二倍體胚的選擇性切除的製作方法

2023-05-10 15:04:51

專利名稱：:二倍體胚的選擇性切除的製作方法二倍體胚的選擇性切除發明本發明涉及植物育種和植物生物
技術領域：
：。發明背景純合植物對於植物的產品開發和商業化是基礎的。為了獲得純合植物，需要幾代自花傳粉和分離分析。這是勞動力和時間的無效使用。因此開發一種方法是有用的，以減少獲得純合植物通常所需的人工授粉步驟，且減少獲得植物的純合群體所需的時間量。無需多代自花傳粉而獲得純合植物的一種方法是產生單倍體，且然後使染色體加倍以形成雙單倍體(doubledhaploid)。幫助選擇單倍體胚且消除二倍體胚的方法將增加雙單倍體產生的效率。發明概述提供了通過阻止二倍體胚的生長用於鑑定單倍體的方法。提供了用於鑑定單倍體植物、種子、胚和植物細胞的方法。提供了用於產生單倍體誘導系(inducerline)的方法和單倍體諸導系。發明詳述單倍體植物具有單組(基因組)染色體，並且單倍體植物中減少的染色體數目(n)等於配子中的那種。二倍體植物具有2組(基因組)染色體，並且染色體數目(2n)等於合子中的那種。單倍體細胞是具有單個基因組的細胞，雄性或雌性。雙單倍體或雙單倍體植物或細胞是通過單倍體染色體組加倍發展的那種。得自自交任何代數的雙單倍體植物的植物或種子仍可以鑑定為雙單倍體植物。雙單倍體植物視為純合植物。如果植物是能育的，那麼它視為雙單倍體的，即使植物的整個營養部分並非由具有雙染色體組的細胞組成。例如，如果植物包含有生活力的配子，那麼它將一見為雙單倍體植物，即使它是嵌合的。"單倍體胚"定義為在來自花粉粒的一個精核與胚嚢中的極核融合以產生三倍體(3N)胚乳後形成的胚，並且胚無需雄性基因組的貢獻而形成。"未成熟的單倍體胚"定義為在來自花粉粒的一個精核與胚嚢中的極核融合以產生三倍體(3N)胚乳後以及幹透(drydown)前形成的胚。並且胚無需雄性基因組的貢獻而形成。"雙單倍體胚"是具有包含2組純合染色體的一個或多個細胞的胚。"愈傷組織"指去分化的增殖細胞或組織團塊。短語"接觸"、"與......接觸"或"置於與......接觸"可以用於意指"直接接觸"或"間接接觸"。例如，包含加倍試劑的介質可以與單倍體細胞直接接觸，或包含加倍試劑的介質可以通過濾紙、植物組織或其他細胞與單倍體細胞分開，因此加倍試劑通過濾紙或細胞轉移給單倍體細胞。術語"介質"包括以液態、氣態或固態的化合物。如本文所使用的，術語"植物"包括提及全植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子和植物細胞及其後代。如本文所使用的，"植物細胞"包括但不限於，種子、懸浮培養物、胚、分生組織區域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子。單倍體誘導系包含；1)花粉致死性多核苷酸或非傳播花粉多核苷酸，2)胚致死性多核苷酸，和3)胚致死性阻遏物。花粉致死性多核苷酸或非傳播花粉多核苦酸指阻止花粉完成受精的任何多核苷酸。花粉非傳播最有效，如果它在減數分裂後或配子體階段時發生的話。非傳播花粉多核苷酸可以通過各種機制發揮作用。它可以例如通過表達毒性化合物來阻止花粉有生活力。胚致死性多核苷酸是阻止胚的正確發育或促使胚不能生活的任何多核苷酸。胚致死性多核苷酸可以減緩胚的生長，從而使得人們可能將攜帶胚致死性多核苷酸的胚與不攜帶胚致死性多核苷酸的胚區分開。胚致死性阻遏物是當表達時，促使胚致死性多核苦酸無效且允許有生活力的胚發育的任何多核普酸。這可以通過各種機制來達到。例如胚致死性阻遏物可以使由胚致死性多核香酸表達的分子去毒。可以表達例如通過蛋白質-蛋白質相互作用抑制另一種蛋白質的致死性的胚阻遏物蛋白。胚阻遏物可以發揮作用的另一個途徑是制止或阻止胚致死性多核苷酸的表達，例如通過表達與致死性多核香酸的啟動子結合且阻斷一些或全部表達的分子。可以在系統中使用的另一個例子是基因沉默。例如，胚阻遏物可以是通過基因沉默阻止胚致死多核苷酸起作用的多核苷酸。胚致死性多核香酸和胚致死性阻遏物多核苷酸不限於僅在胚中表達。基因可以在其他組織中表達。如果胚致死性多核苦酸不在胚乳中表達，從而使得單倍體種子可以正常發育，那麼這更有效。關於該方法最佳發揮作用的另一個考慮是胚致死性多核苷酸表達應由胚致死性阻遏物多核苷酸的表達匹配。在多核苷酸一起遺傳的任何時候，胚致死性阻遏物多核苷酸都應以制止胚致死性多核苷酸的負面效應的水平表達。一般地，非傳播花粉多核苷酸和胚致死性阻遏物在發育的誘導系中連鎖。它們可以緊密連鎖。最方便的是非傳播花粉多核苷酸和胚致死性阻遏物應彼此鄰近，例如在相同構建體上。為了有效結果，非傳播花粉多核苷酸和胚致死性阻遏物將一起分離。再一般地，非傳播花粉多核普酸和致死性阻遏物連鎖，但在與胚致死性多核苷酸不同的位置處。為了有效結果，胚致死性多核普酸將與非傳播花粉多核苷酸和胚致死性阻遏物分離。為了最大效率，胚致死性多核苷酸不與非傳播花粉多核苷酸和胚致死性阻遏物連鎖。發育的誘導系可以包含或不包含選擇標記。它可以或可以不使用其為選擇標記的轉基因進行發育。下文描述了用於產生誘導系的一般組分。構建體A包含非傳播花粉多核苦酸和胚致死性阻遏物、以及選^^標記基因。構建體B包含選"^標記基因和胚致死性基因。為了促進在授粉後的分離，2種構建體可以位於基因組的2個不同位置處。為了進一步的效率，構建體A和構建體B應不連鎖。構建體A和B可以共轉化到誘導系內，或轉化過程可以順次完成，最方便的是構建體A首先和構建體B其次。起始To誘導植物將是對於2種構建體——A和B是雜合的。這種植物的自花傳粉的預期結果在表1中給出。將構建體引入誘導系內的另一個途徑是使它們雜交或育種到誘導系內。例如，構建體A和B可以共轉化到植物內，然後育種到誘導系內。為了系統在植物中是最有效的，胚致死阻遏物需要與胚致死多核苷酸一起呈現。因此，人們可以用包含胚致死阻遏物多核苷酸的構建體轉化，以獲得穩定轉化的細胞，且然後用包含胚致死多核苷酸的構建體轉化。表1。在2個分離基因座處共轉化的To植物的自花傳粉(基因型(A-B-)。To植物產生是可能的，因為胚致死和胚致死阻遏物在體細胞胚和胚發生愈傷組織中表達。包含構建體A的花粉是不能生活或無法傳播的。包含構建體B但無構建體A的胚是不能生活的，這是由於胚致死基因而無胚致死阻遏物基因的表達。A-BB基因型將具有2個劑量的胚致死基因和1個劑量的胚阻遏物基因。因此為了最大效率，單個阻遏物多核苷酸的表達應處於將阻止2個劑量的胚致死多核苷酸的致死性的水平。構建體厶=非傳播花粉+胚致死阻遏物+選擇標記基因"a"構建體B二胚致死+選擇標記"b"tableseeoriginaldocumentpage7因為將存在不含2個構建體的存活胚，所以不包含2個構建體的胚或來自不包含2個構建體的胚的植物可以通過使組織與選擇劑接觸而針對其進行選擇。如果選擇標記是視覺標記或一些其他類型的標記，那麼這也可以觀察到，並且可以針對不包含2種標記的組織進行選擇。可以使用任何類型的選擇標記。其餘植物將對於2種構建體是雜合的(A-B-),或對於構建體A是雜合的和對於構建體B是純合的(A-BB)。A-B-基因型自交的結果將導致如先前表1可見的後代。A-BB基因型自交的結果將產生僅對於構建體B純合的基因型。因此所有後代將具有選擇標記b。這是所需基因型A-BB。對於2種構建體雜合的植物將產生不包含選擇標記b的一些後代。由A-BB基因型自交所產生的後代在表2中描述。表2。具有A-BB基因型的T!植物的自花傳粉。來自自交A-BB植物的所有存活後代將是A-BB植物。tableseeoriginaldocumentpage8所需基因型A-BB產生唯一一種存活花粉基因型-B。當這種轉基因誘導系作為雄性與野生型雌性雜交時，這將導致所有二倍體胚的切除，表3。然而，母源單倍體胚不遺傳來自父本的胚致死並且因此是存活的。母源單倍體不包含來自構建體A或構建體B的轉基因。即使母源單倍體胚不遺傳來自父本的DNA，但攜帶胚致死基因的花粉將具有一個精核，所述精核與胚嚢中的極核融合，以產生三倍體(3N)胚乳。因此胚致死基因無法在胚乳或糊粉中表達；或如果它在這些細胞中表達，那麼它將不殺死單倍體胚。表3。具有基因型A-BB的單倍體誘導系與野生型雌性系…-的雜交。包含構建體A的花粉和包含構建體B的胚是不能生活的，這是由於胚致死而無胚致死阻遏物的表達。二倍體遺傳來自雄性的構建體B且是不能生活的。母源單倍體不遺傳構建體B且是存活的。正常發育的任何母源胚將是單倍體的。tableseeoriginaldocumentpage8無需任何選4奪標記也可以產生誘導系的發育。它還可以使用在任一構建體上的唯——種選擇標記或用在2種構建體上的相同選擇標記來產生。人們可以使用本領域技術人員已知的任何數目的技術來追蹤轉基因且就轉基因進行育種。例如後代測試、PCR、分子標記或ELISA可以用於追蹤轉基因。還可以使用技術的任何組合。例如，如果第一種構建體=花粉不傳播+胚致死阻遏物，和第二種構建體=胚致死性，那麼定量PCR可以用於測定何種後代包含何種構建體且以何種劑量，純合狀態或雜合狀態。本發明的另一種方法包括用在一種構建體上的花粉不傳播和胚致死阻遏物基因以及在第二種構建體上的選擇標記基因共轉化。在獲得轉化的組織後，第二次共轉化可以用胚致死和第二種選擇標記來進行。在轉基因植物發育後，選擇標記可以與其他轉基因分離開。可以利用以化學應用或接觸充當胚致死阻遏物的另一種方法。如果化學製品可以用於阻遏胚致死多核苷酸，那麼人們可能獲得僅具有構建體B的植物。例如，人們可以將構建體轉化到2種不同植物內，然後使2種構建體育種到誘導系內。阻遏胚致死性的化學製品將必須用於用構建體B轉化的植物，直至2種構建體都包含在相同植物中。人們隨後就包含2種分離構建體A和B的誘導系進行選擇。通過回交的性狀整合是本領域眾所周知的。單倍體誘導系統已開發用於各種植物，以產生單倍體組織、植物和種子。單倍體誘導系統通過使所選擇的系(作為雌性)與誘導系雜交可以由任何基因型產生單倍體植物。用於玉蜀黍的此種誘導系包括但不限於，Stock6和Stock6衍生物(Coe，1959,Am.Nat93:381-382;Sarkar和Coe，1966,Genetics54:453-464;Sarkar等人，1972,Developmentofmaternal-haploidy-inducerlinesinmaize(ZeamaysL.)IndianJ.Agric.Sci.42:781-786;Lashermes和Beckert,1988,Geneticcontrolofmaternalhaploidyinmaize(ZeamaysL.)andselectionofhaploidinducinglines.Theor.Appl.Genet.76:405-410;Chalyk,S.T.1994，Propertiesofmaternalhaploidmaizeplantsandpotentialapplicationtomaizebreeding.Euphytica79;13-18;Bordes,J.R.等人,1997,Haploidizationofmaize(ZeamaysL.)throughinducedgynogenesisassistedbyglossymarkersanditsuseinbreeding.Agronomie17:291-297;EderJ.