孵 育420秒加入50 L的試劑RIII，在340nm處定量測定吸光度，並用不同濃度氨代替底物腺 苷，按上述方法在340nm處用測試儀定量測定吸光度，以此畫出標準曲線，有腺苷脫氨酶標 準品的吸光度從標準曲線上求出對應的氨濃度，並將其除以反應時間既得出腺苷脫氨酶標 準品活性(U/L)。 —種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒，試劑盒由以下成分組成包 括試劑R1130ml、試劑R270ml、腺苷脫氨酶標準品2ml/l瓶、腺苷脫氨酶異常血清lml/1瓶 以及700測試/盒， 試劑RI :包括80mol/L的甘氨酸緩衝液、2mol/L的N_乙基_N_(2-羥基_3_磺丙 基)-3-甲基苯胺鈉鹽、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黃嘌呤氧化酶以及0. 6KU/ L的過氧化物酶； 試劑R2 :包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mol/L且
pH值為4. 0的Tris-HCL緩衝液; 腺苷脫氨酶標準品人源基因重組蛋白； 腺苷脫氨酶異常血清人源基因重組蛋白和人血清。
試劑配置 腺苷脫氨酶試劑為液體試劑，可直接上機使用。 腺苷脫氨酶標準品和腺苷脫氨酶質控血清是凍幹品，需要用一定蒸餾水溶解方可 使用。 試劑的穩定與貯存期 試劑30。C下可避光保存一周，室溫18 19。C下一月，2 8。C一年，嚴禁冷凍。溶化後的腺苷脫氨酶質控血清3(TC下可至少保存二周，2 試驗參數與操作步驟
『C或冷凍保存期更長。
溫度波長
比色杯光徑測試方法反應方向予孵育予孵育時間啟動反應樣品/試劑延遲時間測試時間空白參照總反應時間測試儀
37 °C546nm1. 0cm
速率法正
0. 05ml樣品+1. 8mlRl (或依比例混勻)5分鐘
加0.9ml R2(或依比例混勻)1 : 54
7分鐘2分鐘水
9分鐘
HITACHI 7100全自動生化分析儀2、樣本腺苷脫氨酶活性的測定
參照Trinder氏法用腺苷脫氨酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的腺苷脫氨酶活性，應用腺苷脫氨酶偶聯嘌呤核苷磷酸化酶，黃嘌呤氧化酶和過氧化物酶反應連續檢測法，腺苷脫氨酶酶解腺苷脫氨產生次黃苷；再通過偶聯嘌呤核苷磷酸化酶的作用，生成次黃嘌呤；後者在黃嘌呤氧化酶氧化下生成尿酸和過氧化氫，最後在過氧化物酶的作用下過氧化氫再與N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽以及4-氨基安替比林(4-AA)反應，生成紫紅色的有色醌化合物，並通過動態測量有色醌546nm處吸光度上升的速度來測算腺苷脫氨酶的活性，一個單位腺苷脫氨酶活性(U/L)定義為在條件37t:下每分鐘將1 y mol腺嘌呤核苷酸酶解成為次黃嘌呤核苷，所依據的原理是
formula see original document page 8
(2. 3)計算 測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(A A/min)，
formula see original document page 9 A A/min代表測試時間第lmin吸光度變化率 A A2/min代表測試時間第2min吸光度變化率 ............................................. A At/min代表測試時間第tmin吸光度變化率 t為測試時間 樣本腺苷脫氨酶活性=(A Ax/ A Ac) X Ec 其中AAX =樣本A A/min △ Ac =標準品A A/min Ec =腺苷脫氨酶標準品的活性 注意事項 1.試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。 2.若樣品腺苷脫氨酶> 150U/L，須用生理鹽水稀釋樣品，結果乘以稀釋倍數。 3.如保存不當，試劑發現有渾濁時，應棄用。 試劑性能 線性範圍:0 150U/L， (r2 > 0. 995) 精密度批內CV《6. 0% ;批間CV《10. 0% ;特異性血清、30mg/d膽紅素、200mg/dl血紅蛋白、500mg/dl甘油三酯和4mg/dl
