一種荷葉離褶傘原生質體製備及再生方法
2023-05-10 14:59:11 1
一種荷葉離褶傘原生質體製備及再生方法
【專利摘要】本發明涉及一種荷葉離褶傘原生質體的製備及再生的方法。該製備方法如下：將菌齡72-96h的荷葉離褶傘菌絲用0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑處理後、用含有質量濃度1%溶壁酶與0.5%蝸牛酶的混合酶液於30℃酶解2.5-3h，然後自製針管過濾器分離，得到荷葉離褶傘原生質體，原生質體得率為4.79×107個/mL即5.76×105個/mg，原生質體再生率為7.81%。本發明溶壁酶和蝸牛酶的混和酶，較單一溶壁酶作用，提高了原生質體製備及再生率，而且降低了成本；本發明採用小針管小面積過濾的方法，較常規方法降低了成本，為利用原生質體技術進行荷葉離褶傘育種奠定基礎。
【專利說明】一種荷葉離褶傘原生質體製備及再生方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物工程領域，涉及荷葉離褶傘原生質體的製備及再生方法。
【背景技術】
[0002] 荷葉離裙傘ofecasies)屬於擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、離裙傘屬食 用真菌，其菌絲及子實體蛋白質含量高，胺基酸種類齊全，還含有多種維生素，屬野生優良 食用菌。食用菌的原生質體全能性較易體現，所以原生質體誘變、融合育種技術是目前食用 菌高產菌株及新菌株選育手段中最為高效經濟的方法之一。而原生質體的成功製備是原生 質體誘變、融合育種技術的必要條件。目前國內尚未進行對荷葉離褶傘原生質體製備工藝 及方法的研究，因此，採用一種高效經濟的方法製備荷葉離褶傘的原生質體具有重要意義。
【發明內容】
[0003] 為解決以上技術中的不足，本發明的目的在於提供一種荷葉離褶傘原生質體的制 備及再生的方法。
[0004] 本發明的目的通過以下技術方案來實現： 一種荷葉離褶傘原生質體的製備及再生的方法，其特徵是： (1) 供試菌種 荷葉離褶傘菌種由河西學院食用菌研究所提供，菌種保藏在"中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心"，菌種保藏號CGMCC N01518,菌株號ZY48-1，專利號 ZL200510096405. 0 ； (2) 溶壁酶和蝸牛酶混合酶液配置 用0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶和蝸牛酶，使溶壁酶質量濃度為1. 6-2. 4%、 蝸牛酶質量濃度為〇. 8-1. 2%，將1. 6-2. 4%溶壁酶和0. 8-1. 2%蝸牛酶按質量份數1 :1混合， 使混和酶中溶壁酶濃度為〇. 8%-1. 2%，蝸牛酶濃度為0. 4%-0. 6%，置於8000-10000r/min離 心10-15min，取上清用0. 22// m的微孔濾膜過濾，備用； (3) 荷葉離褶傘液體菌種培養 將荷葉離褶傘菌種接種於PDA固體平板培養基上，置於25°C恆溫培養箱內，連續培養 5天使菌種活化，得到供試菌落，用直徑0. 5cm的無菌打孔器取活化後的菌落三塊，接種於 80mL-100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基三角瓶（250mL)中，在22-25°C、120-150r/min及黑 暗條件下連續培養72h-96h，得到活化液體菌種，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有 80-100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基三角瓶（250mL)中，22-25°C、120-150r/min及黑暗條件 下培養72h-96h。
[0005] (4)荷葉離褶傘原生質體的製備 取2層擦鏡紙襯於直徑10cm漏鬥，置於121°C高壓滅菌30min，將（3)步驟所得荷葉離 褶傘液體菌種倒入上滅菌漏鬥過濾，用無菌水衝洗5遍，用0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑洗 漆2遍收集菌絲體，取30mg?80mg菌絲，加入（2)步驟所得0· 12mL?0· 32mL的溶壁酶 和蝸牛酶混合酶液，置於30°C黑暗酶解2. 5-3h，每30min-40min震蕩一次，得到原生質體酶 解液；準備lmL規格的玻璃針管，在針管中預置脫脂棉，用針管的推進器壓緊，最終脫脂棉 高度0. 5-0. 