和S.Chalyk,2002,Invivohaploidinductioninmaize.Theor.Appl.Genet104:703-708)RWS(Rober,Gordillo和Geiger,2005，Maydica50(2005)275-283)，KEMS(Deimling,Roeber和Geiger,1997，Vortr.Pflanzenzuchtg38:203-224),或KMS和ZMS(Chalyk,Bylich&Chebotar,1994,畫L68:47;Chalyk&Chebotar,2000,PlantBreeding119:363-364)，和不定配子體(ig)成熟(Kermicle1969Science166:1422-1424)。所述參考文獻的公開內容引入本文作為參考。遠緣雜交也可以用於產生單倍體。在大麥中，這種方法有時稱為bulbosum法(Kasha和Kao,1970,Nature225:874-876)。這種單倍體產生方法由於來自授粉親本的染色體的消除而發生。當誘導系用於給二倍體植物授粉時，獲得單倍體胚。來自花粉的一個精核與胚嚢中的極核融合，以產生三倍體(3N)胚乳。三倍體胚乳將包含來自雌性的2組染色體和來自雄性的l組染色體，所述雄性在這種情況下是誘導系。單倍體胚包含單組染色體，其衍生自雌性植物。在單倍體玉蜀黍的開發中，/^/是用於成熟種子的單倍體/二倍體篩選的常用等^f立基因(Nanda和Chase，1966.Anembryomarkerfordetectingmonoploidsofmaize(Zea顧"L).CropSci.6:213-215;Greenblatt和Bock,1967.Acommerciallydesirableprocedurefordetectionofmonoploidsinmaize.J.Hered.58:9-13)。R-nj表達水平已顯示與仁成熟參數相關(Alexander和Cross,1983,Grainfillcharacteristicsofearlymaize(Zeama_>AsL)strainsselectedforvariableR-njexpression,E叩hytica32:839-844.)。最近，也已使用h，2(KatoA.,2002,Chromosomedoublingofhaploidmaizeseedlingsusingnitrousoxidegasattheflowerprimordialstage.Plantbreeding121:370-377;和KatoA.,2003,Chromosomedoublingmethod,U.S.Publication2003/0005479)。用於在成熟種子階段時區分單倍體和二倍體的R-nj花青苷標記基因直至胚發育晚期才表達。為了鑑定在較早階段時的單倍體組織，單倍體胚可以使用轉基因標記lecl-GFP進行鑑定，其存在於誘導系中。lecl-GFP的使用是有價值的，因為該基因允許人們在胚發育早期時鑑定非單倍體胚(美國申請09/718,754,美國專利6,486,382)。GFP標記表達的不存在用於鑑定單倍體胚。儘管單倍體胚可以在早期階段時進行鑑定，但GFP系統需要勞動力密集的篩選方法，以確定何種胚表達GFP標記以及何種胚不表達GFP標記。致死標記在誘導系中的4吏用將4又允許單倍體胚形成且因此消除關於較不有效的篩選方法的需要。這種系統將增加雙單倍體方法的效率。各種類型的系統可以在誘導系中使用，以增加雙單倍體方法的效率1)毒性/解毒劑系統，2)轉錄調節物系統；3)基因沉默系統。可以利用的毒性/解毒劑系統的例子是芽孢桿菌RNA酶(Barnase)/芽孢桿菌RNA酶抑制劑(Barstar)系統。芽孢桿菌RNA酶是由解澱粉芽孢桿菌(Sa"〃wamy/o/,々we/a"e朋)產生的細胞外核糖核酸酶的名稱。芽孢桿菌RNA酶的抑制劑稱為芽孢桿菌RNA酶抑制劑，並且由分泌芽孢桿菌RNA酶的相同生物細胞內產生。芽孢桿菌RNA酶抑制劑的功能是保護解澱粉芽孢桿菌不受細胞內芽孢桿菌RNA酶的毒性作用，從而^f吏4尋它無活寸生(Hartley,R.W.(1989)Barnaseandbarstar:Twosmallproteinstofitandfoldtogether.TrendsBiochem.Sci.14:450-454)。這兩種基因已得到克隆且測序(Hartley,R.W.(1988)Barnaseandbarstar:Expressionofitsclonedinhibitorpermitsexpressionofaclonedribonuclease.J.Mol.Biol.202:913-915)。已顯示芽孢桿菌RNA酶表達對於植物細胞是致死的，並且芽孢桿菌RNA酶抑制劑可以保護植物細胞不受芽孢桿菌RNA酶的作用(Mariani等人，(1990)Inductionofmale-sterilityinplantsbyachimericribonucleasegene.Nature347:737-741;Mariani等人(1992)Achimericribomiclease-inhibitorgenerestoresfertilitytomalesterileplants.Nature357:384-387;Beals,T.P.和Goldberg,R.B.(1997)Anovelcellablationstrategyblockstobaccoantherdehiscence.PlantCell9:1527-1545;Williams等人,(1997)MalesterilitythroughrecombinantDNAtechnology.InPollenBiotechnologyforCropProductionandImprovement,K.R.Shivanna和V.K.Sawhney,編輯(Cambridge,UK:CambridgeUniversityPress)笫237-257頁)。轉基因通過花粉的傳遞可以通過使轉基因與花粉致死性基因連接得到阻止，所述花粉致死性基因由在花粉特異性(配子體)啟動子控制下的細胞毒性基因組成(Twell(1995)Diptheriatoxin-mediatedcellablationindevelopingpollen:vegetativecellablationblocksgenerativecellmigration.Protoplasma187:144-154;Williams等人，(1997)MalesterilitythroughrecombinantDNAtechnology.InPollenBiotechnologyforCropProductionandImprovement,K.R.Shivanna和V.K.Sawhney，編輯(Cambridge,UK:CambridgeUniversityPress)第237-257頁)。這種類型的構建體可以得到維持，因為它通過雌性傳遞。許多花粉特異性啟動子已得到鑑定。本發明的其他實施方案包括將制止花葯生存力的構建體和將阻止存活花粉傳播的任何構建體。芽孢桿菌RNA酶抑制劑抑制芽孢桿菌RNA酶蛋白質在單倍體誘導系中的功能(RNA酶)。二倍體胚被切除，因為芽孢桿菌RNA酶抑制劑PTU(植物轉錄單位)與花粉不傳播PTU連鎖，並且因此不存在於二倍體胚中以抑制芽孢桿菌RNA酶。芽孢桿菌RNA酶抑制劑系統可以通過使芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的編碼區最優化得到改善。人們還可以通過增加芽孢桿菌RNA酶抑制劑對於芽孢桿菌RNA酶的親和力來最優化該系統。改善該系統的其他方法包括使芽孢桿菌RNA酶抑制劑的表達增加超過芽孢桿菌RNA酶的表達水平，從而使得表達水平是例如芽孢桿菌RNA酶表達水平的約1.5X、2X、或至少3X。人們可以使芽孢桿菌RNA酶由胚優選啟動子例如lecl調節，並且可以^f吏芽孢桿菌RNA酶抑制劑由組成型啟動子例如Ubi調節。人們還可以添加內含子，例如Adh內含子，或添加增強子，例如35S增強子，以增加表達。在表達毒性產物的多核苷酸中可能需要內含子以用於阻止毒性產物在土壤桿菌屬(Agrobacterium)中的表達的目的。存在可以利用的轉錄調節系統的許多例子(Ramos等人"Thetetrfamilyoftranscriptionalrepressors"(2005)MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,第69巻(2):326-356)。調節物家族的一些例子在表4中指出。tableseeoriginaldocumentpage13可以用於在發育早期鑑定單倍體的充分研究的調節物系統是tet阻遏物系統。四環素操縱子系統包含阻遏物和操縱基因元件。操縱子系統受四環素的存在的控制，並且自我調節和^W基因的表達水平。^M的產物從細胞中去除四環素。^W的產物是這樣的阻遏蛋白，其在不存在四環素的情況下以約10pM的Kd與操縱基因元件結合，從而阻斷&M和化W的表達。TET阻遏物可以就玉蜀黍進行最優化，並且用於終止胚發育的啟動子可以用TET操縱基因序列進行修飾。可以用於在發育早期鑑定單倍體的系統的另一個例子利用lac阻遏物系統(Ulmasov等人(1997)PlantMolBiol35-417-424;Wilde等人(1992)EMBOJ11:1251-1259)。這種基於阻遏物/操縱基因的系統衍生自原核操縱子，大腸桿菌co//)乳糖操縱子。這種系統通過將操縱基因序列置於基因的轉錄起始位點附近來控制啟動子的活性，從而使得來自操縱子的基因表達在阻遏蛋白與其關聯操縱基因序列結合後得到抑制。然而，在誘導劑的存在，阻遏物與其操縱基因的結合得到抑制，從而激活啟動子且使得基因能夠表達。在lac系統中，異丙基-B-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)是常用的誘導劑，而四環素和/或多西環素(doxycyline)是用於tet系統的常用誘導劑。lac阻遏物已得到廣泛表徵。lac阻遏物具有關於其操縱基因的高結合常數，並且IPTG使阻遏物對於操縱基因的親和力減少300倍(8&&^丫&Bourgeois(1980)TheOpe跳Miller&Reznikoff,編輯，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY，第177-220頁)，使用乳糖阻遏物已報告了僅30倍的阻遏(Ulmasov等人(1997)PlantMolBiol35-417-424)。lac阻遏物可以是玉蜀黍最優化的，並且用於終止胚發育的啟動子可以用lac操縱基因序列進行修飾。基因沉默也可以在二倍體胚系統的選擇性切除中使用。胚致死性的阻遏可以在RNA或蛋白質階段時，例如反義RNA、髮夾和用於基因沉默的其他機制。例如，人們可以具有由強啟動子例如UBI驅動的芽孢桿菌RNA酶髮夾多核苷酸。這種包含髮夾的構建體可以與不允許花粉受精的構建體連接。另一種構建體可以包含由lecl啟動子驅動的芽孢桿菌RNA酶多核苷酸。這將有效關閉芽孢桿菌RNA酶直至髮夾基因座分離開。阻止胚的正常發育的任何多核苦酸連同相應的基因沉默構建體可以在該系統中^f吏用。