抗壞血酸對本法無幹擾。 參考值 正常人血清腺苷脫氨酶活性參考值範圍在0 15U/L，根據自身實驗條件自行訂定正常人血清腺苷脫氨酶活性範圍。 依據上面的原理，一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒的用途是對腺苷脫氨酶活性的測定，腺苷脫氨酶將腺苷脫氨產生次黃苷和氨，腺苷脫氨酶廣泛存在人體各組織中，尤以小腸、肝、脾最多，血液細胞內酶活性為血清中的40 70陪，故測定時應避免溶血。血清腺苷脫氨酶的正常參考值為0 15U/L。腺苷脫氨酶異常增高見於
1、肝臟病-腺苷脫氨酶活性是反映肝損傷的敏感指標，可作為肝功能常規檢查項目之一與ALT或GGT等組成肝酶譜能較全面地反映肝臟病的酶學改變。血清中腺苷脫氨酶活性的測定可 1. 1用於判斷急性肝損傷及殘留病變急性黃疸性肝炎，幹細胞出現損傷，在黃疸
尚未出現前，可見增高。因腺苷脫氨酶分子量較ALT小，當肝細胞輕度受損時腺苷脫氨酶比
ALT先釋入血內。腺苷脫氨酶在反應急性肝病的殘存病變時優於ALT。 1. 2協助診斷慢性肝病和有助於肝纖維的診斷慢性肝炎活動期，慢性遷延性肝
炎和肝硬化腺苷脫氨酶身高明顯。腺苷脫氨酶在反應慢性肝損傷時優於ALT.慢性肝病，尤
其是肝硬變時腺苷脫氨酶陽性率高達90%，其酶活性以肝硬變>慢性肝炎，並隨肝纖維化程度增加而遞增，失代償期肝硬變腺苷脫氨酶活性明顯高於代償期肝硬變。
1. 3有助於黃疸的鑑別溶血性黃疸，肝細胞性黃疸腺苷脫氨酶升高。但阻塞性黃
疸時腺苷脫氨酶升高不明顯，因此在判斷黃疸性質時有一定的鑑別價值。
2、結核性胸腹水_結核性胸水中腺苷脫氨酶活性明顯高於其他原因引起的胸水，
因此可測定胸水中的腺苷脫氨酶來進行鑑別診斷。 3、傷寒_由傷寒引發高熱血清腺苷脫氨酶活性顯著升高。而高燒有及他原因造成腺苷脫氨酶卻不增高。 4、腦膜炎-腦脊液腺苷脫氨酶檢測可作為中樞神經系統疾病診斷和鑑別診斷的
重要指標，結核性腦膜炎腺苷脫氨酶活性顯著增高，病毒性腦炎不增高。 本發明的優點在於用腺苷脫氨酶脫氫酶法確定腺苷脫氨酶標準品的活性，再應用
Trinder氏法以腺苷脫氨酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中腺苷脫氨酶活性，本
發明解決了 Trinder氏法的缺陷，提高了測試精確度、減少了儀器誤差和增強了腺苷脫氨
酶正常參考範圍數據的可比性，也方便了通過測定腺苷脫氨酶的活性用於判斷急性肝損傷
及殘留病變、協助診斷慢性肝病和肝纖維的診斷、黃疸的鑑別、結核性胸腹水診斷、中樞神
經系統疾病診斷和鑑別診斷以及傷寒引發的高熱診斷等，適合在醫院中進行推廣使用。 本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領
域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替
代，但並不會偏離本發明的精神所定義的範圍。
權利要求
一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是包括以下步驟步驟一是確定腺苷脫氨酶標準品的活性；步驟二是再通過腺苷脫氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黃嘌呤氧化酶及過氧化物酶酶解生成醌化合物；步驟三是以連續監測醌化合物在546nm處吸光度的上升速率結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中腺苷脫氨酶的活性。
2. 根據權利要求1所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是所述的步 驟一中具體操作為將腺苷脫氨酶樣本與試劑RI同時加入，並孵育180秒，然後加入試劑 RI I ，再孵育420秒加入試劑RI 11 ，在340nm處定量測定吸光度，並用不同濃度氨代替底物腺 苷，按上述方法在340nm處用測試儀定量測定吸光度，以此畫出標準曲線，有腺苷脫氨酶標 準品的吸光度從標準曲線上求出對應的氨濃度，並將其除以反應時間既得出腺苷脫氨酶標 準品活性。
3. 根據權利要求2所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是所述 的試劑RI包括O. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X10—3mol/L的還原型輔酶I 二鈉鹽、 1. 50X 10—3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸單鈉鹽以及0. 1Omol/L的且pH值為7. 20的磷酸緩衝 液，所述的試劑RII為200U/ml的穀氨酸脫脫氫酶，所述的試劑RIII包括1. 20X 10—2mol/ L的腺苷，2. 00X10—5mol/L的乙二胺四乙酸二鈉，其中所述的試劑RII和試劑RIII均用 pH7. 20磷酸緩衝液配置。