8cm，置於121 °C高壓滅菌30min，得自製針管過濾器，用lmL移液槍將得到的原 生質體酶解液轉入自製針管過濾器，用推進器輕輕助推完全，再將〇. 8-lmLO. 6mol/L蔗糖 滲透壓穩定劑加入自製針管過濾器，用推進器助推完全；將濾液置於350〇r-4000r /min離 心10-15min，棄上清液，收集沉澱，即得荷葉離裙傘原生質體，用0. 5mL0. 6mol/L的鹿糖滲 透壓穩定劑洗漆下層懸浮液2-3次，再用0. 24mL?0. 64mL的0. 6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑 重懸原生質體，得到荷葉離褶傘原生質體精製懸液； (5)原生質體再生 在無菌條件下，採用無菌操作，用濃度梯度稀釋法將（4 )步驟所得荷葉離褶傘原生質體 稀釋至104個/mL，取該懸液80-100//L，塗布原生質體再生培養基上，原生質體再生培養基 為：馬鈴薯200g，麩皮30g，磷酸二氫鉀lg，蛋白腖3g，蔗糖20g，0. 6m〇L/L蔗糖滲穩劑，瓊脂 20g，水1000mL，pH值自然；25°C恆溫黑暗培養10-15天統計原生質體再生率。
[0006] 本發明的優點和產生的積極效果： 採用質量濃度為1%溶壁酶和〇. 5%蝸牛酶的混和酶有助於發揮酶的互補作用，降低了 用量（250mg/mL)，較單一溶壁酶作用，提高了原生質體製備及再生率，而且降低了成本，為 利用原生質體技術進行荷葉離褶傘育種奠定基礎。
[0007] 常規原生質體過濾方法常採用多層鏡頭紙過濾，因為接觸面積較大，使大量原生 質體粘在過濾擦鏡紙上，使原生質體損耗較大，與常規原生質體過濾方法相比，本發明的針 管過濾器，面積小(直徑=0. 5cm)，可以通過針管推進器的推壓使原生質體在很小的面積過 濾下來，大大減少原生質體損耗，從而提高了製備率，這樣我們只需酶解較少的菌絲（30mg) 就能獲得大量原生質體，酶消耗少（1. 8mg)，大大降低了科研中荷葉離褶傘原生質體的製備 費用。原生質體釋放量達到4. 79 X 107個/mL即5. 76 X 105個/mg，原生質體再生率為7. 81%， 處於較高水平。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008] 圖1為原生質體針管過濾器照片。
[0009] 圖2為菌齡對原生質體製備及再生的影響。
[0010] 圖3為酶解時間對原生質體製備及再生的影響。
[0011] 圖4為滲穩劑對原生質體製備及再生的影響。
[0012] 圖5為荷葉離褶傘原生質體（400X)圖。 圖6為荷葉離褶傘原生質體（1000X)圖。
【具體實施方式】
[0013] 本發明的菌種 荷葉離褶傘菌種（保藏號CGMCC1518,菌株號ZY48-1，專利號ZL200510096405. 0)由河 西學院食用菌研究所提供。
[0014] 本發明的試劑 溶壁酶(廣東省微生物研究所）；蝸牛酶(北京百泰生化技術公司）；纖維素酶（美國 bettery公司）；其他試劑均為國產分析純。
[0015] 酶液的配置 用0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶和蝸牛酶，使溶壁酶質量濃度為2%、蝸牛酶 質量濃度為1%，將2%溶壁酶和1%蝸牛酶按體積比1 :1混合，使混和酶中溶壁酶濃度為1%， 蝸牛酶濃度為〇. 5%，置於10000r/min離心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔濾膜過濾，備 用； 用lmL 0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶蝸牛酶，使蝸牛酶終濃度為1%、置於 10000r/min離心lOmin，取上清用0. 22//m的微孔濾膜過濾，備用。
[0016] 用lmL 0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶，使溶壁酶質量濃度為1%、置於 10000r/min離心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔濾膜過濾，備用； 用lmL 0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶和蝸牛酶，使混合酶中溶壁酶終濃度 為1%、蝸牛酶終濃度為1%，置於10000r/min離心lOmin，取上清用0. 22//m的微孔濾膜過 濾，備用。
[0017] 用lmL 0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶和蝸牛酶，使混和酶中溶壁酶終 濃度為2%、蝸牛酶終濃度為1%，置於10000r/min離心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔濾膜 過濾，備用。