在本發明中可以由花粉啟動子驅動且用於阻止能育花粉的基因的例子包括DAM(GenBankJO1600，NucleicAcidsRes.11:837誦851(1983);a-澱粉酶(GenBankL25805,PlantPhysiol.105(2):759-760(1994));D8(Physiol.Plant100(3):550-560(1997));SacB(PlantPhysiol.110(2):355-363(1996)),脂肪酶和核糖核酸酶；tasselseed2"s2)(Calderon-UrreaM.和S丄.Dellaporta(1999)Development126:435-441);白喉毒素A(DTA)(Greenfield等人Proc.Natl.Acad.Sci.80:6853(1983);Palmiter等人，Cell50:435(1987))。等人(1991)，PollenspecificcDNAclonesfromZeamays,Biochem.Biophys.Acta1089,411-413.;Allen,R丄.和Lonsdale，D.M(1992)Sequenceanalysisofthreemembersofthemaizepolygalacturonasegenefamilyexpressedduringpollendevelopment,PlantMol.Biol.20,343-345,Allen，R丄.和Lonsdale,D.M.(1993),Molecularcharacterizationofoneofthemaizepolygalacturonasegenefamilymemberswhichareexpressedduringlatepollendevelopment.ThePlantJournal3,261-271,美國專利5,412,085和美國專利5,545,546);玉蜀黍花粉特異性基因Zml3(Hamilton等人(1992)PlantMol.Biol.18:211-218;Guerrero等人(1993)Mol.Gen.Genet224:161-168);小孢子特異性啟動子例如apg基因啟動子(Twell等人，Sex.PlantReprod.6:217-224(1993));進一步包括向日葵花粉表達的基因SF3(Baltz等人(1992)ThePlanUournal2:713-721)，歐洲油菜(B.napus)花粉特異性基因(Arnoldo等人(1992)J.Cell.Biochem，AbstractNo.Y101204)。此種啟動子是本領域已知的或可以通過已知技術發現；參見例如，Bhalla和Singh(1999)MolecularcontrolofmalefertilityinBrassicaProc.10thAnnualRapeseedCongress,Canberra,Australia;vanTunen等人(1990)Pollen-specificchipromotersfrompetunia:tandempromoterregulationofthechiAgene,PlantCell2:393-40;Jeon等人(1999);和Twell等人(1993)ActivationanddevelopmentalregulationofanArabidopsisanther-specificpromoterinmicrosporesandpollenofNicotianatabacum，Sex.PlantReprod.6:217-224。花粉啟動子和可以與它們一起用於阻止存活花粉的多核苷酸的許多例子可以在美國專利6,743,968和美國公開2005/0246796(美國申請號11/014,071)中發現。其啟動子與早期種子和胚發育相關的穀類基因包括lecl(美國專利7,122,658)、稻穀蛋白("GluA-3,"Yoshihara和Takaiwa,1996,PlantCellPhysiol37:107-11;"GluB-l,"Takaiwa等人，1996,PlantMolBiol30:1207-21;Washida等人，1999,PlantMolBiol40:1-12;"Gt3,"Leisy等人，1990,PlantMolBiol14:41-50)、稻穀醇溶蛋白(/n9/amz力)(Zhou&Fan,1993，TransgenicRes2:141-6)、'J、麥谷醇溶蛋白(Hammond-Kosack等人，1993,EMBOJ12:545-54)、玉蜀黍玉米醇溶蛋白(Z4,Matzke等人，19卯，PlantMolBiol14:323-32)、和大麥B-hordeiis(Entwistle等人，1991，PlantMolBiol17:1217-31)。"種子優選的"啟動子包括"種子特異性"啟動子(在種子發育過程中有活性的那些啟動子，例如種子貯藏蛋白的啟動子)以及"種子萌發"啟動子(在種子萌發過程中有活性的那些啟動子)。參見Thompson等人(1989)說of^a，10:108。此種種子優選的啟動子包括但不限於，Ciml(細胞分裂素誘導的信使)、cZ19Bl(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)、milps(肌醇-l-磷酸合酶)；參見WO00/11177和美國專利號6,225,529。Y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。球蛋白-1(Glob-l)是代表性胚特異性啟動子。玉蜀黍Glbl基因編碼球蛋白-1,主要胚貯藏蛋白。(Kriz，A.L.,等人(1986)PlantPhysiol.82:1069-1075)Glbl在胚發育過程中在發育中的玉蜀黍種子中表達。(Belanger,F.C.,等人(1989)PlantPhysiol,91:636-643)Glbl的啟動子區已得到鑑定、克隆且通過土壤桿菌屬介導的轉化引入菸草植物內。(Liu，S.,等人(1996)PlantCellReports16:158-162)轉化植物證實Glbl啟動子具有所需時間和組織特異性。Glbl啟動子由脫落酸(ABA)正調節。(Kriz,A.L.,等人(1990)PlantPhysiol.92:538-542;Paiva,R.,等人,(1994)Planta192:332-339)植物激素ABA的水平已知在冷或脫水的條件下波動。(Himmelbach,A.,等人(1998)Phil.Trans.R.Soc.Lond.353:1439-1444)因此，Glbl啟動子的活性可以差別地受影響。來自雙子葉植物的種子特異性啟動子包括但不限於，豆p-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、P-伴大豆球蛋白(卩-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(crudferin)等。來kDa玉米醇溶蛋白；22kDa玉米醇溶蛋白；27kDa玉米醇溶蛋白(Boronat,A.，Martinez,M.C.,Reina,M.，Puigdomenech，P.和Paau，Jr.;Isolationandsequencingofa28kDglutelin-2genefrommaize:Commonelementsinthe5'flankingregionsamongzeinandglutelingenes;屍/a^S".47:95-102(1986));y-玉米醇溶蛋白；waxy(Kloesgen,R.B.,Gierl,A.,Schwarz-Sommer,Z.S.和Saedler，H.，MolecularanalysisofthewaxylocusofZeamays,M/.G飢203:237-244(1986));shrunken1;shrunken2(Shaw等人，PlantPhys98:1214-1216,1992;ZhongChen等人，PNASUSA100:3525-3530，2003);球蛋白1;mZE40-2,也稱為Zm-40,美國專利6,403,862;ltp2啟動子(Kalla，等人，PlantJournal6:849-860(1994);美國專利號5,525,716)、ciml啟動子(參見美國專利號6,225,529);nuclc(美國專利號6,407,315);等。還參見WO00/12733和美國專利號6,528,704,其中公開了來自endl和end2基因的種子優選的啟動子。另外的胚特異性啟動子公開於Sato等人(1996淑/.Xo^.S":93:8117-8122(稻同源異形框,OSH1);和Postma-Haarsma等人(1999)屍/"WA/o/.Ao/.39:257-71(稻KNOX基因)中。另外的胚乳特異性啟動子公開於Albani等人(1984)EMSO3:1405-15;Albani等人(1999)77^^.^//.Gew.98:1253-62;Albani等人(1993)屍/a"f丄4:343-55;Mena等人(1998)77^屍/a"fJowr"a/116:53-62(大麥DOF);Opsahl-Ferstad等人(1997)屍/a打f/12:235-46(玉蜀黍Esr);和Wu等人(1998)屍/"WCe〃屍/z",o/ogy39:885-889(稻GluA-3、GluB-l、NRP33、RAG國1)中。組成型啟動子的例子包括根癌土壤桿菌(Jgra&"e"ww化me/aciera)的l'-或2'-啟動子(參見例如O'Grady(1995)屍/，fMo/.仏o/.29:99-108)。其他植物啟動子包括核酮糖-l,3-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、菜豆蛋白啟動子、醇脫氫酶(Adh)基因啟動子(參見例如，Millar(1996)屍/"",Mo/.所o/.31:897-904)、蔗糖合酶啟動子、a-微管蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子，例如鼠耳芥屬(爿ra6/t/q/^&)肌動蛋白基因啟動子(參見例如，Huang(1997)屍/朋fA/o/'Ao/.199733:125-139)、cab、PEPCase、R基因複合體、來自鼠耳芥屬的ACT11(Huang等人屍/a^M/.腸/.33:125-139(1996))、來自鼠耳芥屬的Cat3(Zhong等人，M/.Ge".251:196-203(1996))、編碼來自歐洲油菜(5薩&a""/M)的硬脂醯-醯基載體蛋白質去飽和酶的基因(Solocombe等人(1994)屍/"W屍/z"zo/.104:1167-1176)、來自玉蜀黍的GPcl(Martinez等人(1989)丄Mo/.S/o/208:551-565)、來自玉蜀黍的Gpc2(Manjunath等人(1997),屍/""/Mo/.祝o/.33:97-112)、和本領域技術人員已知的來自各種植物基因的其他轉錄起始區。還參見Holtorf(1995)"Com/arz'sowo/conW"w"'ve朋dzWwcz'6/e/romofers/orAe29:637-646。還可以使用來自E8基因(參見Deikman和Fischer(1988)EA傷(9J7:3315)和其他基因的啟動子序列，連同對於單子葉物種特異的啟動子(例如,McElroyD.,等人(1994.)ForCgwe;^re^W7'o"/ra似gew/ccemarAss7>ew開的其他組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等人(1985)Atowe313:810-812);稻肌動蛋白(McElroy等人(1990)屍/贈Ce〃2:163-171);泛蛋白(Christensen等人(1989)屍/"WA^/.