4. 根據權利要求3所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是所述的腺 苷脫氨酶樣本為10 y L，試劑I為200 ii L，試劑II為20 ii L，試劑III為50 ii L，腺苷脫氨酶 樣本與試劑I同時加入，在第180秒加入試劑II，在第420秒加入試劑III，且溫度反應溫 度控制37°C。
5. 根據權利要求4所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是所述的波 長的主波長為340nm，副波長為430nm。
6. 根據權利要求5所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特徵是所述的步 驟三中的計算按以下公式進行計算測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(AA/min)，formula see original document page 2AA乂min代表測試時間第lmin吸光度變化率 AA2/min代表測試時間第2min吸光度變化率AAt/min代表測試時間第tmin吸光度變化率 t為測試時間樣本腺苷脫氨酶活性=(△ Ax/ A Ae) X Ec其中AAX =樣本AA/minA Ac =標準品A A/minEc =腺苷脫氨酶標準品的活性。
7. —種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒，其特徵是所述的試劑盒由以下成分組成包括試劑Rl、試劑R2、腺苷脫氨酶標準品、腺苷脫氨酶異常血清以及700測試 /盒，所述的試劑Rl包括80mol/L的甘氨酸緩衝液、2mol/L的N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙 基)-3-甲基苯胺鈉鹽、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黃嘌呤氧化酶以及0. 6KU/ L的過氧化物酶，所述的試劑R2包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以 及50mol/L且pH值為4. 0的Tris-HCL緩衝液，所述的腺苷脫氨酶標準品為人源基因重組 蛋白，腺苷脫氨酶異常血清為人源基因重組蛋白和人血清。
8. 根據權利要求7所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒，其特徵 是所述的試劑盒包含試劑R1為130ml，試劑R2為70ml，腺苷脫氨酶標準品2ml/1瓶，腺苷 脫氨酶異常血清lml/1瓶。
9. 一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒的用途，其特徵是該測定用於 判斷急性肝損傷及殘留病變、協助診斷慢性肝病和肝纖維的診斷、黃疸的鑑別、結核性胸腹 水診斷、中樞神經系統疾病診斷和鑑別診斷以及傷寒引發的高熱診斷。
10. 根據權利要求7所述的一種定標測定腺苷脫氨酶活性的方法配用的試劑盒的用途，其特徵是所依據的原理反應方程式如下腺苷脫氨酶腺嘌呤核苷酸+水--^次黃嘌呤核苷+氨嘌呤核苷磷酸化酶次黃嘌呤核苷+磷酸鹽--^次黃嘌呤+核糖-1-磷酸黃嘌呤氧化酶 次黃嘌呤+水+氧氣--^過氧化氫+尿酸過氧化物酶過氧化氫+4-氨基安替比林+N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽--^醌化合物+水。
全文摘要
本發明提供了一種定標測定腺苷脫氨酶的方法、配用的試劑盒和其用途，本發明用腺苷脫氨酶脫脫氫酶法檢測試劑盒確定腺苷脫氨酶標準品的活性，再應用Trinder氏法以標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中腺苷脫氨酶的活性。本發明優點在於解決了Trinder氏法的缺陷，提高了精確度，減少了儀器誤差以及增強了腺苷脫氨酶正常參考範圍數據的可比性且通過測定腺苷脫氨酶的活性用於判斷急性肝損傷及殘留病變、協助診斷慢性肝病和肝纖維的診斷、黃疸的鑑別、結核性胸腹水診斷、中樞神經系統疾病診斷和鑑別診斷以及傷寒引發的高熱診斷等，適合在醫院中進行推廣使用。
文檔編號G01N21/31GK101709324SQ200910155640
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者張聞 申請人:張聞