[0018] 荷葉離褶傘菌絲原生質體製備方法 將荷葉離褶傘菌種接種於PDA固體平板培養基上，置於25°C恆溫培養箱內，連續黑暗 培養5天使菌種活化，得到供試菌落，用直徑0. 5cm的無菌打孔器取活化後的菌落3塊， 將3塊菌落均接種於80mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基於250mL三角瓶中，置於25°C、120r/ min及黑暗條件下連續培養72h，得到活化液體菌種；取上述所得活化菌液4mL加入到80mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養基於250mL三角瓶，置於25°C、120 r/min及黑暗條件下，連續培養 48h-168h得到荷葉離褶傘液體菌種，無菌條件下，用滅菌2層擦鏡紙過濾得到的荷葉離褶 傘液體菌種，用無菌水衝洗5遍，用滲透壓穩定劑洗滌2遍收集菌絲體。
[0019] 在無菌條件下，取30mg菌絲，加入上述所得0. 12mL的酶液，置於30°C及黑暗條件 下酶解0. 5-3h，每30min震蕩一次，得到原生質體酶解液；用lmL移液槍將得到的原生質體 酶解液轉入自製針管過濾器，用推進器輕輕助推完全，再將lmL滲透壓穩定劑加入自製針 管過濾器，用推進器助推完全；將濾液置於3500r/min離心lOmin，棄上清液，收集沉澱，即 得荷葉離褶傘原生質體。用〇. 5mL0. 6mol/L滲透壓穩定劑洗滌下層懸浮液2次，再用2倍 酶解液體積的滲透壓穩定劑重懸原生質體，得到荷葉離褶傘原生質體精製懸液。（整個過程 在無菌條件下進行。）原生質體適當稀釋後用血球計數板計數。原生質體得率（n/mg) =原生 質體個數（η) /菌絲質量（mg) 上述步驟中自製針管過濾器見圖1，做法為：準備lmL規格的玻璃針管，先在針管中放 入0. 5cm厚脫脂棉，用針管的推進器壓緊，滅菌備用。
[0020] 荷葉離褶傘菌絲原生質體再生方法 在無菌條件下，採用無菌操作，用濃度梯度稀釋法將荷葉離褶傘原生質體稀釋至1〇4個 /mL，取該懸液100//L，塗布原生質體再生培養基上。原生質體再生培養基：馬鈴薯200g， 麩皮30g，磷酸二氫鉀lg，蛋白腖3g，鹿糖20g，0. 6moL/L的滲透壓穩定劑，瓊脂20g，水 lOOOmL，pH值自然。25°C恆溫恆溼黑暗培養10天統計原生質體再生率。
[0021] 原生質體再生率（％)=原生質體再生個數（η) /塗板原生質體個數（η) X 100% 荷葉離褶傘菌絲原生質體製備及再生條件優化 原生質體製備及再生中滲透壓穩定劑的篩選 0.6 mol/L的MgS04、NaCl、蔗糖和甘露醇做為滲透壓穩滲劑，用60h菌齡的荷葉離褶傘 菌絲體，用1%溶壁酶+0. 5%蝸牛酶的混合酶液，置於30°C黑暗條件下酶解2h，製備原生質 體並再生，統計原生質體製備率、再生率。
[0022] 實驗結果表明（圖2)，添加硫酸鎂的培養基不凝固，以蔗糖作為滲穩劑時，原生 質的製備率最高，NaCl作滲透壓穩定劑原生質製備率最低。在其它條件等同的情況下， 0. 6mol/L的蔗糖和甘露醇做滲透壓穩定劑的再生率都較高，NaCl做滲透壓穩定劑的再生 率最低，比較各滲透壓穩定劑的製備率和再生率乘積發現選用〇. 6mol/L的庶糖時，_者乘 積最大。故荷葉離裙傘原生質體製備與再生的最適滲透壓穩定劑為〇.6mol/L鹿糖。
[0023] 原生質體製備及再生中酶解時間的篩選 酶解時間分別為〇. 5h、lh、l. 5h、2h、2. 5h、3h，用60h菌齡的菌絲體，用0. 6mol/L蔗糖為 滲透壓穩定劑，用1%溶壁酶+0. 5%蝸牛酶混合酶液，置於30°C黑暗酶解，製備原生質體並再 生，統計原生質體製備率、再生率。
[0024] 實驗結果表明（圖3)，原生質體製備率在一定的酶解時間範圍內，隨時間延長產量 顯著提高，當達到2. 5h時，酶解產量較高，之後增加不明顯，3. Oh時達到最大，之後隨著時 間延長，原生質體製備率呈下降趨勢。原生質體再生率2. 5h時達最大，之後隨著時間延長， 原生質體再生率呈下降趨勢。比較不同酶解時間的原生質體製備率和再生率的乘積，也發 現酶解時間為2. 5h時，二者乘積最大。故荷葉離褶傘原生質體製備與再生的最適酶解時間 為 2. 5h。
[0025] 原生質體製備及再生中荷葉離褶傘菌絲菌齡的篩選 菌齡選用48h、72h、96h、120h、144h、168h的菌絲體，0. 6mol/L蔗糖作為滲透壓穩定劑， 1%溶壁酶+0. 5%蝸牛酶混合酶液，在溫度30°C條件下黑暗酶解2. 5h，製備原生質體並再生， 統計原生質體製備率、再生率。