腸/.12:619-632和Christensen等人(1992)屍/"",AZo/.歷o/.18:675-689);pEMU(Last等人(1991)T7zeor.jp;/.81:581-588);MAS(Velten等人(1984)EiVffi(9丄3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利號5,659,026)等。此外,其他組成型啟動子包括例如，美國專利號5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5，466,785;5,399,680;5,268,463;5,608，142;和6,177,611。除本文指出的啟動子外，在植物中發揮作用的細菌起源的啟動子也可以在本發明中使用。它們包括例如章魚鹼合酶啟動子、胭脂鹼合酶啟動子和衍生自Ti質粒的其他啟動子。參見，Herrera-Estrella等人(1983)Atowre303:209。還可以使用病毒啟動子。病毒啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19SRNA啟動子。參見，Odell等人,(1985)淑群313:810;和Dagless(1997)爿rc/z.142:183-191。來自感染植物的病毒的組成型啟動子的其他例子包括菸草花葉病毒的啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子或玄參花葉病毒的啟動子，例如玄參花葉病毒35S啟動子(參見例如，Maiti(1997)7Va似gem'c6:143-156)等。可替代地，具有有用特徵的新啟動子可以通過本領域已知的方法包括序列分析、增強子或啟動子捕獲等由任何病毒、細菌或植物來源進行鑑定。組織優選的(組織特異性)啟動子和增強子可以用於在特定植物組織內耙向增強的基因表達。組織優選的(組織特異性)啟動子包括例如，下述參考文獻中描述的那些Yamamoto等人(1997)屍/a"f丄12(2):255-265;Kawamata等人(1997)Ce〃屍—。/.38(7):792-803;Hansen等人(1997)A/o/.254(3):337-343;Russell等人(1997)raragem'c/化6(2):157-168;Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341;VanCamp等人(1996)屍/屍/z，,》/.112(2):525-535;Canevascini等人(1996)屍/a"f屍/z;wo/.112(2):513-524;Yamamoto等人(1994)屍/虛0〃屍—o/.35(5):773-778;Lam(1994)7ew/"屍ra6/.CW/20:181-196;Orozco等人(1993)屍/鼎f編腸/.23(6):1129-1138;Matsuoka等人(1993)屍rac淑/.爿c^/.V&490(20):9586-9590;和Guevara-Garcia等人(1993)屍/朋/丄4(3):495-505。若需要，此種啟動子可以進行修飾，以用於更弱的表達或更強的表達。組織特異性啟動子可以驅動可操作地連接的序列在除耙組織外的組織中表達。因此，如本文所^吏用的，組織特異性啟動子是驅動優先在靶組織中的表達，但也可以導致在其他組織中的一定表達的啟動子。在某些實施方案中，可以使用葉特異性啟動子，例如來自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸、正磷酸二激酶(PPDK)啟動子，來自玉蜀黍的cab-mlCa+2啟動子,鼠耳芥(Jraht/o/w^)myb相關基因啟動子(Atmyb5)，核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子(例如，番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因，其可以在葉和光生長的幼苗中表達，而RBCS1和RBCS2在發育中的番茄果實中表達，和/或核酮糖二磷酸羧化酶啟動子，其幾乎專一地在葉片和葉鞘中在葉肉細胞中以高水平表達等)等。參見伊H口,Matsuoka等人,(1993)77^we-s/e"yi'c//g/^-regw/a/ede義/re^/o"J/h"M。,力aC3//^^，nc。屍M4SV&490(20):9586-90;(2000)屍/a"fCe〃屍/z"z'o/.41(1):42-48;(2001)屍/a"fA/o/.45(1):1-15;Shiina，T.等人,(1997)/c/ew〃/z'ca/v'o"0//Vcwz0/er￡7ewe"&/wvo/ve<i,力f/zecj^oso/z'cCa+2mec^.a"c/0/ma/zecaZ陽mle;c戸肌朋，屍/爐屍—o/.115:477-483;Casal(1998)屍/耐屍—o/.116:1533-1538;Li(1996)FEBSLett.379:117-121;Busk(1997)屍/a"f丄11:1285-1295;和Meier(1997)415:91-95;和Matsuoka(1994)屍/"W,/.6:311-319。其他葉特異性啟動子包括，例如，Yamamoto等人(1997)屍/朋fJ.12(2):255-265;Kwon等人(1994)屍/朋/屍/z"io/.105:357-67;Yamamoto等人(1994)屍/a^Ce〃屍/^,'o/.35(5):773-778;Gotor等人(1993)屍/慮J.3:509-18;Orozco等人(1993腸/.23(6):1129-1138;和Matsuoka等人(1993)yVa".^c^/.90(20):9586-9590。在某些實施方案中，可以使用衰老特異性啟動子(例如，在果實成熟、葉衰老和脫落過程中有活性的番茄啟動子，編碼半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍啟動子，等)。參見例如，Blume(1997)屍to12:731-746;Griffiths等人，(1997)Sewew"力g,e;c/7resW0wRFLPwa///"go^yzaz'wgammatmc/wceem")。這些基因的啟動子與|3-葡糖醛酸糖苷酶報導基因連接，並且引入非豆科植物菸草(Mco"a朋to6flcwm)的和豆科植物百脈根(丄0/MCW77/CW/"/M)內，並且在2種情況下，根特異性啟動子活性得到保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們的髮根土壤桿菌(^gra^"enwmr/zz'zogewes)的高度表達的rolC和rolD根i秀導基因的啟動子分析(參見屍/"WScw"ce(Limerick)79(1):69-76)。他們得出如下結論，增強子和組織優選的DNA決定子在這些啟動子中解離。Teeri等人(1989)使用與lacZ的基因融合，以顯示編碼章魚鹼合酶的土壤桿菌屬T-DNA基因在根尖的表皮中尤其有活性，並且TR2'基因在完整植物中是根特異性的，並且受葉組織中的創傷刺激(參見例如，￡7Uffi(9J.8(2):343-350)。與叩tll(新黴素磷酸轉移酶II)融合的TRl'基因顯示相似特徵。另外的根優選的啟動子包括VffiNOD-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995)Afo/.5z'o/.29(4):759-772);和ro舊啟動子(Capana等人(1994)屍/"",A/o/.25(4):681-691。還參見，美國專利號5,837,876;5,750,386;5,633,363;5,459,252;5,401,836;5,110,732;和5,023,179。本發明也預期時間作用的啟動子的使用。例如，可以選擇在授粉後0-25天(DAP)、4-21、4-12或8-12DAP發揮作用的啟動子，例如啟動子，例如ciml和ltp2。還可以使用在授粉後0-14天發揮作用的啟動子，例如SAG12(參見WO96/29858,RichardM.Amasino,published3Oct.1996)和ZAG1或ZAG2(參見R.J.Schmidt,等人，A^"〃力ca"'o"朋dv4ra&卻^F/ora/Z/麵eWcG匿Plant-Cell5(7):729-37(l"!3年7月))。其他有用的啟動子包括玉蜀黍zag2.1,Zap(也稱為ZmMADS;美國專利申請系列號10/387,937;WO03/078590);和玉蜀黍tbl啟動子(還參見Hubbarda等人，Genetics162:1927-1935,2002)。枝條優選的啟動子包括，枝條分生組織優選的啟動子，例如Weigal等人(1992)Ce〃69:853-859;登記號AJ131822;登記號Z71981;登記號AF059870中公開的啟動子、ZAP啟動子(美國專利申請系列號10/387,937)、玉蜀黍啟動子(Wang等人(1999)Atowe398:236-239、和McAvoy等人(2003)爿cmOS7/S)625:379-385中公開的枝條優選的啟動子。誘導型啟動子是響應誘導物能夠直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因轉錄的啟動子。在不存在誘導物的情況下，DNA序列或基因將不轉錄，或將以低於誘導狀態的水平轉錄。誘導物可以是化學試劑，例如代謝物、生長調節物、除草劑或酚類化合物，或直接強加於植物的生理應激，例如冷、乾旱、熱、鹽、毒素。可以使用在暴露於植物激素例如生長素後可誘導的植物啟動子。例如，本發明可以使用來自大豆(大豆(GlycinemaxL.))的生長素應答元件El啟動子子序列(AuxREs)(Liu(1997)PlantPhysiol.115:397-407);生長素應答性鼠耳芥屬GST6啟動子(也響應水楊酸和過氧化氫)(Chen(1996)PlantJ.10:955-966);來自菸草的生長素誘導型parC啟動子；植物生物素應答元件(Streit(1997)Mol.PlantMicrobeInteract.10:933-937);和響應應激激素脫落酸的啟動子(Sheen(1996)Science274:1900-1902)。在暴露於可以應用於植物的化學試劑例如除草劑或抗生素後可誘導的植物啟動子也可以用於表達多核苷酸。啟動子可以是化學製品誘導型啟動子，其中化學製品的應用誘導基因表達，或化學製品阻遏型啟動子，其中化學製品的應用阻遏基因表達。例如，可以使用由苯磺醯胺除草劑安全劑激活的玉蜀黍In2-2啟動子(DeVeyldeK1997)PlantCellPhysiol.38:568-577);不同除草劑安全劑的應用誘導不同的基因表達模式，包括在根、排水器和莖端分生組織中的表達。ACC合酶編碼序列或RNA構型也可以在例如四環素誘導型和四環素阻遏型啟動子的控制下(參見例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237;美國專利號5,814,618和5,789,156;和Masgmu(1997)PlantJ.11:465-473(描述包含燕麥(AvenasativaL.)(燕麥)精氨酸脫羧酶基因與四環素誘導型啟動子的轉基因菸草植物)；或水楊酸應答元件(Stange(1997)PlantJ.11:1315-1324。其他化學製品誘導型啟動子是本領域已知的，並且包括但不限於，玉蜀黍GST啟動子，其通過用作突出物前(pre-emergent)除草劑的疏水親電子化合物激活，和菸草PR-la啟動子，其由水楊酸激活。感興趣的其他化學製品調節的啟動子包括類固醇應答啟動子(參見例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425和McNellis等人(1998)PlantJ.14(2):247-257中的糖皮質激素誘導型啟動子)。誘導型調節元件的例子包括金屬硫蛋白調節元件、銅誘導型調節元件、或四環素誘導型調節元件，來自其的轉錄可以分別響應二價金屬離子、銅或四環素而實現(Furst等人，Cell55:705-717,1988;Mett等人，Proc.Nati.Acad.Sci.,USA90:4567-4571,1993;Gatz等人,Plant丄2:397-404,1992;Roder等人，Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994)。誘導型調節元件還包括蛻皮激素調節元件或糖皮質激素調節元件，來自其的轉錄可以響應蛻皮激素或其他類固醇而實現(Christ叩herson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA89:6314-6318,1992;Schena等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA88:10421-10425，1991;美國專利號6，504,082);冷響應調節元件或熱激調節元件，其的轉錄可以分別響應暴露於冷或熱而實現(Takahashi等人，PlantPhysiol.99:383-390,1992);可通過缺氧情況誘導的醇脫氫酶基因的啟動子(Gerlach等人，PNASUSA79:2981-2985(1982);Walker等人，PNAS84(19):6624-6628(1987));以及衍生自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光誘導型啟動子(Yamamoto等人(1997)PlantJ.12(2):255-265);光誘導型調節元件(Feinba腿等人，Mol.Gen.Genet.226:449,1991;Lam和Chua,Science248:471,1990;Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590;Orozco等人(1993)PlantMol.Bio.23(6):1129-1138)，植物激素誘導型調節元件(Yamaguchi-Shinozaki等人，PlantMol.Biol.15:905,1990;Kares等人，PlantMol.Biol.15:225,1990)等。誘導型調節元件還可以是玉蜀黍In2-1或In2-2基因的啟動子，其響應笨磺醯胺除草劑安全劑(Hershey等人，Mol.Gen.Gene227:229-237,1991;Gatz等人，Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994),和轉座子TnlO的Tet阻遏物(Gatz等人，Mol.Gen.Genet.227:229-237,1991)。應激誘導型啟動子包括鹽/水應激誘導型啟動子，例如P5CS(Zang等人(1997)PlantSciences129:81-89);冷誘導型啟動子，例如corl5a(Hajela等人(1990)PlantPhysiol.93:1246-1252)、corl5b(Wlihelm等人(1993)PlantMolBiol23:1073-1077)、wscl20(Ouellet等人(1998)FEBSLett.423-324-328)、ci7(Kirch等人(1997)PlantMolBiol.33:897-909)、ci21A(Schneider等人(1997)PlantPhysiol.113:335-45);乾旱誘導型啟動子，例如Trg-31(Chaudhary等人(1996)PlantMol.Biol.30:1247-57)、rd29(Kasuga等人(1999)NatureBiotechnology18:287-291);滲透誘導型啟動子，例如Rabl7(Vilardell等人(1991)PlantMol.Biol.17:985-93)和滲透蛋白(Raghothama等人(1993)PlantMolBiol23:1117-28);以及熱誘導型啟動子，例如熱激蛋白(Barros等人(1992)PlantMol.19:665-75;Marrs等人(1993)Dev.Genet.14:2741)、smHSP(Waters等人(1996)J.ExperimentalBotany47:325-338)、和來自歐芽泛蛋白啟動子的熱激誘導型元件(WO03/102198)。其他應激誘導型啟動子包括rip2(美國專利號5,332,808和美國公開號2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等人(1993)Mol.Gen.Genetics236:331-340)。某些啟動子可通過創傷誘導，包括土壤桿菌屬pmas啟動子(Guevara-Garda等人(1993)PlantJ.4(3):495-505)和土壤桿菌屬ORF13啟動子(Hansen等人，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。的、在植物中起作用的轉錄和翻譯終止區。終止區可以對於本發明的啟動子核苦酸序列是天然的，可以對於目的DNA序列是天然的，或可以衍生自另一個來源。方便的終止區可從根癌土壤桿菌的Ti質粒獲得，例如章魚鹼合酶和胭脂鹼合酶終止區。可以使用(馬鈴薯蛋白酶抑制劑)的3'末端。參見Ryan(1990)j肌Aev.屍/z,/"仇28:425-449;Duan等人(1996)NatureBiotechnology14:494-498。關於其他3'末端序列,還參見Guerineau等人(1991)M/.G飢262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon等人(1991)Dev.5:141-149;Mogen等人(1990)屍/a"CW/2:1261-1272;Munroe等人(1990)Ge"e91:151-158;Ballas等人1989)A^c/ezc尺仏17:7891-7903;Joshi等人(1987)MWe,cW仏15:9627-9639。表達盒可以另外包括5'前導序列。此種前導序列可以作用於增強翻i奪。翻譯前導區是本領域已知的，並且包括小RNA病毒前導區，例如EMCV前導區(腦心肌炎5'非編碼區),Elroy-Stein等人(1989)屍亂AtoJcat/.USA86:6126-6130;馬鈴薯Y病毒前導區，例如TEV前導區(菸草蝕紋病毒)，Allison等人(1986);MDMV前導區(玉米矮花葉病毒)，K>o/ogy154:9-20;人免疫球蛋白重鏈結合蛋白質(BiP),Macejak等人(1991)Atowe353:90-94;來自苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導區，Jobling等人(1987)A^we325:622-625);菸草花葉病毒前導區(TMV),Gallie等人(1989)Mo/ecw/ar所o/ogyq/7^A^,第237-256頁；和玉米褪綠斑駁病毒前導區(MCMV)Lommel等人(1991)F/ra/ogy81:382-385。還參見Della-Cioppa等人(1987)屍/z"/o/ogy84:965-968。該盒還可以包含增強翻譯和/或mRNA穩定性的序列，例如內含子。任何類型的轉化都可以用於獲得選擇性切除誘導系。轉化規程以及物細胞類型，即單子葉植物或雙子葉植物而變。將核苷酸序列引入植物細胞內和隨後插入植物基因組內的合適方法包括顯微注射(Crossway等人(1986)4:320-334)、電穿孑L(Riggs等人(1986)屍nc.Ato/.爿cW.Sc/.(7&483:5602-5606、土壤桿菌屬介導的轉化(Townsend等人,美國專利號5,563,055)、直接基因轉移(Paszkowski等人(1984)5M5(9丄3:2717-2722)、和衝擊粒子加速(ballisticparticleacceleration)(參見例如，Sanford等人,美國專利號4,945,050;Tomes等人(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"in屍/朋,Ce〃，7"加t/e,a"c/z"o/ogy6:923-926(大豆);Finer和McMullen(1991)/",oCe〃Dev.腸/.27P:175-182(大豆);Singh等人(1998)77z亂如/.G匿f.96:319-324(大豆)；Datta等人(1990)S,Wec/wo/ogy8:736-740(稻)；Klein等人(1988)屍n淑/.」cW."&485:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)&ofec/mo/ogy6:559-563(玉蜀黍)；Tomes,美國專利號5,240,855;Buising等人，美國專利號5,322,783和5,324,646;Tomes等人(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"in屍/朋fCe〃，r加we，am/OgawCWfwre.'Fw"(i證e齒/她？/zo(is,編輯Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉蜀黍)；Klein等人(1988)屍/^屍/z",力/.91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)S,wec/mo/ogy8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人(1984)A^wea。"cto"J311:763-764;Bowen等人，美國專利號5,736,369(穀類)；Bytebier等人(1987)屍rac.