[0026] 由圖4可見，96h菌齡的原生質體製備率最高，其次是72h>120h >48h>144h>168h， 原生質體再生率在72h菌齡最高，其次是48h >96h >120h>144h >168h。以二者的乘積作為 參考指標，比較各菌齡的原生質體製備率和再生率乘積發現菌齡為72h時，二者乘積最大。 因而，選擇72h為荷葉離褶傘原生質體製備及再生的最佳菌齡。
[0027] 原生質體製備中酶及酶濃度的篩選 酶液分別採用1%蝸牛酶、1%溶壁酶、1%溶壁酶+〇. 5%蝸牛酶、1%溶壁酶+1%蝸牛酶和 2%溶壁酶+1%蝸牛酶混合酶液，0. 6mol/L蔗糖作為滲透壓穩定劑，用菌齡72h的菌絲體，在 溫度30°C及黑暗條件下酶解2. 5h，製備原生質體，統計原生質體製備率。
【權利要求】
1. 一種荷葉離褶傘原生質體的製備及再生的方法，其特徵是： (1) 供試菌種 荷葉離褶傘菌種由河西學院食用菌研究所提供，菌種保藏在"中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心"，菌種保藏號CGMCC N01518,菌株號ZY48-1，專利號 ZL200510096405. 0 ； (2) 溶壁酶和蝸牛酶混合酶液配置 用0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑溶解溶壁酶和蝸牛酶，使溶壁酶質量濃度為1. 6-2. 4%、 蝸牛酶質量濃度為〇. 8-1. 2%，將1. 6-2. 4%溶壁酶和0. 8-1. 2%蝸牛酶按質量份數1 :1混合， 使混和酶中溶壁酶濃度為〇. 8%-1. 2%，蝸牛酶濃度為0. 4%-0. 6%，置於8000-10000r/min離 心10-15min，取上清用0. 22// m的微孔濾膜過濾，備用； (3) 荷葉離褶傘液體菌種培養 將荷葉離褶傘菌種接種於PDA固體平板培養基上，置於25°C恆溫培養箱內，連續培養 5天使菌種活化，得到供試菌落，用直徑0. 5cm的無菌打孔器取活化後的菌落三塊，接種於 80mL-100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基三角瓶（250mL)中，在22-25°C、120-150r/min及黑 暗條件下連續培養72h-96h，得到活化液體菌種，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有 80-100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基三角瓶（250mL)中，22-25°C、120-150r/min及黑暗條件 下培養72h-96h ; (4) 荷葉離褶傘原生質體的製備 取2層擦鏡紙襯於直徑10cm漏鬥，置於121°C高壓滅菌30min，將（3)步驟所得荷葉離 褶傘液體菌種倒入上滅菌漏鬥過濾，用無菌水衝洗5遍，用0. 6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑洗 漆2遍收集菌絲體，取30mg?80mg菌絲，加入（2)步驟所得0· 12mL?0· 32mL的溶壁酶 和蝸牛酶混合酶液，置於30°C黑暗酶解2. 5-3h，每30min-40min震蕩一次，得到原生質體酶 解液；準備lmL規格的玻璃針管，在針管中預置脫脂棉，用針管的推進器壓緊，最終脫脂棉 高度0. 5-0. 8cm，置於121 °C高壓滅菌30min，得自製針管過濾器，用lmL移液槍將得到的原 生質體酶解液轉入自製針管過濾器，用推進器輕輕助推完全，再將〇. 8-lmLO. 6mol/L蔗糖 滲透壓穩定劑加入自製針管過濾器，用推進器助推完全；將濾液置於350〇r-4000r /min離 心10-15min，棄上清液，收集沉澱，即得荷葉離裙傘原生質體，用0. 5mL0. 6mol/L的鹿糖滲 透壓穩定劑洗漆下層懸浮液2-3次，再用0. 24mL?0. 64mL的0. 6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑 重懸原生質體，得到荷葉離褶傘原生質體精製懸液； (5) 原生質體再生 在無菌條件下，採用無菌操作，用濃度梯度稀釋法將（4)步驟所得荷葉離褶傘原生質體 稀釋至104個/mL，取該懸液80-100//L，塗布原生質體再生培養基上，原生質體再生培養基 為：馬鈴薯200g，麩皮30g，磷酸二氫鉀lg，蛋白腖3g，蔗糖20g，0. 6m〇L/L蔗糖滲穩劑，瓊脂 20g，水lOOOmL，pH值自然；25°C恆溫黑暗培養10-15天統計原生質體再生率。
【文檔編號】C12N5/04GK104087548SQ201310110684
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年4月1日 優先權日:2013年4月1日
【發明者】梁倩倩, 席亞麗, 魏生龍 申請人:梁倩倩