淑/.vted園84:5345-5349(百合科)；DeWet等人(1985)inZ7ze五xpen'me"to/Mm—to/ow(9vw/er^wes,編輯Chapman等人(Longman,NewYork),第197-209頁(花粉)；Kaeppler等人(1990)屍/a",Ce〃Ae/or"9:415-418和Kaeppler等人(1992)7Tz纖如/.84:560-566(頸鬚介導的轉化);D，Hallum等人(1992)屍/虛Ce〃4:1495-1505(電穿孔)；Li等人(1993)Ce〃Ae/w"12:250-255以及Christou和Ford(1995)^畫Aso/i5o,，75:407-413(稻)；Ishida等人(1996)淑匿i5她c/mo/ogy14:745-750;US5,731，179;US5,591，616;US5,641,664;和美國專利5,981,840(經由根癌土壤桿菌的玉蜀黍)；所述參考文獻的公開內容引入本文作為參考。在植物中的土壤桿菌屬轉化公開於下述參考文獻中Bechtold,N.，J.Ellis，G.Pelletier(1993)C.R.,Jcat/Sc/屍ansL,/eSc/316:1194-1199;Bechtold,N.,B.等人(2000)155:1875-1887;Bechtold,N.和G.Pelletier(1998)她AoAM/編.82:259-266;Chowrira,G.M.,V.Akella,口P.F.Lurquin(1995)A/o/.6/o&c/z"o/.3:17-23;Clough,S.J.和A.F.Bent(1998)PlantJ.16:735-743;Desfeux,C.，S.J.Clough和A.F.Bent(2000)屍/am屍—o/.123:895-904;Feldmann,K.A.和M.D.Marks(1987)M/.Gew.208:1-9;HuC,Y.和L.Wang.(1999)InVitroCellDev.Biol,Plant35:417-420;Katavic,V.G.W.Haughn，D.Reed，M.Martin,L.Kunst(1994A/o/.Gew.245:363-370;Liu,F.,等人(1998)ActaHort467:187-192;Mysore,K.S.,C.T.Kumar和S.B.Gelvm(2000)PlantJ.21:9-16;Touraev，A.，E.Stoger,V.Voronin和E.Heberle-Bors(1997)PlantJ.12:949-956;Trieu,A.T.等人(2000)屍/朋fJ.22:531-541;Ye,G.N.等人(1999)屍/aW丄19:249-257;Zhang,JU.等人(2000)CTzemAo/.7:611-621。上述的公開內容引入本文作為參考。各種類型的植物組織可以用於轉化，例如胚細力包，分生細胞，葉細胞，或衍生自胚、葉或分生細胞的愈傷組織細胞。然而，可以使用任何轉化感受態細胞或組織。還可以採用用於增加轉化頻率的各種方法。此種方法公開於WO99/61619;WO00/17364;WO00/28058;WO00/37645;美國系列號09/496,444;WO00/50614;US01/44038;和WO02/04649中。上述的公開內容引入本文作為參考。玉蜀黍的轉化可以遵循用於將DNA引入未成熟的玉蜀黍胚的盾片內的充分確定的轟擊轉化規程(參見例如，Tomes等人，DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment.第197-213頁inPlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods.編輯O.L.Gamborg和G.C.Phillips.Springer畫VerlagBerlinHeidelbergNewYork,1995.)。通過在包含N6鹽、Erikkson，s維生素、0，69g/1月甫氨酸、2mg/12,4-D和3%蔗糖的培養基上培養玉蜀黍未成熟胚(長度約.l-1.5mm)來轉化細胞。在黑暗中在28。C下溫育4-5天後，從第一種培養基中取出胚，並且在包含12%蔗糖的相似培養基上培養。在轉化前允許胚適應這種培養基3小時。使用粒子轟擊來靶向未成熟胚的盾片表面。胚使用來自Bio-Rad的PDS-1000HeHumGun以一次射擊/樣品進行轉化，其中使用650PSI破裂盤。每次射擊遞送的DNA平均為0.1667jug。轟擊後，所有胚在標準玉蜀黍培養基(N6鹽、Erikkson，s維生素、0.69g/1脯氨酸、2mg/12,4-D、3%蔗糖)上維持2-3天，然後轉移到包含選擇劑的基於N6的培養基。板在28。C下在黑暗中維持，並且就集落回收進行觀察，伴隨每2-3周轉移至新鮮培養基。回收的集落和植物基於由引入的一種或多種標記基因賦予的可選擇或可篩選的表型(即除草劑抗性、螢光或花青苷產生)，並且經由PCR和DNA印跡分析通過分子表徵進行評分。玉蜀黍的轉化還可以使用土壤桿菌屬介導的DNA遞送法來完成，如由美國專利號5,981,840描述的，伴隨下述修飾。土壤桿菌在包含lOO^M壯觀黴素的液體基本A培養基中生長至對數期。將胚浸入調整的土壤桿菌的對數期懸浮液中，以獲得5xlScfu/ml的有效濃度。胚感染5分鐘，然後在包含乙醯丁香酮的培養基上在20。C下在黑暗中共培養7天。7天後，將胚轉移至具有選擇劑的標準培養基(含N6常量營養物的MS鹽、lmg/L2,4-D、lmg/L麥草畏、20g/L蔗糖、0.6g/L葡萄糖、lmg/L硝酸銀和100mg/L羧千青黴素)。板在28。C下在黑暗中維持，並且就集落回收進行觀察，伴隨每2-3周轉移至新鮮培養基。回收的集落和植物基於由引入的一種或多種標記基因賦予的可選擇或可篩選的表型(即除草劑抗性、螢光或花青苷產生)，並且經由PCR和DNA印跡分析通過分子表徵進行評分。選擇標記可以在轉化細胞的回收中利用。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)和潮黴素磷酸轉移酶(HPT)的那些，以及賦予針對除草劑化合物的抗性的基因，所述除草劑化合物例如草銨膦(BASTATM中的活性成分)、溴苯腈、咪唑啉酮類和2,4-滴(2,4-D)。例如，編碼草甘膦N-乙醯轉移酶(GAT)的除草劑抗性多核苷酸可以與選擇劑草甘膦一起使用。參見PCT公開WO02/36782和美國申請系列號10/427,692。PAT(膦絲菌素乙醯轉移酶)多核苷酸可以用於針對膦絲菌素的抗性(DeBlock等人，1987,Engineeringherbicideresistanceinplantbyexpressionofadetoxifyingenzyme,EMSOJ.6:2513-2518)。另一個例子是關於針對咪唑啉的抗性的ALS(乙醯乳酸合酶)多核苦酸(Sathasi窗等人，1990,Nucleotidesequenceofamutantacetolactatesynthasegenefromanimidazolinone-resistan"raZn'(io戸、Aa/i朋avar,Columbia,M/c/e/d油18:2188)。另外的選擇標記包括表型標記，例如卩-半乳糖苦酶和螢光蛋白質，例如綠色螢光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Ao^c/mo/S/固gS5,610-9和Fetter等人(2004)CW/215-28),青色焚光蛋白(cyanflorescentprotein)(CYP)(Bolte等人(2004)J.Ce〃Sc,e"ce//7:943-54和Kato等人(2002)屍/朋,屍—o/汲913-42)和黃色螢光蛋白(來自Evrogen的PhiYFPTM，參見，Bolte等人(2004)丄Ce〃5"c,e"ce//7:943-54)。關於另外的選擇標記，一般參見，Yarranton(1992)Cwr.(9—.腺d3:506-511;Christopherson等人(1992)TVoc.7V^/.Sc/.U&489:6314-6318;Yao等人(1992)CW/71:63-72;Reznikoff(1992)M>/.Mcto&o/.6:2419-2422;Barkley等人(1980)in77^一腦,第177-220頁;Hu等人(1987)Ce〃48:555-566;Brown等人(1987)Ce〃49:603-612;Figge等人(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle等人(1989)屍亂淑/.^cad園86:5400-5404;Fuerst等人(1989)屍rac.AW/.86:2549-2553;Deuschle等人(1990)Sc/匿e248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Reines等人(1993)屍rac.M///.爿cat/.90:1917-1921;Labow等人(1990)編.Ce〃.腸/.10:3343-3356;Zambretti等人(1992)屍rac.Ato/.jcat/.Sc/./7&489:3952-3956;Baim等人(1991)屍roc.Ato/.爿c^/.88:5072-5076;Wyborski等人(1991)A^c/e/cy4c,Ai^s.19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7b//csA/o/.5V廠wc.S/o/.10:143-162;Degenkolb等人(1991)Jw">mcro6.C7^wo^er35:1591-1595;Kleinschnidt等人(1988)^oc/zem^^y27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Gossen等人(1992)TVoc.Ato/.爿c^/.89:5547-5551;Oliva等人(1992)爿""m,cra6.^ge""C/z^o,/zer36:913-919;Hlavka等人(1985)//a"Woc^:o/Ex/^7'me"^t/屍/zormaco/ogy,第78巻(Springer-Verlag,Berlin);Gill等人(1988)334:721-724。此種公開內容引入本文作為參考。上述選擇標記基因列表不意味著是限制性的。任何選擇標記基因都可以在本發明中使用。一旦已鑑定了單倍體胚，就可以用染色體加倍試劑處理單倍體細胞、單倍體胚、單倍體種子、單倍體幼苗或單倍體植物。通過使單倍體細胞例如單倍體胚細胞與染色體加倍試劑接觸可以由單倍體細胞再生純合植物。單倍體細胞可以在授粉時、授粉後任何時間(一般為授粉後6小時-21天、授粉後6小時-15天)、在成熟種子階段時、在幼苗階段時或在植物階段時與加倍試劑接觸。當來自花粉粒的一個精核與胚嚢中的極核融合以產生三倍體(3N)胚乳時(當形成單倍體胚時)，授粉後任何時間(一般為授粉後6小時-21天、授粉後6小時-15天)、或在成熟種子階段時，單倍體胚可以與加倍試劑接觸。可以分離單倍體胚。它可以包含在仁、胚珠或種子內。在玉米的情況下它還可以在谷穗上，或在其他穀物例如小麥的情況下在穗狀花序上。包含單倍體胚的谷穗可以在植物上或從植物中分離。谷穗還可以切開。在染色體加倍後，雙單倍體胚將包含母源獲得的染色體的2個拷貝。關於從單倍體胚獲得雙單倍體植物的過程的效率可以大於10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%或90%。染色體加倍的方法公開於Antoine-Michard,S.等人，Plantcell,tissueorgancult.,Cordrecht，theNetherlands,KluwerAcademicPublishers,1997，48(3):203-207;Kato,A.，MaizeGeneticsCooperationNewsletter1997,36-37;和Wan,Y.等人，TAG，1989,77:889-892.Wan,Y.等人,TAG,1991,81:205-211中。所述參考文獻的公開內容引入本文作為參考。一般方法涉及使細胞與秋水仙鹼、抗微管試劑或抗微管除草劑、拿草特(pronamide)、一氧化二氮或任何有絲分裂抑制劑接觸，以產生純合的雙單倍體細胞。在培養基中使用的秋水仙鹼量一般是0.01%表5通用名/商品名CASIUPAC秋水仙鹼和秋水仙鹼衍生物秋水仙i成/乙醯三曱基秋水仙酸(S)-N-(5，6,7，9-四氫-1,2,3,10-四曱氧基-9-氧代苯並(a)庚搭烯-7-基)乙醯胺秋水仙^5鹹衍生物氛基曱酸酯長殺草苯to甲酸(R)陽l陽(乙基氨基曱醯基)乙酯(2R)-N-乙基-2陽[[(苯氨基)羰基]氧]丙醯胺氯苯胺靈苯胺靈苯甲醯胺拿草特/戊炔草胺(propyzamide)3,5-二氯->^-(1,1-二曱基丙炔基)苯曱醯胺3,5-二氯-N-(U-二甲基-2-丙炔基)苯曱醯胺牧草胺(tebutam)苯甲酸敵草索(DCPA),麥草畏/麥草畏(dianat)/氯茴香酸酯(曱麥草畏)(BANVEL,CLARITY)3,6-二氯-鄰-大茴香酸3，6-二氯-2-甲氧基苯曱酸二硝基苯胺染色體加倍試劑tableseeoriginaldocumentpage31tableseeoriginaldocumentpage32染色體加倍試劑可以在各種時間與胚接觸。如果胚是分離的，那麼加倍試劑可以緊在分離後和在萌發前接觸。如果胚包含在種子內，那麼它可以在授粉後和幹透前的任何時間與加倍試劑接觸。無論胚是否是分離的，它都可以在授粉後6小時到授粉後21天之間的任何時間與加倍試劑接觸。染色體加倍試劑之間的接觸持續時間可以有變化。接觸可以為小於24小時至約1周。接觸持續時間一般為約24小時到2天。所提供的方法可以經歷或不經歷愈傷組織形成階段。單倍體胚可以置於"非愈傷組織"促進培養基上。術語"非愈傷組織促進培養基，，指不支持去分化的細胞或組織團塊增殖的培養基。優選的"非愈傷組織促進培養基"用於胚拯救，包含本領域眾所周知的一般的鹽和維生素製劑。此種胚拯救或胚培養，培養基包含很少的生長素或不包含生長素[關於綜述參見Raghaven，V.,1966.Biol.Rev.41:1-58]。胚成熟培養基還代表另一種優選的"非愈傷組織促進培養基"。胚成熟培養基用於促進體外培養胚的發育，阻止過早的萌發，並且一般包含標準鹽/維生素製劑(依賴物種)、增加的糖水平和/或外源添加的脫落酸，具有很少的生長素或無生長素。另一種類型的培養基用於枝條培養或多重枝條增殖。這種多重促進:生i:i殖和生長的細k-裂素。"'、'、生長素定義為內源植物激素，例如吲哚乙酸(IAA),IAA的衍生物，例如"引咮-3-丁酸，以及具有生長素樣活性的化合物，例如2,4-D;毒莠定；麥草畏；3,4-D;2，4,5-T和萘乙酸(NAA)。細胞分裂素定義為天然存在的植物激素，例如2-異戊烯基腺噪呤(2-isopentyneladenine)(2iP)、玉米素和二氫玉米素，或具有細胞分裂素樣活性的合成化合物，例如激動素和BAP(節氨基噪呤(beynzylaminopurine))。來自胚、種子、植物等的單倍體細胞可以通過幾種方法進行鑑定，例如通過染色體計數、測量保衛細胞的長度、或通過使用流式細胞儀。分子標記或定量PCR可以用於確定組織或植物是由雙單倍體細胞構成還是由二倍體細胞構成(通過正常授粉獲得的細胞)。通過任何上述技術獲得的單倍體胚可以進行培養，以再生全植物。此種技術稱為胚拯救。胚拯救培養基可以包含某些植物激素和能源或僅能源。生長培養基還可以包含選擇劑，例如殺生物劑和/或除草劑。這種選擇劑可以用於指示已通過轉化方法引入的標記。關於玉蜀黍的轉化和再生，參見Gordon-Kamm等人，ThePlantCell2:603-618(1990)。所提供的方法可以用任何植物進行實踐。此種植物包括但不限於玉蜀黍(Zeamfl")(也鑑定為玉米或玉蜀黍)、大豆、油料種子芸莒屬(Sra肌ca)、苜蓿、稻、黑麥、高粱、向日葵、菸草、馬鈴薯、花生、棉花、甘薯、木薯、甜菜、番茄、燕麥、大麥和小麥。胚生成植物是本領域眾所周知的。胚拯救技術可以用於使未成熟的雙單倍體胚生成植物(RecentResearchDevelopmentsinGenetics&Breeding.第1巻，部分II，287-3082004)。所述參考文獻的公開內容引入本文作為參考。在其下可以執行方法的溫度可以有變化。所提供的方法可以在不殺死植物細胞或植物的任何溫度下，或在約16攝氏度到32攝氏度下進行實踐。提供了對於玉蜀黍植物產生單倍體胚和不能生活的二倍體胚的方法。該方法包括但不限於產生約3%或更多、約5%或更多、或約10%或更多的存活單倍體胚。為了計算百分比，通過將單倍體胚數目與未正確發育的胚數目相加來確定胚總數目。不能生活的二倍體胚可以針對授粉後任何時間進行選擇。該方法包括但不限於在7-15天、10-21天時，或在單倍體種子完全成熟時例如在幹透過程中或幹透後選擇。提供了通過用來自誘導玉蜀黍系的花粉給玉蜀黍谷穗授粉就單倍體玉蜀黍胚進行選擇的方法。誘導系具有在胚中表達且可以是致死的基因。在基因組中的另一個位置處，誘導玉蜀黍系具有阻止花粉傳播的基因。阻止花粉傳播的基因與這樣的基因緊密連鎖，所述基因當在胚中表達時，抑制第一個位置處的基因的致死性。因此，當玉蜀黍谷穗由這種誘導系授粉時，不存在包含這樣的基因的花粉的傳播，所述基因阻止致死基因的致死效應。僅具有對於胚發育致死的基因的花粉傳播。當使用這種花粉且正常受精發生從而導致二倍體胚時，由於致死基因的傳遞，胚將不發育。當使用這種花粉且不規則受精發生時，這導致單倍體胚。這種單倍體胚將繼續發育。由於二倍體胚的切除，在發育早期階段時將容易地選擇單倍體胚。在基因組的不同位置處具有致死基因和抑制劑基因，例如具有未連鎖的基因，允許基因分離，從而使得產生足夠量的包含致死基因的花粉。阻止花粉傳播的基因與抑制胚切除的基因緊密連鎖或鄰近。提供的另一種方法是稱為選擇性切除誘導系的改良誘導系的開發。玉蜀黍誘導系可以用2個不同的表達盒進行轉化。第一個表達盒包括這樣的多核普酸，當所述多核苦酸在胚中表達時，對於胚是致死的或阻止胚正常發育。第二個表達盒包括阻止存活或可傳播花粉發育的多核苷酸，和當在胚中表達時，阻止死亡或異常生長的多核苷酸，所述死亡或異常生長可由在第一個表達盒上的多核苷酸引起。轉化過程可以通過各種方法，例如粒子轟擊或土壤桿菌屬感染。用2個盒的轉化過程可以同畔或順次進行，其中包含阻止胚致死性的多核苷酸的盒首先漸滲入植物細胞內。表達盒需要在配子中分離，因此優選2個表達盒不緊密連鎖。作為該方法的部分，任何玉蜀黍系都可以用第一個、或第一個和第二個34表達盒進行轉化。第一個和/或笫二個表達盒可以用於轉化一種或兩種玉蜀黍植物。表達盒隨後可以通過雜交同時或順次轉移到玉蜀黍誘導系內。該方法可以包括使一種或所有轉基因回交到玉蜀黍誘導系內。阻遏物可以一皮替換且分離出去。在所公開的任何方法中，所描述的抑制可以通過各種機制。例如，致死多核苷酸的轉錄可以被阻止。這種類型的抑制可以通過使用tet阻遏物多核苷酸來達到，所述多核苷酸表達與致死基因結合且抑制表達的蛋白質。其他類型的致死性阻止可以在RNA或蛋白質階^a時，例如反義RNA、髮夾和用於基因沉默的其他機制。在任何這些方法和產物中，阻止花粉傳播的基因可以是具有花粉特異性啟動子的致死基因。例如基因可以表達a-澱並分酶(GeneBankL25805),PlantPhysiology105(2):759-760(1994)),並且它可以用PG47啟動子加以控制(美國專利5,412,085;美國專利5,545,546;PlantJ.3(2):261-271(1993))。在任何這些方法和產物中，引起切除的多核苷酸和抑制切除的多核苷酸的表達可以通過各種類型的啟動子加以控制。例如啟動子可以是組成型啟動子、誘導型啟動子、或組織優選的啟動子，例如胚優選的啟動子。如果驅動引起胚切除的多核苷酸的啟動子不在胚乳中表達，那麼這將是最有效的。或如果啟動子在胚乳中表達，那麼表達將足夠低，從而使得人們仍可以確定二倍體種子(正常受精)和單倍體種子之間的生長中的差異。胚優選的啟動子的例子是lecl。本發明包括如所述的包含2個表達盒的玉蜀黍誘導系。本說明書中提及的所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，其程度與每個個別出版物或專利申請特別且個別指出引入作為參考相同。提供下述實施例用於舉例說明而不是限制。實施例編碼草甘膦N-乙醯轉移酶(GAT)的基因。參見PCT公開WO02/36782和美國申請系列號10/427,692。/ecl-指示多葉子葉1轉錄激活因子多核苷酸。參見美國專利申請09/435,054。lecl啟動子在美國專利7,122,658中表徵。脂d是編碼祝孑包漆斑菌(A^ro/7ze"'畫wrwc'")氛腈水合酶蛋白質[CAH]的玉蜀黍最優化的基因，所述蛋白質可以使氨腈水合成無毒的尿素。-指示馬鈴薯蛋白酶抑制劑。參見Ryan(1990)爿朋."ev.屍一，仇28:425-449;D腿等人(1996)NatureBiotechnology14:494-498。Pro-指示啟動子序列。Term-指示終止序列。UbiPro-指示泛蛋白啟動子。參見Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)Ubi1ZMPro-指示泛蛋白玉蜀黍啟動子。實施例1:種植來自單倍體誘導系例如Stock6、RWS、KEMS、KMS或ZMS的種子，並且在開花時進行自花傳粉或近緣授粉。谷穗在30%Clorox漂白劑加0.5%Micro去汙劑中表面滅菌20分鐘，並且用無菌水漂洗2次。對於土壤桿菌屬介導的玉蜀黍轉化，利用基本上如美國專利號5,981,840中所述的Zhao的方法，所述專利的內容在此引入作為參考。從玉蜀黍植物中分離胚(一般在授粉後約7-14天)，並且使胚與土壤桿菌屬的懸浮液接觸，其中細菌能夠將目的核普酸序列轉移給至少一個胚的至少一個細胞。土壤桿菌屬包含下述表達盒。構建體C:ZM-lecl啟動子:UBlZMintron:芽孢桿菌RNA酶抑制劑pinll3，終止子—ZM-PG47啟動子ZM-BT1轉運肽ZM-a-澱粉酶1:ZM-IN2-13，終止子—UB1ZM啟動子5'UTR內含子GAT:PINII3，終止子。在這個步驟中，胚一般浸入土壤桿菌屬懸浮液中用於起始接種。優選地，土壤桿菌屬懸浮液包含100)LiM乙醯丁香酮。胚與土i裡桿菌屬共培養一段時間。一般地胚在感染步驟後在固體培養基上進行培養。在這個共培養時間段後，預期持續6-7天的任選的"靜止"步驟。在這個靜止步驟中，胚在已知抑制土壤桿菌屬生長的至少一種抗生素的存在下進行溫育，無需添關於植物轉化體的選擇劑。接下來，接種胚在包含關於GAT的選擇劑的固體培養基上進行培養，所述選擇劑是除草劑草甘膦(04r-編碼草甘膦N-乙醯轉移酶(GAT)的基因。參見PCT公開WO02/36782和美國申請系列號10/427,692)。放置在選擇培養基上後，生長中的轉化的愈傷組織用第二個盒——構建體D進行轉化。這次使用粒子轟擊。構建體D:ZM-lecl啟動子馬鈴薯LS內含子芽孢桿菌RNA酶pinll3，終止子--UBIZM啟動子5，UTR內含子moPAT:PIMI3，終止子。使用如下的CaC12沉澱程序將這種質粒DNA沉澱到1.1jum(平均直徑)鵠沉澱上100在水中製備的鴒粒、在TrisEDTA緩沖液中的10jul(1jug)DNA(總共1fxg)、100jul2.5MCaCl2、10jal0.1M亞灃奇胺。將每種試劑順次加入鴒粒懸浮液中，同時維持在多管渦旋器(vortexer)上。最後的混合物進行短暫超聲處理，並且允許在恆定渦旋下溫育10分鐘。在沉澱時間段後，管進行短暫離心，取出液體，用500^1100%乙醇洗滌，並且離心30秒。再次取出液體，並且將105|ul100%乙醇加入最終的鴒粒沉澱中。對於粒子槍轟擊，鴒/DNA顆粒進行短暫超聲處理，並且將10pl點樣到每個巨載體的中心上，並且在轟擊前允許乾燥約2分鐘。樣品板在水平#4下在粒子槍存HE34-1或弁HE34-2中進行轟擊。所有樣品接受以650PSI的單次射擊，使用取自每管制備的粒子/DNA的總共10個等分試樣。轟擊後，使愈傷組織在560Y培養基上維持2天，然後轉移至包含關於PAT基因的選擇劑雙丙氨醯膦(bialophos)的選擇培養基，並且每2周進行傳代培養。選擇約10周後，將選擇抗性愈傷組織克隆轉移至再生培養基以起始植物。體細胞胚成熟(2-4周)後，將發育良好的體細胞胚轉移至用於萌發的培養基，並且轉移至照亮的培養室。約7-10天後，將發育中的小植物轉移至在管中的無激素培養基7-10天，直至小植物良好確立。隨後將植物轉移至在包含盆栽土壤的平地中的嵌入物(等於2.5"罐)，並且在生長室中生長l周，然後在溫室中生長另外1-2周，然後轉移至常規600罐(1.6加侖)，並且生長至成熟。植物就目的基因型和/或表型進行監控且評分。轟擊培養基包含4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸疏胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D和2.88g/1L-脯氨酸(在用KOH調整至pH5.8後用D-IH20達到體積)；2.0g/1Gelrite(在用D-IH20達到體積後加入)；和8.5mg/1硝酸銀(在使培養基滅菌且冷卻至室溫後加入)。選擇培養基(560R)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(在用KOH調整至pH5.8後用D-IH20達到體積)；3.0g/1Gelrite(在用D-IH20達到體積後加入)；和0.85mg/1硝酸銀和選擇劑(兩者在使培養基滅菌且冷卻至室溫後加入)。實施例2:單倍體胚的產生在切除後，如實施例1中所示產生單倍體誘導系。誘導系可以用於產生單倍體胚。這可以通過F1玉米種子的生長來達到。例如，希望產生具有來自良種近交系A和良種近交系B的最佳特徵的優良近交的玉米育種者使2個近交雜交，以形成F1雜交種子。這種Fl種子連同切除誘導系一起生長。種植的時間選擇是這樣的，使得切除誘導系的花粉在Fl雜交種子抽絲時準備就緒。Fl植物的穗絲用切除誘導系花粉進行授粉。這可以通過種植F1和誘導系的交替行以及其各種組合來達到，其中Fl或雌性植物在授粉前去雄花穗(detassel)。雜交也可以通過枝條裝袋和通過人工授粉控制授粉來完成。在種子已成熟後，可以收穫種子並且唯一存活的種子將是單倍體種子。單倍體種子隨後進行種植，並且經歷使用染色體加倍試劑例如拿草特的染色體加倍。實施例3:轉基因誘導玉蜀黍植物的轉化和再生種植Hi-II玉蜀黍種子。在授粉後9-12天時收穫谷穗，在30%Clorox漂白劑加0.5%Micro去汙劑中表面滅菌20分鐘，並且用無菌水漂洗2次。使用手術刀從谷穗中分離胚。使胚與土壤桿菌屬的懸浮液接觸，其中細菌能夠將目的核苷酸序列轉移給至少一個胚的至少一個細胞。在這個實施例中，胚用2種土壤桿菌進行共轉化。38一種土壤桿菌包含下述表達盒。構建體E:ZM-lecl啟動子UB1ZM內含子芽孢桿菌RNA酶抑制劑pinll3，終止子—ZM-PG47啟動子ZM-BT1轉運肽ZM-a-澱粉酶1:ZM-IN2-13'終止子一UB1ZM啟動子5'UTR內含子GAT:PINII3，終止子。第二種土壤桿菌包含下述表達盒。構建體F:ZM-lecl啟動子馬鈴薯LS內含子芽孢桿菌RNA酶.'pinll3，終止子—UB1ZM啟動子5'UTR內含子moPAT:PINII3，終止子。芽孢桿菌RNA酶基因包括用於阻止芽孢桿菌RNA酶在土壤桿菌屬中表達的目的的內含子。組織培養基和方法與上文描述的相同，使用選擇劑雙丙氨醯膦。僅包含構建體E的愈傷組織將使用雙丙氨醯膦針對其進行選擇。僅包含構建體F的愈傷組織將不再生，因為芽孢桿菌RNA酶抑制劑構建體無法阻止芽孢桿菌RNA酶的毒性。包含構建體E和F的植物將再生。這些植物將用於使2種構建體回交到玉蜀黍單倍體誘導系內。在回交過程中，共轉化的系將進行評估，以確定構建體之間的連鎖。構建體連鎖得越緊密，芽孢桿菌RNA酶多核苷酸通過花粉的傳遞將越不可能發生，因為它將與在花粉中表達的a-澱粉酶多核苷酸分離，從而使得花粉不能生活。當用未連鎖的構建體進行雜交時，二倍體胚被消除，因為含芽孢桿菌RNA酶抑制劑的構建體不通過花粉傳遞，並且它們僅遺傳芽孢桿菌RNA酶。芽孢桿菌RNA酶抑制劑和芽孢桿菌RNA酶都在早期胚發生中在分離的、未連鎖的轉基因上在單倍體誘導系中表達。因此，單倍體誘導系可以得到維持。實施例4:使用包含2種T-DNA構建體的土壤桿菌屬的轉基因誘導玉蜀黍植物的轉化和再生。一種土壤桿菌包含下述2種表達盒。RB:ZM-lecl啟動子UB1ZM內含子芽孢桿菌RNA酶抑制劑pinll3，終止子—ZM-PG47啟動子ZM-BT1轉運肽ZM-a-澱粉酶1:ZM-IN2-13，終止子一UB1ZM啟動子5，UTR內含子GAT:PINII3，終止子LBRB:ZM-lecl啟動子馬鈴薯LS內含子芽孢桿菌RNA酶pinll3'終止子—UB1ZM啟動子5，UTR內含子moPAT:PINII3，終止子用包含盒的土壤桿菌屬的轉化可以增加產生穩定轉化的植物的效率，所述植物包含在基因組中未連鎖的位置處的2個盒(M川er等人TransgenicResearch11:381-396,2002.Highefficiencytransgenesegregationinco-transformedmaizeplantsusingan爿gn96a"en'wmf畫e/ac,'e朋2T-DNAbinarysystem.)除載體外，獲得玉蜀黍切除單倍體誘導系的方法可以與實施例3中所示相同。權利要求1.一種就單倍體胚進行選擇的方法，其包括a)用來自玉蜀黍單倍體誘導系的花粉給第一種玉蜀黍植物授粉，以產生胚，其中所述玉蜀黍單倍體誘導系包含胚表達的致死多核苷酸、非傳播花粉多核苷酸、和阻止所述胚表達的致死多核苷酸的致死性的胚表達的抑制劑多核苷酸；b)產生單倍體胚和不能生活的二倍體胚；和c)選擇單倍體玉蜀黍胚。2.權利要求1的方法，其中所述胚表達的致死多核苷酸是芽孢桿菌RNA酶，且所述胚表達的抑制劑多核普酸是芽孢桿菌RNA酶抑制劑。3.權利要求1的方法，其中所述胚表達的抑制劑多核苷酸抑制所述胚表達的致死多核苷酸的轉錄。4.權利要求3的方法，其中所述胚表達的抑制劑基因是tet阻遏物多核苷酸，且所述胚表達的致死多核普酸具有所述tet阻遏物與之結合的啟動子。5.—種開發轉化的玉蜀黍單倍體誘導系的方法，其包括下述步驟a)通過用第一個和第二個表達盒轉化來自玉蜀黍誘導系的細胞而獲得轉化的細胞，其中所述第一個表達盒包含胚表達的致死多核苷酸，且其中所述第二個表達盒包含非傳播花粉多核普酸和阻止所述胚表達的致死多核苷酸的致死性的胚表達的抑制劑多核普酸；b)由所述轉化的細胞再生轉化的植物；c)使所述轉化的植物自交，以獲得轉化的玉蜀黍單倍體誘導系。6.權利要求5的玉蜀黍單倍體誘導系。7.—種轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其包含第一個和第二個表達盒，其中所述第一個表達盒包含對於胚致死的多核苷酸，且其中所述第二個表達盒不通過花粉傳遞，且包含抑制對於胚致死的所述多核苷酸的致死性的多核苷酸。8.權利要求7的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中對於胚致死的所述多核苷酸是芽孢桿菌RNA酶多核苷酸，且抑制對於胚致死的所述多核苷酸的致死性的所述多核苷酸是芽孢桿菌RNA酶抑制劑多核苦酸。9.權利要求7的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中對於胚致死的所述多核苷酸包含lecl啟動子。10.權利要求7的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中所述第二個盒包含抑制花粉傳播的a-澱粉酶多核苷酸。11.權利要求10的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中所述a-澱粉酶多核苷酸包含PG47啟動子。12.權利要求7的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中所述第一個表達盒包含操縱子，且所述第二個表達盒包含阻遏物多核苷酸。13.權利要求12的轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其中所述操縱子是tet操縱子，且所述阻遏物多核普酸是tet阻遏物。14.一種在植物上產生單倍體胚和不能生活的二倍體胚的方法。15.權利要求14的方法，其中在所述植物上的單倍體胚的百分比是至少3%。16.—種選擇單倍體胚的方法，其包括用誘導玉蜀黍系給玉蜀黍植物授粉，和產生單倍體胚和不能生活的二倍體胚，其中單倍體胚的選擇在包含所述胚的種子成熟時發生。17.權利要求16的方法，其中所述單倍體胚的選擇直至授粉後約21天發生。18.權利要求16的方法，其中所述單倍體胚的選擇在授粉後約7天到授粉後約15天發生。19.一種轉基因玉蜀黍單倍體誘導系，其包含第一個和第二個表達盒，其中；所述第一個表達盒包含芽孢桿菌RNA酶多核苦酸，其與lecl啟動子可操作地連接且對於胚是致死的，且其中；所述笫二個表達盒包含芽孢桿菌RNA酶抑制劑多核苷酸，其抑制對於胚致死的所述多核苷酸的致死性，且其中，所述第二個表達盒還包含與PG47啟動子可操作地連接的a-澱粉酶多核苷酸，其中與PG47啟動子可操作地連接的所述a-澱粉酶多核苷酸的表達不允許花粉傳播。專利摘要公開了選擇單倍體胚的方法。提供了在植物上產生單倍體胚和不能生活的二倍體胚的方法。提供了用於選擇由單倍體誘導玉蜀黍系產生的單倍體胚的方法。公開了用於產生改良的玉蜀黍單倍體誘導系的方法。公開了包含引起切除或異常的二倍體胚的轉基因的玉蜀黍單倍體誘導系。文檔編號C12N15/82GKCN101652481SQ200880010908公開日2010年2月17日申請日期2008年1月31日發明者M·E·威廉斯,W·J·戈登一卡姆申請人:先鋒高級育種國際公司;納幕爾杜邦公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan